包涵体蛋白质复性纯化

IEX Q Sepharose FF
Belew, M. et al. (1994) J.Chromatogr. A, 679: 67-83
GF Superdex 75 Prep Grade
E.g2:
大肠杆菌包涵体表达 (His)6 融
合蛋白的扩增，纯化和复性过程细胞培养 收获细胞 细胞破碎
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离心 5 - 10 000g
2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以 破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核 心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS 无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用 （研究）。
3.极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋 白。如在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白 酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。 这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
Market Proportion by Host Cells
(biopharmaceutical proteins or ”Pharmateins”)
Yeast: 28%
E. coli: 54%
Animal cell: 21% E. coli inclusion body route
occupies about a half
1.采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的 肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍 （GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用， 破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的 增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环 境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋 白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在 37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。
4.色谱复性：辅助手段，兼具分离。
4.1 凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒中 传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生 其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用， 并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢， 对有些蛋白质的复性有利。
4.2 吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、 亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本 复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸 附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附 的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的 蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。
破碎细胞 (Disruption of cell)
↓ 分离包涵体 (Seperation of inclusion body)
↓ 溶解包涵体 (Dissolve inclusion body)
↓ 蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)
HIC Phenyl Sepharose FF
Removes buffer constituents (GuanidineHCl, Berol 185, glutathione etc) •Purification factor: ca 2 •Recovery: 92% of activity •Concentration factor: ca 5
在室温等 30-60 分钟 在+4º C 离心 15 分钟 用 0.22 µ m 或 0.45 µ m 濾膜过滤
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准备 HiTrap™ Chelating 柱
冲洗 5 ml H2O 加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 冲洗 5 ml H2O 用 5-10 ml 20 mM Tris™ -HCl,
67833132过程33细细胞培养收收获细胞细细胞破碎离心10000g沉淀物沉淀物冲洗和离心冲洗和离心分离包涵体分离包涵体hitrapchelatinghitrapchelating纯化和复性溶解溶解包涵体细胞破碎冲洗和分离100ml培养液重新悬浮细胞沉ml20mmtrishclph80在冰浴情况下用超声震荡破碎细胞并在4c下高速离心10分钟urea的冲洗缓冲液和再度超声震荡并在4c下高速离心10分钟用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物34urea20mmtrishcl2tritonx10005nacl溶解和准备样品解缓冲液eg
5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍, 1 mM 2-巯基乙醇pH 8 结合缓冲液洗柱
最多 5 分钟
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纯化和复性
稀释样品, 用 10 ml 结合缓冲液洗柱，5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍, pH 8.0 上样，并以 20 mM咪唑, 6 M 尿素 pH 8.0 缓冲液洗柱
复性
线性梯度：~ 6 to 0 M 尿素 最少 30 柱体积 流速： 0.1 ml/min - 1 ml/min 用没有尿素缓冲液冲洗 5 个柱体积
2.重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多 越易形成包涵体
3.重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42℃）或 胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生 物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易 形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可 溶蛋白的比例。
沉淀物
分离包涵体 溶解
冲洗和离心
HiTrap™ Chelating ＋ Ni2+ 纯化和复性
包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离
2 M UREA 20 mM Tris HCl
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每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀 物於 4 ml 20 mM Tris™ -HCl pH 8.0
2% Triton X100 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细 胞，并在+4ºC下高速离心 10 分钟
包涵体：在某些生长条件下，基因工程菌能
积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚 在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构， 这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion B odies，IB）。
包涵体的组成及特性
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核 糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，环状或 缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小 为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、 盐酸胍等。
复性目的
复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中 间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展 状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除 还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。 对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时 复性过程已经结束。
蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键 和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处 的环境不同，使其复性条件大不相同。任何 一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有 选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正 确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利 完成。
Aggregate
Standard IB Renaturation Process
Cell Disruption
Centrifugation
Remove Cell Debris
IB Isolation IB Washing
Denaturant
Partial Removal of Denaturant
Intramolecular
Misfolding
S
S
S
S
Unfolded
3D Structure (Bioactive)
SS
S S
SS
S
SS S
S S
Intermolecular
Misfolding
Intermediate (molten globular)
S S SS
Correctly Folded
4.包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后复性 前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。
包涵体表达的不利因素
Disadvantages:
1. 对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。 2. 要求复杂和精确的复性过程 3. 复性过程的收率往往很低，经常成为放大的
瓶颈
分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤：
包涵体的复性前准备
洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋 白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前 要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如 2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、 1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂 TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
包涵体的溶解
脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折叠 中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/mL终浓
度下，溶菌酶复性收率可达80%以上。
2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低 外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不 适合大规模操作，无法应用到生产规模。
3. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许 变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的 使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情 况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性 （蛋白聚集于膜上）。
Complete Removal of Denaturant
Solubilization
Refolding
Post-refolding purification step
IB Dissolved Refolding
E.g1:rhGM-CSF fr E.coli inclusion bodies
Renatured rhGM-CSF
Solid-Phase (or Matrix-assisted) Refolding
Solubilized IB (unfolded)
Refolding Solution-state
Refolded Bioactive
monomer
IB in E. coli
Functional Group
Aggregate
复性过程中的添加剂
低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠， 但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加 折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产 率。可防止不可逆聚集体的出现。
盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，
在非变性浓度下是有效的促进剂。
In-Vitro Refolding Pathway
4.还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶 时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际， 还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关， 而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。 对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶， 有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二 硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含 e.g.
0.5 M NaCl
urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡
并在+4ºC下高速离心 10 分钟
用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物
溶解和准备样品
重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶 解缓冲液 (e.g.):
20 mM Tris™ -HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍, 1 mM 2-巯基乙醇pH 8
F
F
Solid-state refolding
Solid Support
Remove Denaturant
5.分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构 酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折 叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集 过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复 性。
体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加 入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是 将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮 助折叠。
包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为 蛋白过量表达的结果。
包涵体的形成
在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白 质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成 正确的次级键等原因形成的。
最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。
包涵体形成的主要原因
1.表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于 没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对， 过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的 溶解度等。
包涵体表达的有利因素
Advantages:
1.可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体 表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2.降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30%
3.包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心 就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合 剂EDTA去除金属离子。
蛋白质折叠的三态模型
(伸展态)U→(中间态)I→(自然态)N ↓
A（包涵体）
从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当 溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它 辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致 蛋白质的自发复性效率极低。
三、包含体蛋白复性方法
几个要求： 活性蛋白的回收率高 正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白
质分离。 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品 复性过程耗时少
复性常用方法
1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点 是体积增加较大，后续处理困难。
稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较 低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL。