线粒体分裂蛋白抑制剂对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用

线粒体分裂蛋白抑制剂对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护
作用
张倩;张宏伟;夏建华;连亚军;谢南昌
【摘要】目的：研究线粒体分裂蛋白抑制剂（Mdivi-1）对匹鲁卡品（PILO）致痫大鼠海马神经元的保护作用及其机制。

方法：121只雄性SD大鼠随机分成对照（ CON）组、PILO组、PILO＋DMSO组和PILO＋Mdivi-1组，PILO组又分为癫痫持续状态（ SE）2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组。

观察各组大鼠行为学改变，并分别采用Nissl染色法检测神经元损伤，比色法检测SOD活力及MDA含量，Western blot和RT-PCR法检测Drp1、细胞色素C（ Cyt C）、凋亡诱导因子（AIF）和cleaved-半胱天冬酶3（caspase-3）表达水平。

结果：与PILO组（114．571±5．420）相比，PILO＋Mdivi-1组海马神经元数目增加[（157．429±6．183）；F ＝68．693，P ＜0．001]。

与 PILO 组 SE 24 h 亚组[（113．429±4．980），（6．102±0．193）]相比，PILO＋Mdivi-1组SOD活力增加[（138．571±3．380）；F＝21．779，P＜0．001]， MDA含量减少[（4．353±0．231）；F＝27．226，P＜0．001]。

与PILO组[（0．594±0．020），（1．099±0．015）]相比， PILO＋Mdivi-1组线粒体Cyt C 增加[（0．897±0．015）；F＝296．177，P＜0．001]，细胞质Cyt C 减少[（0．433±0．010）；F＝562．684，P＜0．001]。

与PILO组[（0．878±0．037），（1．465±0．076）]相比，PILO＋Mdivi-1组线粒体AIF增加[（1．279±0．051）；F＝59．298，P＜0．001]，细胞核AIF减少[（0．896±0．044）；F＝46．424，P＜0．001]。

与PILO组
（0．587±0．192）相比，PILO ＋Mdivi-1组 cleaved caspase-3减少[（0．463±0．022）；F ＝40．500，P ＜0．001]。

结论：Mdivi-1对癫痫大
鼠海马神经元有保护作用，其机制可能与降低氧化应激，抑制Cyt C释放、AIF移位及caspase-3激活有关。

%Absrtact Aim:To investigate the effect of mitochondrial division inhibitor ( Mdivi1-) in pilocarpine-induced seizures and its mechanism .Methods:A total of 121 male SD rats were randomly divided into control , PILO,PILO+Mdivi-1 and PILO+DMSO group, the PILO group was further divided into four subgroups according to observation time .The behavior changes of each group were observed , while the pathological damage and levels of superoxide dismutase and malondialde-hyde were detected by Nissl staining ,xanthine oxidase and thiobarbituric acid method .The expression of dynaminr-elated protein 1,Cyt C , AIF and cleaved-caspase-3 were measured by Western blot analysis and RT-PCR.Results: Compared with PILO group (114.571 ±5.420), the surviving neuron number of PILO +Mdivi-1 group was increased [(157.429 ±
6.183);F=68.693,P<0.001].Compared with PILO SE 24 h subgroup [(113.429 ±4.980),(6.102 ±0.193)],the activity of SOD[(138.571
±3.380);F=21 .779,P<0.001]was increased and the content of MDA (4.353 ±0.231);F=27.226,P<0.001]was decreased in PILO+Mdivi-1
pared with PILO group[(0.594 ±0.020),(1.099 ± 0.015)], the expression of mito-Cyt C[(0.897 ±0.015);F=296.177,P<0.001]was increased and the expression of cyto-Cyt C[(0.433 ±0.010);F=562.684,P<0.001] was decreased in PILO +Mdivi-1 pared with PILO group[(0.878
±0.037),(1.465 ±0.076)], the expression of mito-AIF[(1.279
±0.051);F=59.298,P<0.001]was increased and the expression of nu-
AIF[(0.896 ±0.044);F =46.424,P <0.001] was decreased in PILO +Mdivi-1
pared with PILO group (0.587 ±0.192), the expression of cleaved caspase-3[(0.463 ±0.022);F=40.500, P<0.001]was decreased of PILO +Mdivi-1 group.Conclusion:Mdivi-1 has neuroprotective effect on hippocampal neuro in pilocarpine-induced seizures , and the underlying mechanism may be due to the suppression of oxidative stress and inhibi -tion of the release of Cyt C , translocation of AIF and activation of caspase-3.
【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2014(000)006
【总页数】6页(P773-778)
【关键词】癫痫;线粒体分裂;Mdivi-1;氧化应激;凋亡
【作者】张倩;张宏伟;夏建华;连亚军;谢南昌
【作者单位】郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052; 河南省人民医院康馨综合病房郑州450003;郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052; 中国平煤神马医疗集团总医院神经内科平顶山467100;郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052; 驻马店市中心医院神经内科驻马店463000;郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052;郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052
【正文语种】中文
【中图分类】R742.1
#通讯作者，连亚军，女，1964年4月生，博士，主任医师，教授，研究方向：癫痫、头痛、脑血管病、肌张力障碍的基础与临床，E-mail：
*****************；谢南昌，男，1984年1月生，博士，主治医师，研究方向：癫痫的基础与临床， E-mail：*********************
癫痫是临床上最常见的神经系统疾病之一，全球大约有5 000万人患病。

