色-谱法的定义

色-谱法的定义
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一、色谱法的定义
为什么混合色素在碳酸钙柱上可以被分开,这是由于不同组分在柱上移动速度不同，即差速迁移造成的。

色谱系统由流动相和固定相(即上列中的石油醚和碳酸钙)组成。

被分离的样品处于色谱柱的一端，可以被固定相吸附，也可以溶解于固定相中。

当流动相流过固定相时，一部分样品从固定相中进入流动相，被流动相推动运行到下一段色谱柱，其中一部分又被色谱柱吸附或溶解。

当新鲜的流动相流过色谱柱顶时，存在于固定相中的样品也有一部分回到流动相中，被流动相携带前进，去进行下一轮的吸附一解吸或溶解一释出的活力。

样品在固定相中溶解(或吸附)的浓度与其在流动相中存在的浓度之比被称为分配(或吸附)系数。

由于混合物中各个组分的理化性质不同，它们在两相中的溶解度或吸附量有差异，即使这种差异很小，当这种过程反复多次时，也会使它们的迁移次数不同而彼此分离。

由此，我们得出了色谱法的定义如下:
色谱法是一种分离方法，它利用物质在两相中分配系数(或吸附系数)的微小差异产生了很大的效果，使各组份分离，以达到分离，分析及测定一些物理化学常数的目的。

1.色谱图:经色谱法分离的样品组份，各组份浓度随流动相体积或时间的变化而变化，用检
测器检测样品浓度所得到的响应信号对时间或流动相体积的峰形曲线，称为色谱
图。

2.基线:当没有样品组份进入检测器时，仪器记录的值为基线。

3.色谱峰:当样品组份进入检测仪器时，仪器响应值偏离基线，信号强度随检测器中样品组
份浓度而改变，直至组份全部离开检测器，此时绘出的曲线称为色谱峰。

4.峰面积(A):组份的流出曲线与基线所包围的面积，称为该组份的峰面积。

5.峰高
(h):色谱图最高点至峰底的垂直距离。

6.峰拐点:在组分流出曲线上二阶导数等于零的点。

7.峰宽(W):沿色谱峰两侧拐点处所做的切线与峰底相交两点之间的距离。

8.半峰宽(W):在峰高0.5h处的峰宽。

2/h
9.保留时间(retention time)(t):进样后组份流入检测器的浓度达到最大值的时间。

R
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10. 死时间(dead time t):固定相不吸附或不溶解的组份的保留时间。

若用体积来表示称为o
死体积(Vo)。

11.相比率(β)(phase ratio):色谱柱内流动相所占体积与固定相所占体积之比。

12.分配系数(partition coefficient)(k):在平衡状态时，组份在固定相与
流动相中的浓度比。

13.容量因子(tapacity factor)(k’):在平衡状态时，组份在固定相与流动相中的质量比。

也称分配比。

，14.校正保留时间(t’) 保留时间与死时间之差。

同理，校正保留体积(V):为保留体积RR与死体积之差值。

平衡色谱理论
uu= f’(c)谱带1,K1，K
1,K设，定义为容量因子。

k’,f’(c)K
uu= 谱带1，K’
塔板理论
塔板方程式，。

也称为流出曲线方程
nV2,(1,)nmV2R C,e
2,VR
上式是以体积V(也可用时间或距离)为变数，表示流出组份浓度变化的方程。

当n很大时，上式为正态分布方程。

它描述被分离组份，通过任一V体积载气，离开具有n块塔板填充柱，进入检测器时的浓度，塔板理论方程式有下列特性:
(1)、浓度极大值一峰高:
当V=V时，组份浓度极大值(C)将离开色谱柱进入检测器， Rmax
nmC ,max2,VR
(2)流出曲线—色谱峰
根据流出曲线方程作图得到图1—1，它与实际色谱图能较好地符合。

