一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102952187 A
(43)申请公布日 2013.03.06C N 102952187 A
*CN102952187A*
(21)申请号 201210502736.X
(22)申请日 2012.11.30
C07K 14/765(2006.01)
C07K 1/14(2006.01)
(71)申请人深圳市美凯特科技有限公司
地址518109 广东省深圳市宝安区龙华大浪
街道华宁路华联工业园7栋四楼
(72)发明人李攀 袁正明 谈宇清
(74)专利代理机构深圳市科吉华烽知识产权事
务所(普通合伙) 44248
代理人韩英杰
许建
(54)发明名称
一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法
(57)摘要
本发明提供一种高纯度牛血清白蛋白的制备
方法，包括如下步骤：A ）分离血浆；B ）制备血清；
C ）加热提取；
D ）置换溶液和浓缩；
E ）DEAE 柱进一
步纯化；F ）BSA 剂型处理。

本发明用料少，可节约
投入；工艺流程短，省时省力；操作简单，重复性
好，适合大批量生产；目标产品得率高、纯度高、
质量好，本方法制得的成品牛血清白蛋白经过质
量检验，产品质量完全符合现行行业质量标准，使
用效果良好，可满足生化试剂与生物制药行业对
牛血清白蛋白的质量要求；成本低，经济效益显
著。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书4页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页
1/1页
1.一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A ）分离血浆：取新鲜牛血，加入血量体积的10%的抗凝剂，轻轻搅拌使抗凝剂分散均匀，4℃，1500rpm 离心，分离收集血浆；
B ）制备血清：室温下，取所述血浆，边搅拌边加入无水氯化钙粉末，待所述无水氯化钙粉末完全溶解后静置0.8~1.2h ，将凝结成果冻状的血浆块打碎，5000 rpm 离心，上层澄清液体即为牛血清，下层乳黄色凝块为纤维蛋白，收集所述牛血清；
C ）加热提取：取所述牛血清用pH5.2~7.0 PBS 缓冲液稀释2~10倍后放入带夹层的反应釜中，加入辛酸钠并搅拌使之完全溶解，再加入所述牛血清体积的5%~20%的乙醇，用1当量浓度的HCl 调pH 值至4.0~6.2，油浴加热，使反应釜中牛血清的温度保持在55~75℃，0.8~1.2h 后取出反应液，压滤机压滤，收集滤液，弃掉滤渣；
D ）置换溶液和浓缩：将所述滤液用20000分子量以下的超滤装置过滤并将缓冲体系置换为pH8.0~8.5 Tris-HCl ，同时进行浓缩；
E ）DEAE 柱进一步纯化：装柱后用pH8.0~8.5 Tris-HCl 平衡柱子，将超滤浓缩后的BSA 溶液泵入层析柱中，并继续用pH8.0~8.5 Tris-HCl 平衡，待接入纯化系统中的核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时，收集穿透组分，待穿透峰回落至基线后用含0.15M NaCl 的pH8.0~8.5 Tris-HCl 溶液洗脱，待核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时，收集洗脱组分并脱盐浓缩，得到脱盐浓缩后的洗脱组分；
F ）BSA 剂型处理：取所述脱盐浓缩后的洗脱组分，加入防腐剂、络合剂，得到高纯BSA 溶液，或直接进行冷冻干燥，得到BSA 冻干粉。

2.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：步骤A ）中所述抗凝剂采用浓度为3%~5%的柠檬酸三钠溶液。

3.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：步骤B ）中所述加入无水氯化钙粉末的量为3~10g/L 血浆。

4.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：步骤C ）中所述加入辛酸钠的量为1~10mmol/L 血清。

5.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：步骤C ）中所述乙醇的浓度为95%。

6.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：步骤A ）和步骤B)在集中屠宰场分散操作，步骤C)、D)、E)、F)在洁净厂房集中操作。

权 利 要 求 书CN 102952187 A
一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从牛血清中提取白蛋白的方法，尤其涉及一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法。

背景技术
[0002] 牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，等电点为4.7，含氮量为16%，含糖量为0.08%，含脂量只有0.2%；白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合，BSA是生物学诸多学科及医、药学各领域广泛应用的生化试剂，例如在western blot中作为封闭试剂，血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用；在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。

