迟钝爱德华菌PuAH基因的原核表达及其部分特性分析

迟钝爱德华菌PuAH基因的原核表达及其部分特性分析陈斌;池洪树;方勤美;许斌福;龚晖
【摘要】本试验旨在对迟钝爱德华菌EIB202 PuAH基因进行克隆表达,并对其部分特性进行分析.根据Gen-Bank中发表的迟钝爱德华菌PuAH基因序列(登录号:CP001135,CDS编号:ETAE 0818)设计引物,克隆并通过表达载体pET32a重组表达该基因所编码的蛋白,纯化表达产物并制备兔抗血清,采用ELISA、Western blotting、溶血试验、菌体凝集试验分析所得融合蛋白的特性.结果显示,所得融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达,蛋白分子质量约为42 ku;具有免疫原性和抗原性,对鳗鲡红细胞不具溶血性,但融合蛋白抗血清对迟钝爱德华菌EIB202膜蛋白提取物的溶血性有一定的抑制作用,且可以凝集迟钝爱德华菌EIB202菌体.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)010
【总页数】7页(P2573-2579)
【关键词】迟钝爱德华菌EIB202;PuAH基因;原核表达;抗血清
【作者】陈斌;池洪树;方勤美;许斌福;龚晖
【作者单位】福建农林大学动物科学学院,福州350002;福建省农业科学院生物技术研究所,福州350003;福建省农业科学院生物技术研究所,福州350003;福建省农业科学院生物技术研究所,福州350003;福建省农业科学院生物技术研究所,福州350003;福建省农业科学院生物技术研究所,福州350003
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
迟钝爱德华菌（Edwardsiella tarda，E.tarda）是一种人畜共患菌，是爱德华菌
属中唯一感染人的成员［1］。

淡水鱼类和海水鱼类都易感染该菌，如鲆鲽类、鳗鲡、真鲷、虹鳟、罗非鱼、斑点叉尾鮰等［2－3］。

迟钝爱德华菌是胞内寄生菌，了解其侵染机制，对制定科学的防控措施具有重要意义。

研究发现，迟钝爱德华菌存在众多的毒力因子，其中黏附因子、溶血素等在迟钝爱德华菌的侵染过程中发挥着重要的作用［4－5］。

Wang等［6］对迟钝爱德华菌强毒株EIB202的
全基因组进行测序，结果发现了一批潜在毒力基因，其中GenBank登录号为
CP001135（CDS编号：ETAE＿0818）的基因可能与迟钝爱德华菌黏附、溶血等功能相关，因此本试验将该基因命名为PuAH（putative adhesin hemagglutinin hemolysin）基因，为了进一步研究该基因所编码蛋白的特性，
本试验表达了该基因，制备了兔抗血清，并对融合蛋白的抗原性、免疫原性、溶血性等进行了分析。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒迟钝爱德华菌EIB202由华东理工大学阿华生物工程研究所提供；大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α 感受态细胞、E.coli BL21（DE3）受体菌及原核表达载体pET32a均由福建省农业科学院生物技术研究所保存；pMD19－T 载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 工具酶和试剂 r Taq DNA 聚合酶、DL2000DNA Marker、限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ、T4DNA ligase等均购自宝生物工程（大连）有限公司；Ultra Power TM 核酸染料购自北京百泰克生物科技有限公司；动物基因组DNA 抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA 胶回收试剂盒、UNIQ－10柱式质粒小量抽提
试剂盒、氨苄青霉素（Amp）、IPTG 等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Ni－NTA His－bind Resin Purification Kit购自Novagen公司；羊抗兔IgG－HRP、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；迟钝爱德华菌EIB202全菌蛋白多克隆抗体由福建省农业科学院生物技术研究所水产病害研究室制备；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 试验动物 2kg雄性新西兰大白兔购自上海市松联实验动物厂；健康欧洲鳗鲡购自福州大学养殖实验场。

1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成参照GenBank中迟钝爱德华菌基因序列，利用生物学软件Primer Premier 5.0和Oligo 7.37进行序列分析并设计1对特异性引物。