当n很大时，流
VtRR,,,出曲线趋近于正态分布曲线。

设，上式可改写为
nn
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2()t,t,C202, C,e
2,,
由流出曲线方程可计算色谱图上的重要参数
a. 半峰宽:
8Ln2 (1,18) W,,V,2.354,hRn2
b. 拐点:曲线上二阶导数为零时，其高度为0.607C，拐点间距离为W，由流出曲线maxi方程可计算出
2VR (1,19) W,,2,in
c. 峰宽(W，即图1—1中IJ)，经计算W位于0.134C处， max
W=2W=4σ (1—20) i
由以上计算可以看出，标准偏差σ越小，峰形越窄，柱分离效能越高，分离条件选择得也越好。

3(理论板数(n)的计算方法
理论板数n是柱效率的主要指标，柱效率的高低直接影响分离效率，下面为常用的两种理论板数计算法
(1)保留值—半峰宽法
h 保留值可用V，t或d(保留距离)来表示。

半峰宽(W)需采用与保留值相同的RRR2单位。

222，，，，，，
VVtd,,,,,,RRRR2n,8ln2(),5.54,5.54,5.54
(1,21) ,,,,,,WW(V)W(t)W(d)hhhh,,,,,,，，，，，，2222
(2)保留值—峰宽法
V4RW , ,4,
n
222,,,,,,VtdRRR,,,,,,n ,16,16,16,,,,,,WWWttd,,,,,,
从色谱图中，可测定保留值及峰宽，而后计算n值及H值。

由于死时间或死体积的存在，往往计算出的n值尽管很大，H很小，但色谱柱表现出来的实际分离效能并不好。

因此可将上述公式中的集留值改为校正保留值,以计算有效塔板数n和有效塔板高度H 有效有癣
2，，2tt’’,,,,RRn=5.54 (1,25) ,16有效,,,,W(t)W,,h,,，，2
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例:在一根色谱柱上测得空气峰出峰时间为0.5分钟，样品出峰时间为2.44分钟，峰宽9.7
秒。

假设色谱峰呈正态分布，色谱柱长1米，计算该柱的理论塔板数，理论信纸塔板高度，
有效塔板数及有效塔板高度。

已知:t=0.5 min=30s, t=2.44 min=146.4s, W=9.7s, L=1m=1000mm mR
求: n, n，H，H 有效有效
22t146.4,,,,3R解: n,16,16,3645,3.6，10,,,,W9.7,,,,
L H,,0.27mmn
22t’146.4,30,,,,3R n=16 ,16,2034,2.3，10有效,,,,W9.7,,,,
L H= ,0.43mm有效n有效
33答:此柱的理论塔板数n为3.6×10，理论塔板高度为0.27mm。

有效塔板数为2.3×10，
有效塔板高度为0.43mm。

速率理论
222 22'rDgkdpkdf,2，，0.01，H,dpuu22 u(1，')3(1，')kDgkDl上式由三项组成，可简化如下:
B H,A，，(C，C),91,
其中 1、涡流扩散相A=2λdp
λ:不均匀程度 dp:载体颗粒直径
2、分子扩散相B=2γDg
B:分子扩散系数 Dg:气相扩散系数
3、传质阻力项 '22kdp Cg:气相传质阻力系数 Cg=0.01 '2(1，k)Dg 2dk'2f Cl:液相传质阻力系数 Cl= ,'23(1，k)D1免费～～免费～～
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d:液膜厚度 D:组份在液相中扩散系数 f1
μ:载气(流动相)线速度。

k’: 容量因子
(1)载气线速:从速率理论简化式可以看出，A、B、C、C各项系数与流速无关。

唯一g1
的变数为μ。

以板高按双曲线关系随线变化，曲线的最低称为最佳点，与此点对应的线速称为最佳线速(μ)，与此点对应的板高称为最小板高(H)。

μ及H可由速率方程求optminoptmin得
dHB,,，(Cg，C),012,du
,,B/(Cg，C),H,A，2B(Cg，C) opt1min1
线速(μ)对速率方程中各项影响如下:(图1-10)
A项与线速无关，对板高的影响为一常数
B项与线速成反比，当线速较小时，Cu与Cu两项可忽略，则H=A+B/μ。