长期、反复的癫痫发作严重降低了患者的生活质量，因而明确癫痫的发病机制及寻求新的治疗方法具有重要的现实意义。

癫痫发作可使线粒体功能受损，导致线粒体膜电位降低，线粒体发生通透性转运，细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)及凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)释放入胞质，引起细胞凋亡，导致神经元对痫性损伤更敏感，形成恶性循环[1-2]。

动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是线粒体分裂调控关键蛋白，主要位于细胞质，受线粒体外膜分子Fis1的招募而转位至线粒体潜在分裂位点，形成指环结构，逐渐压缩直至线粒体分裂。

线粒体分裂后，Drp1重新回到胞质，如此循环反复[3]。

线粒体分裂蛋白抑制剂(mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1)是一种喹唑酮类衍生物，通过抑制GTP酶的活性来发挥抑制Drp1的作用[4]。

已有文献报道Mdivi-1可减轻心肌缺血再灌注损伤[5]和急性肾损伤中的细胞凋亡[6]，但尚未见有关Mdivi-1在癫痫模型中作用及机制的相关报道。

该研究通过Mdivi-1预处理，观察其对匹鲁卡品(pilocarpine，PILO)致痫大鼠行为学及海马神经元损伤的影响，并检测氧化应激指标MDA、SOD及凋亡相关分子AIF、Cyt C及Caspase-3的变化，以进一步探讨其作用机制。

1.1 实验动物 121只健康成年雄性SD大鼠，体重200～250 g[由郑州大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(豫)2010-0002]，采用随机数字表法分为CON组、PILO组、PILO+DMSO组和PILO+Mdivi-1组4组，其中PILO组又分为癫痫持续状态(status epilepticus，SE)2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组，除PILO组的SE 2 h、8 h和24 h 3个亚组每组11只外，其余各组每组22只。

1.2 实验试剂氯化锂、PILO和DMSO均购自美国Sigma公司；Mdivi-1购自
ENZO公司。

MDA和SOD检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、全蛋白提取试剂盒、线粒体蛋白提取试剂盒及细胞核和胞质蛋白提取试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。

兔抗大鼠Drp1、Cyt C多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗大鼠AIF、caspase-3多克隆抗体购自英国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自北京晶美生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，Trizol RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，Prime Script RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 癫痫模型及药物干预模型建立 SD大鼠腹腔注射氯化锂(127 mg/kg)进行预处理，20 h后腹腔注射PILO(30 mg/kg)，在注射PILO前30 min给予皮下注射氢溴酸东莨菪碱(1 mg/kg)以拮抗PILO的外周胆碱能反应。