[0003] BSA的制备方法较多，但多数尚处于实验阶段，目前市场上的BSA主要采用以下三
（2）有机溶剂沉淀种方法制得：
（1）盐析法，用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得；
法，以E.J.Cohn氏法最常用，最早用于人血液制品的生产，利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中溶解度不同分离血浆
（3）热激法，取牛血用枸橼酸钠抗凝离心后得到血浆，蛋白质,可以生产出多种血浆蛋白；
加热，加入辛酸钠，调pH值后加乙醇，再经过滤、脱盐、浓缩、冻干后得牛血清白蛋白。

[0004] 盐析法为最传统的生产方法，此法原理较为简单，但是硫酸铵对设备有一定的腐蚀性，整个工艺比较耗时，且硫酸铵用量很多，所得产品纯度只有80%~90%，收率一般为0.8~1.0%，以上导致此法生产效率低，成本偏高；利用冷乙醇沉淀法也有一些不足：乙醇是一种非特异性沉淀剂，尽管BSA生产效率显著，但产品纯度不是很高，作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集或变性，为了避免蛋白质变性，必须在－20℃的低温环境中进行，设备与厂房的投入很大，乙醇易燃，给生产带来安全隐患，单程需7日，能源消耗巨大，费时费力，生产不易实现自动化，有机溶剂沉淀法所得BSA纯度在90%~95%，收率在10%左右，相对而言成本比较高，从而使其产品因在市场中售价偏高而降低了竞争力；单纯使用热激法，虽然用料少且省时，但是收率仅有1.8~2.0%，且纯度也不高，仅能达到90%。

[0005] 因此，目前BSA的制备方法存在费时费力、收率低、纯度不高、生产效率低、成本高等缺陷。

发明内容
[0006] 为解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法，它用料少，省时省力，收率高，用本制备方法可较大幅度地降低成本。

[0007] 本发明的技术方案是：本发明提供一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法，包括如下步骤：A）分离血浆：取新鲜牛血，加入血量体积的10%的抗凝剂，轻轻搅拌使抗凝剂分散均匀，4℃，1500rpm离心，分离收集血浆；B）制备血清：室温下，取所述血浆，边搅拌边加入无水氯化钙粉末，待所述无水氯化钙粉末完全溶解后静置0.8~1.2h，将凝结成果冻状的血
浆块打碎，5000rpm离心，上层澄清液体即为牛血清，下层乳黄色凝块为纤维蛋白，收集所述牛血清；C）加热提取：取所述牛血清用pH5.2~7.0 PBS缓冲液稀释2~10倍后放入带夹层的反应釜中，加入辛酸钠并搅拌使之完全溶解，再加入所述牛血清体积的5%~20%的乙醇，用1当量浓度的HCl调pH值至4.0~6.2，油浴加热，使反应釜中牛血清的温度保持在55~75℃，0.8~1.2h后取出反应液，压滤机压滤，收集滤液，弃掉滤渣；D）置换溶液和浓缩：将所述滤液用20000分子量以下的超滤装置过滤并将缓冲体系置换为pH8.0~8.5 Tris-HCl，同时进行浓缩；E）DEAE柱进一步纯化：装柱后用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡柱子，将超滤浓缩后的BSA溶液泵入层析柱中，并继续用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡，待接入纯化系统中的核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时，收集穿透组分，待穿透峰回落至基线后用含0.15M NaCl的pH8.0~8.5 Tris-HCl溶液洗脱，待核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时，收集洗脱组分并脱盐浓缩，得到脱盐浓缩后的洗脱组分；F）BSA剂型处理：取所述脱盐浓缩后的洗脱组分，加入防腐剂、络合剂，得到高纯BSA溶液，或直接进行冷冻干燥，得到BSA冻干粉。

[0008] 作为本发明的进一步改进是：步骤A）中所述抗凝剂采用浓度为3%~5%的柠檬酸三钠溶液。

[0009] 作为本发明的进一步改进是：步骤B）中所述加入无水氯化钙粉末的量为3~10g/L 血浆。

[0010] 作为本发明的进一步改进是：步骤C）中所述加入辛酸钠的量为1~10mmol/L血清。

[0011] 作为本发明的进一步改进是：步骤C）中所述乙醇的浓度为95%。

[0012] 作为本发明的进一步改进是：步骤A）和步骤B)在集中屠宰场分散操作，步骤C)、D)、E)、F)在洁净厂房集中操作，实现低成本生产与高质量的产品产出，以满足生物制药等行业对牛血清白蛋白严格的质量要求。