用此式作g1
H—μ图得到的双曲线，相当于上图的弯曲部分，此时分子扩散项是影响板高的主要因素。

Cg、C1两项与线速成正比，当线速较大时，B项对板高的影响可忽略，速率方程简化为:H=A+(C+C)μ。

用此式作H—μ图得到一直线，相当于上图中曲线比较平直部g1
分的渐近线，其截距为A，斜率为C+C。

g1
综上所述，当μ,μ，B项起主要作用。

由图可见曲线变化陡峭，线速越影响越严重。

opt
当μ,μ时，传质阻力项起主要作用。

板高随线速增加而增加，但变化缓慢，曲线平滑。

opt
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当μ=μ时，柱效最高，但用μ线速进行分析，速度太慢。

实际应用中，载气μ值一般optopt
大于μ。

opt
二、色谱过程热力学,高选择性色谱理论基础
分子间的作用力，按作用的方向，可以分为两大类型:即使分子间相互吸引或
使分子间相互排斥，吸引力产生于分子的永久偶极矩、电子摄动及氢键的作用，排斥力则由于分子相互接近的电子云重叠所造成。

分子间作用力所形成的总位能场(,)为:
X=X+X+X+X+X 斥定诱色氰
式中:,:排斥力位能场;,:定向力位能场;,:诱导力位能场;,:色散力斥定诱色位能场;,:氢键力位能场。

氢
由于通常状态下排斥力位能场远远小于吸引力所形成的位能场，常常忽略不计。

1、定向能(,) 定
在溶液中，如果每个溶质分子(,)被z个溶剂分子有效包围，对于溶质分子定
向力形成的位能场为:
22,,2A荆X,,Z 63kTr
μ、μ分别为两分子的偶极矩，,为Boltzmann常数，,为绝对温度，r为两分子之12
间的距离。

2、诱导能(,) 诱
永久偶极矩为μ的分子，与相矩 r具有极化率为α的分子产生诱导作用，其平均相1A2a,1A互作用能为 X。

诱导作用是相互的，彼此都能产生。

诱导偶极矩
μ的分子、,,2,126r2a,2B对相矩r、其极化率为α的分子产生的诱导能为
βX,,2,16r 两者总和为:
22 aa,，,12ABX,,绣6r
在溶液中，如果溶质分子(,)周围有效溶剂分子配置数为,，则对于溶质子，诱导
122力形成的位场能为 X,,(,a，,a)ZAA绣荆荆6r
3、色散能(X)- 非极性分子之间的作用能。

色
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aaII31212X,,色6I，I2r12
I为分子电离能。

它反映了分子对外层电子的制约能力。

在溶液中，若溶质分子周围溶剂分子的有效配位数为,，则对于溶质分子色散能形成的
aaII,3AA荆荆位场能为 ,XZ色6，II2rA荆
4、氢键作用能(,) 氢
通常把氢键的作用力划归为范德华引力的范畴，但是它与前面三种范德华作用力在性质上有明显的区别。

氢键具有方向性及饱合性，其作用力也较大，介于化学键与色散力之间，一般为5,10千卡/摩尔。

在同系物中，氢键力随分子量增大而减弱。

分子内氢键的形成会降低分子的极性。

三、色谱分离条件选择,多元混合物分离理论
1、总分离效能指标及分辨率
t,tt,tR(2)R(1)R(2)R(1) R,,2()sW，WW，Wh(1)h(2)h(1)h(2)
2
注:,为用时间表示的峰宽。