PILO+Mdivi-1组和PILO+DMSO组在注射PILO前30 min分别给予腹腔注射Mdivi-1(1.2 mg/kg)或体积分数0.1% DMSO。

对照组用等体积的生理盐水代替PILO。

SE维持60 min后腹腔注射地西泮(10 mg/kg)终止发作。

1.4 大鼠行为学观察以参考文献[7]为判定标准，达到Ⅳ或Ⅴ级定为癫痫模型制作成功。

分别记录各组大鼠致痫成功率及潜伏期。

1.5 取材、检测指标及方法 PILO组、PILO+DMSO组和PILO+Mdivi-1组在造模成功后72 h各取6只大鼠，CON组在腹腔注射地西泮后72 h取6只大鼠，分别给予腹腔注射水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，仰卧固定于解剖板，充分暴露心脏，先用生理盐水快速灌注，后用40 g/L多聚甲醛缓慢推注，灌注完成后开颅取脑，将脑组织放于40 g/L多聚甲醛中于4 ℃冰箱固定24 h后进行Nissl染色。

PILO 组SE 2 h、SE 8 h、SE 24 h和SE 72 h亚组分别在造模成功后2、8、24和72 h各取8只大鼠，PILO+DMSO组和PILO+Mdivi-1组在造模成功后24 h各取8只大鼠，CON组在腹腔注射地西泮后24 h取8只大鼠，水合氯醛麻醉后处死并迅速取出脑组织，于低温修块台上分离出双侧海马，置于-80 ℃保存用于MDA、
SOD、Western blot和RT-PCR检测。

1.5.1 Nissl检测在大脑视交叉与视乳头之间冠状切取厚3 mm组织，脱水后石蜡包埋，制备厚度为10 μm的连续切片，甲苯胺蓝染色，显微镜下观察大鼠海马
CA3区神经元损伤和丢失情况。

1.5.2 MDA、SOD的检测取海马组织称重，按组织与生理盐水1:9(质量比)的比
例置于玻璃匀浆器中冰浴研磨，离心，取上清液，检测海马组织中MDA含量和SOD活力[8]。

1.6 各组大鼠海马组织中Cyt C、AIF及cleaved caspase-3蛋白表达的Western blot检测分别提取海马组织全蛋白、细胞质蛋白、线粒体蛋白和细胞核蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，封闭2 h。

一
抗孵育，加入兔抗大鼠Drp1(按1:2 000稀释)、Cyt C(线粒体蛋白、细胞质蛋白，按1:3 000稀释)、AIF(线粒体蛋白、细胞核蛋白，按1:300稀释)、caspase-3(按1:300稀释)多克隆抗体，置于4 ℃冰箱过夜。

洗膜后加入辣根过氧化物酶标记山
羊抗兔IgG(按1:10 000稀释)，室温反应1 h，ECL显影成像，重复3次。

采用凝胶成像分析系统测定条带光密度，以目的蛋白与相应内参条带(β-actin、cox-Ⅳ、β-actin、cox-Ⅳ及β-actin、Histone及β-actin)光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 各组大鼠海马组织中Drp1 mRNA表达的RT-PCR检测参照Trizol RNA提取试剂盒说明提取大鼠海马组织总RNA，紫外分光光度仪测量RNA浓度。

用Prime Script RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR扩增。

Drp1上游引物序列5’-CGTAGTGGGAACTCAGAGCA-3’，下游引物序列
3’-TGGACCAGCTGCAGAATAAG-3’，扩增产物大小为120 bp；内参GAPDH上游引物序列5’-CCT TCATTGACCTCAACTAC-3’，下游引物序列3’-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3’，扩增产物大小为536 bp。