[0013] 本发明所用的柠檬酸三钠为抗凝剂，辛酸钠为牛血清白蛋白的保护剂，使牛血清白蛋白在温度55℃以上不变性。

[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：用料少，可节约投入；工艺流程短，省时省力；操作简单，重复性好，适合大批量生产；目标产品得率高、纯度高、质量好，本方法制得的成品牛血清白蛋白经过质量检验，产品质量完全符合现行行业质量标准，使用效果良好，可满足生化试剂与生物制药行业对牛血清白蛋白的质量要求；成本低，经济效益显著。

附图说明
[0015] 图1是本发明工艺流程图。

[0016] 图2是本发明一步沉淀法制备的BSA与其他生产厂家提供的同类别BSA纯度对比（12% SDS-PAGE）示意图，其中a~d 泳道：为某市售国外品牌的BSA (组分五，白蛋白含量98%)，浓度依次为7、6、5、4mg/ml；e 泳道为牛血清×10倍稀释；f、g 泳道为本法一次沉淀制得的BSA；h~l 为国内5家具备代表性的企业生产的BSA产品。

[0017] 图3是本发明层析处理后的BSA与某进口品牌BSA纯度对比（12% SDS-PAGE）示意图，其中A~F 泳道为某市售国外品牌的BSA (组分五，白蛋白含量98%)，A：4mg/ml，B：2mg/ ml，C：1mg/ml，D：0.8mg/ml，E：0.6mg/ml，F：0.4mg/ml；G为牛血清×15倍稀释；H、J为DEAE 层析处理后的BSA样品；I：滤渣；K：废液。

具体实施方式
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

[0019] 实施例一高纯度牛血清白蛋白的制备。

[0020] 高纯度牛血清白蛋白的制备，包括如下步骤：
A）分离血浆：取新鲜牛血，经严格的检疫，确保无感染疾病，加入血量体积的10%的抗凝剂，即浓度为3%~5%的柠檬酸三钠溶液，轻轻搅拌使抗凝剂分散均匀，4℃，1500rpm离心，分离收集血浆；
B）制备血清：室温下，取所述血浆，边搅拌边加入无水氯化钙粉末，加入无水氯化钙粉末的量为3~10g/L血浆，待所述无水氯化钙粉末完全溶解后静置0.8~1.2h，至容器内血浆完全凝结成果冻状，将凝结成果冻状的血浆块打碎，5000rpm离心，上层澄清液体即为牛血清，下层乳黄色凝块为纤维蛋白，收集所述牛血清；
C）加热提取：取所述牛血清用pH5.2~7.0 PBS缓冲液稀释2~10倍后放入带夹层的反应釜中，按1~10mmol/L血清加入辛酸钠，并搅拌使辛酸钠完全溶解，再加入所述牛血清体积的5%~20%的乙醇，用1当量浓度的HCl调pH值至4.0~6.2，油浴加热，使反应釜中牛血清的温度保持在55~75℃，0.8~1.2h后取出反应液，压滤机压滤，收集滤液，弃掉滤渣；
D）置换溶液和浓缩：将所述滤液用20000分子量以下的超滤装置过滤并将缓冲体系置换为pH8.0~8.5 Tris-HCl，同时进行浓缩；
E）DEAE柱进一步纯化：用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡层析柱，再用纯水淋洗干净，装入DEAE填料并用纯水冲洗压实；装柱后用5倍以上柱体积的pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡柱子，将超滤浓缩后的BSA溶液泵入层析柱中，并继续用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡，待接入纯化系统中的核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时，收集穿透组分，待穿透峰回落至基线后用含0.15M NaCl的pH8.0~8.5 Tris-HCl溶液洗脱，待核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时，收集洗脱组分并脱盐浓缩，得到脱盐浓缩后的洗脱组分；用0.5mol/L的NaOH溶液清洗层析柱后可以重复使用；
F）BSA剂型处理：取所述脱盐浓缩后的洗脱组分，加入防腐剂、络合剂，得到高纯BSA溶液，或直接进行冷冻干燥，得到BSA冻干粉。

[0021] 利用本发明制备的产品包装为密封瓶装或塑料袋装，保存温度小于等于20℃，本发明所用的柠檬酸三钠为抗凝剂，市售，辛酸钠为牛血清白蛋白的保护剂，使之在温度55℃以上不变性，市售，盐酸及乙醇为市售；对本发明制备的牛血清白蛋白进行检验，其质量检测结果见表一，从表一中可以看出，本发明的质量完全符合行业质量标准；对于本发明的产品，纯度用电泳法测定，如图2和图3所示，从图中可以看出，利用本发明制备的牛血清白蛋白杂质含量少、纯度较高。

[0022]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。

对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

图1
图2
图3。