h
k'na,12即 R,,,s4a1，k'2
色谱在分析中的应用
色谱法的主要用途是分析混合物中的组份及测定含量。

一、定性分析
对于一个已知范围的混合物，用色谱法定性很容易，但对一个范围未知的混合物，单纯用色谱法定性则很困难，常需配合化学分析及其它仪器分析方法。

1、利用保留值定性:有五六种方法，方法虽多，对于全未知物定性实用的很少，且多
数方法只能提供未知物的范围。

现就其中常用的已知物对照法及相对保留值法介绍如下。

已知物对照法:即根据同一种物质在同一根柱上保留时间相同的道理定性。

定性方法:取样品可能含有组份的纯物质备用。

取几滴样品，将适量的纯物质之一加入其中，混匀进样。

对此加入前及加入后的色谱图，若色谱峰相对增高，则色谱峰的组份与纯免费～～免费～～
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物质可能为同一物质。

由于所用的色谱柱不一定适合于纯物质及待定性组份的分离，虽为二种物质，色谱峰也可能产生叠加现象。

在把握不大时，需再选一只与上述色谱柱极性差别较大的进一步验证。

若在这两个柱子上，该色谱峰都产生叠加现象，一般可以认定是同一物质。

已知物定性用于已知组份的复方药物分析、工厂的定型生产尤为方便。

条件若不变，定性一次即可。

2.选择性检测器定性
择性检测器对某类或某几类化合物有信号，因此可用来判定被检测物质是否为此类选
化合物。

例如气相色谱的氢火焰离子化检测器(FID)只对含碳有机化合物有信号，故可据此进行判断。

下图为同一样品分别由FID及FPD检测所作出的色谱图，由此可知(1)、(4)号峰为含,或含硫化合物。

选择性检测器定性利用保留值定性 3.两谱联用法:色质联用仪或色红联用仪
二、定量分析
色谱法对于多组分混合物既可分离混合物又能提供定量数据，迅速方便，定量精密度为?1,3,。

在实验条件恒定时，峰面积或峰高与组份的含量成正比，因此可利用它们定量。

(一) 峰面积测量
峰面积测量的准确度直接影响定量结果，对于不同峰形的色谱峰必须采用不同的测量的方法，正常峰色谱峰用以下公式计算
h1.065()A,,h,W12
hA:峰面积 h:峰高 W( ):半峰宽 2
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在各种操作条件(色谱柱、温度、流速等)不变时，在一定进样量范围内，色谱峰的半峰宽与进样量或样品浓度无关，而峰高、峰面积则随样量或样品浓度而变化。

因此正常峰也可用峰高代替峰面积求含量。

下图为未完全分离的峰的三种情况。

当重叠的交点高度高于小峰的半峰高时，可按(a)
)作交点向基线的垂线(垂线法)，若小峰在大峰作切线法处理，若低于半峰高时，可按(b
的尾部，可按图(c)做连线法处理。

图1,12 重叠峰面积的测量
(二)定量校正因子
同一种物质在不同类型的检测器上有不同的响应讯号，而不同的物质在同一种检测器上响应值也不相同，为了使检测器产生的响应讯号能真实地反应出物质的含量，需要对响应值进行校正。

在一定操作条件下，进样量,与响应讯号(峰面积,)成正比，则
Q9iQ=f’A if,A
f’即为该组份的定量较正因子。

由于,的单位不同，又分为重量校正因子
f’，摩尔校正,因子f’ ,
f’主要由仪器灵敏度所决定，即不易测得也无法应用。

所以在定量分析中使用相对校正因子，即某物质与标准物质绝对校正因子之比值。

常用的标准物质，气
相色谱中热导池检测器为苯，氢焰离子化检测器为正庚烷。

单位不同，分为下述几种情况。

相对重量校正因子
' m/Af(W)iiif,,wf'm/A (W)sss
式中下标i与s分别表示组份与标准物，m为其重量，A为峰面积。

相对摩尔校正因子
m，，iAi/,,f'AmMsMiMi()M，，issffw,,,,M'msfAMimMi，，
()wsisAs/,,Ms，，免费～～免费～～
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,为该组份的摩尔数
上述校正因子中，也可用峰高计算。