反应条件：
94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；再72 ℃延伸7 min。

15 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪观察结果，实验重复3次。

采用凝胶成像分析系统测定条带光密度，以Drp1与内参条带光密度比值作为Drp1 mRNA的相对表达量。

1.8 统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用精确概率法比较各组大鼠致痫成
功率的差异，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组大鼠海马CA3区神经元丢失、海马组织中SOD活力、MDA含量、Drp1蛋白、Drp1 mRNA、Cyt C、AIF及cleaved caspase-3表达的差异，检验水准α=0.05。

2.1 各组大鼠行为学观察见表1。

2.2 各组大鼠海马CA3区神经元损伤的病理学观察见图1、表2。

CON组海马Nissl染色可见CA3区大量致密排列的锥体细胞，细胞形态完整、结构清晰，染色质分布均匀，胞质内含丰富的尼氏小体。

SE后CA3区神经元脱失、排列疏松，轮廓模糊、界限不清。

2.3 各组大鼠海马组织中SOD活力、MDA含量比较见表3。

2.4 各组大鼠海马组织中Drp1蛋白和mRNA表达的变化见图2、表4。

2.5 各组大鼠海马组织中Cyt C、AIF及cleaved caspase-3的表达见图3、表5。

癫痫发作中脑部神经元的高度同步化异常放电，可引起活跃的自由基反应[9-10]和线粒体动力学的改变[11-12]，打破原有的平衡状态，引起神经元损伤。

已有研究[13]证明ROS的产生与线粒体分裂关系密切，其产生随线粒体分裂的增加而增加，可能的机制为线粒体嵴Cyt C的重新分布。

该研究通过建立氯化锂-PILO癫痫大鼠模型，证明Mdivi-1能减轻SE后氧化应激和细胞凋亡，减轻神经元损伤，具有神经保护作用。

已有研究证实线粒体损伤导致的线粒体膜通透性转换孔开放是非酒精性脂肪肝大鼠模型肝细胞凋亡[14]和去铁胺诱导HL-60细胞凋亡[15]的可能机制。

癫痫发作也
可引起线粒体功能异常[16]和动力学障碍[11-12]，线粒体受损后膜电位降低，线粒体膜通透性转换孔开放发生通透性转运，Cyt C及AIF释放入胞质，通过多条凋亡信号通路介导细胞凋亡[17]，且已证明Drp1参与多个线粒体依赖的凋亡途径[18]。

Drp1的活性受翻译后修饰及与其他物质相互作用的影响[19]。

Mdivi-1是Drp1的选择性抑制剂，抑制线粒体分裂，进而抑制线粒体外膜通透性改变和Cyt C的释放[4]。

该研究结果显示，SE后大鼠海马线粒体分裂增加、功能受损，导致Cyt C释放和AIF移位至细胞核，通过激活caspase-3或直接引起染色体凝集和DNA呈大片段断裂，导致神经元大量凋亡。

Drp1选择性抑制剂Mdivi-1可明显缓解SE引起Cyt C释放、AIF移位、caspase-3激活和海马神经元凋亡；但对Drp1蛋白及mRNA表达无明显影响，机制可能为Mdivi-1主要通过影响Drp1的分布或活性，而不是直接影响Drp1的表达，从而抑制线粒体分裂，发挥神经保护作用。

线粒体既是自由基的主要生产场所，又是氧化应激损伤的靶点。

ROS和RNS可导致线粒体孔通透性转变和Cyt C释放，激活caspase-9和caspase-3，引起细胞凋亡[20]。

该研究结果显示SE后大鼠海马组织内存在明显的氧化应激损伤，且在SE后24 h最明显；而Mdivi-1可明显改善SE引起的MDA和SOD等氧化应激指标变化，减少神经元细胞凋亡。

该研究结果提示，通过改善线粒体动力学障碍，可减轻海马神经元的氧化应激损伤。

综上所述，Mdivi-1对SE后海马神经元具有神经保护的作用，为抗癫痫治疗提供新的思路和方法。

该研究还初步表明Mdivi-1的神经保护机制可能是降低氧化应激，抑制Cyt C释放、AIF移位和caspase-3激活，但其具体作用机制有待进一步研究。

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