(三)定量分析方法
根据色谱图进行组份的定量时，所用定量方法主要有归一化法，内标法和外标法三种。

用于计算的参数，包括(1)峰面积及相应的峰面积校正因子;(2)峰高及相应的峰高校正因子。

下述的计算公式中只用了前者，但均可用后者代替。

例题中只提到重量校正因子，可以类推用摩尔或体积校正因子。

1.归一化法
将样品中所有组份含量之和定为100,，计算其中某一组份含量百分数的定量方法。

其计算公式如下。

m (i)m%,，100%im,(i)
f,AW(i,s)(i) ,，100%f,A,w(i,s)(i)
例:分析乙醇、庚烷、苯及乙酸乙酯的混合物。

实验测得它们的色谱峰面积各为5.0、
29.0、4.0、及7.0cm，由手册查得它们的相对重量校正因子F分别为0.64、0.70、0.78及,
0.79，按归一化法分别求它们的重量百分浓度。

5.0，0.64(1)乙醇%= ，100%5.0，0.64，9.0，0.70，4.0，0.78，7.0，0.79 3.20,，100% 18.15
,17.6%
9.0，0.70，100%,34.7%(2)庚烷= 18.15
4.0，0.78(3)苯%= ，100%,17.2%18.15
7.0，0.79(4)醋酸乙酯%= ，100%,30.5%18.15
归一化法的优点是简便、定量结果与进样量无关(色谱柱不超载的范围内)，操作条件变化时对结果影响较小。

在分析同系物且碳数比较接近的化合物时，近似认为相对校正因子免费～～免费～～
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相等，可以简化计算。

但最好事先查对以免带来较大误差。

缺点是必须所有组份在操作时间内都流出色谱柱，而且检测器对它们都产生信号，否则用归一化法误差较大。

2、内标法，当混合物所有组份不能全部流出色谱柱(如不气化、与固定液产生化学反应等);或检测器不能对每个组份都产生信号;或只需要测定混合物中某几个组份的含量时;可采用内标法。

准确称量样品的重量为m克，取一纯物质(内标物)适量，加入其中，并准确称量内标物重量为m克，混匀，进样。

测量色谱图上需定量的i组份的峰面积,及内标si物的峰面积,，则i组份在样品m中所含的重量m，与内标物质的重量m，有下述关系: sis
Afmim(i)i,mAs,f sm(s)
上述关系的成立，是因为用重量校正因子f及m校正后的峰面积之比相当于重量之比，miis
因此由上式可求出m。

但通常定量，多是测定i组份在样品中的百分含量C,，而 ii
miC%,，100%i m
将上两式整理得:
A,fmimis C%,，，100%iAs,fmms
这是内标法最重要的公式。

对内标物的要求:(1)内标物是原样品中所不含有的组份，否则会使峰重叠而无法准确测量内标物的峰面积A;(2)内标物的保留时间应与待测组份相近，但能完全分开;(3)s
内标物必须是纯度合乎要求的纯物质，否则将使所得的C%不准确(若得不到纯品，用已知i
含量的内标物，杂质峰不干扰时，也可用，但m需校正)。

内标法是具备归一化法的优点，s
只要被测组份与内标物产生信号即可定量，很适合于药物的某些有效成份的含量测定。

还特别适用于微量杂质检查。

由于杂质与主要成份含量相差悬殊，无法用归一化法测定杂质含量，用内标法则很方便。

加一个与杂质量相当的内标物，加大进样量突出杂质峰，测定杂质峰与内标物峰面积之比，则可求出杂质含量。

缺点是样品配制比归一化法麻烦。

例:无水乙醇中的微量水的测定可按下述方法进行: 样品配制准确量取被检无水乙醇10ml称重(净重)为79.3700g。

用减重法加入无水甲醇约0.25g，精密称定为0.2572g，混匀待用。

经色谱分析测得数据如下:
水: h=4.60cm， W,0.130cmh,,,,2,,
甲醇: h=4.30cm， W,0.187cmh,,,,2,,
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计算:
(1)重量百分含量:
f,0.55?用以峰面积表示的相对重量校正因子 ;f=0.58计算: 甲醇HO2
1.065，4.60cm，0.130cm，0.550.2572gHO%,，，100%,0.228%(W/W)2 1.065，4.30cm，0.187cm，0.5879.3700g
;f=0.340计算 ?用以峰高表示的重量校正因子f,0.224甲醇HO2
4.60cm，0.224，0.2572gHO%,，100%,0.230%(W/V)24.30cm，0.340，79.3700g
3、已知浓度样品对照法:是在不知校正因子时内标法的一种应用。

在药物分析中，校正因子经常不知，可用此法。

先配制已知浓度的标准样品，加入一定量内标物，再将未知浓度的检品按相同比例加入内标物。

分别进样，由下式求出检品的含量。

A,,i检品,, ,,A(Ci%)s检品,,, 标准品A(Ci%)i,,标准品,, As,,
(A/A)(C%)，s检品标准11(C%) ,i检品(A/As)i标准
对于正常峰，则可用峰高h代替峰面积A ,计算大为简化。

(h/hs)1检品(C%),，(C%)i1检品标准(h/hs) i标准
配制标准样品相当于测定相对校正因子。

例:药剂中含醇量测定
(1)标准溶液配制:准确吸取无水乙醇5ml及丙酮(内标物)5ml，置100ml容量瓶，加水稀释至刻线。

(2)样品溶液配制:准确吸取样品10ml及丙酮5ml，置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度线。

(3)标准溶液与样品溶液分别进样三次，每次4,6μl。

分别测得标准品和检品中乙醇丙酮高比平均值分别为13.3cm/6.1cm及11.4cm/6.3cm，则酊剂中的醇含量为:
(11.4cm/6.3cm)，10检品乙醇%,，5.00%,42%(V/V) (13.3cm/6.1cm)标准
4、外标法:
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比较相同分析条件下纯样(标准样品)与样品中该组份色谱峰面积或峰高，进行定量的分析方法称为外标法。

也被称为定量进样校正曲线法，或定量进样法。

此方法是在进样量、色谱仪器及操作等分析条件严格固定不变的情况下，先将不同含量的组份纯样等量进样，进行色谱分析，求得含量与色谱峰面积或峰高的关系，将此关系绘成定量校正曲线，而后在同样条件下分析待测样品，测量待测样品的峰高或计算峰面积，并以此在校正曲线上求出样品含量，如果标准曲线通过座标系原点，则可按下述公式计算品含量。

Amis m,iAs
外标法定量
当被测样品中各组份浓度变化不大时，例如工厂中控制分析的样品，其组成一般变化不大，可以不必做校正曲线，用单点校正法来分析。

即配制一个和被测组份
含量十分接近的标准样，在同一条件下定量进样分析标准样及待测样品，由两者的峰高比或峰面积比计算未知样品含量。

Amism,iA s
外标法简便易行，但标准样及被测样品的分析条件需一致。

进样量准确，仪器稳定，还需经常考察定量校正曲线有无变化。

5、影响准确定量的主要因素
色谱定量分析的允许偏差，随样品中组份浓度不同而异。

文献上
(Kaiser,R.,Chro-matographie in der Gasphase, Vol,? 1965)提出手工处理气相色谱数据时，定量分析允许偏差如下表
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表1,4 气相色谱定量分析的允许偏差范围试样浓度, σ(标准差), 试样浓度, σ(标准差), 0.01-0.05 ,100 3,10 3,5 0.05-0.5 ,50 10,30 2,3 0.5-3
5,10 ,30 ,2
影响定量结果偏差的原因很多，主要有以下因素。

(1)样品的代表性及稳定性
(2)进样量是否准确
(3)检测器的选择及其工作条件
(4)峰面积及峰高测量的误差
色谱分析是一项复杂而又细微的工作，需要根据具体情况选择最佳方法，排除误差，取得良好的定量结果。

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