引物序列：上游引物：5′－GGATCCGTGGAGAATAATTTACTCG－3′；下游引物：5′－AAGCTTTCATTCCCCCACTTC－3′，上、下游引物中的斜体部分为酶切位点，对应的限制性内切酶分别为BamHⅠ和Hind Ⅲ。

引物由福州顺好生物技术有限公司合成。

1.2.2 基因克隆及表达载体构建按照动物基因组DNA 抽提试剂盒说明书提取迟钝爱德华菌EIB202全基因组DNA，以其为模板进行PCR 扩增。

PCR 反应体系
25μL：模板2μL，dNTP Mixture（10 mmol／L）2 μL，r Taq DNA 聚合酶（5U／μL）0.5μL，上、下游引物（10 μmol／L）各1μL，10×Ex Taq Buffer （含2.0mmol／L Mg2＋）2.5μL，ddH2O 16μL。

PCR 反应条件：94 ℃预变性10min；94 ℃变性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，35个循环；72 ℃总延伸10 min。

回收纯化PCR 产物，与pMD19－T 载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR 扩增、双酶切和测序鉴定，用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切目标基因片段，连接到经同样酶双酶切的原核表达载体pET32a上，转化E.coli BL21（DE3）受体菌，Amp选择阳性克隆，提取质粒经PCR 扩增和双酶切
初步鉴定后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定，重组质粒命名为pET32a－PuAH，重组菌命名为E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH。

1.2.3 融合蛋白的表达及纯化将E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH 接种于含Amp（100μg／L）的LB营养肉汤，37 ℃、200r／min摇床中摇菌过夜（12～16h）；次日将活化菌液按1∶100接种于新鲜的含Amp（100μg／L）的LB营
养肉汤扩大培养3h至菌液D600nm 为0.6～0.8 时，1 mmol／L IPTG 诱导7h；
10 000r／min离心10min，弃上清，菌体沉淀用0.01mol／L PBS（pH 7.4）（本试验中所用PBS均为此浓度和pH）洗涤两次并重悬；超声破碎（功率400 W，工作10s，间隔15s，50 个循环），过0.45μm滤器，取一部分作为全菌蛋白，另一部分10 000r／min条件下离心15min，收集上清，沉淀用等体积PBS
重悬。

相同方法提取E.coli BL21（DE3）全菌蛋白、E.coli BL21（DE3）／
pET32a未经诱导全菌蛋白、E.coli BL21（DE3）／pET32a经诱导全菌蛋白、
E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH 未经诱导全菌蛋白作为对照组，SDS－PAGE 电泳分析蛋白表达情况。

取菌体裂解上清，按照Ni－NTA His－bind Resin Purification Kit说明书进行纯化，通过透析脱盐的方式使蛋白复性，BCA
法测定蛋白浓度并进行SDS－PAGE电泳验证。

1.2.4 兔抗血清的制备及效价测定参照莎姆布鲁克等［7］介绍的方法制备兔抗血清，采用4次免疫，每次免疫剂量为300μg，首免加弗氏完全佐剂乳化，次免加
弗氏不完全佐剂乳化，三免和四免不加佐剂，四免后收集血清，于－40 ℃保存备用。

间接ELISA 法测定兔抗血清效价：包被原为20μg／mL的融合蛋白，一抗为PBS倍比稀释的兔免前血清和兔抗血清（起始稀释度均为1∶1 000），二抗为羊
抗兔IgG－HRP（PBS缓冲液1∶2 000稀释），OPD 显色，酶标仪测定492nm 处的D 值。

同法测定兔抗血清对迟钝爱德华菌EIB202外膜蛋白（OMP）的抗体
效价。

1.2.5 Western bloting分析融合蛋白免疫原性和抗原性取E.coli BL21（DE3）
全菌蛋白、E.coli BL21（DE3）／pET32a经诱导全菌蛋白、纯化的融合蛋白、迟钝爱德华菌EIB202OMP进行SDS－PAGE电泳，半干转印法将蛋白条带转移至
醋酸纤维素（NC）膜上，Western blotting分析融合蛋白免疫原性。

其中一抗为兔抗血清（PBS缓冲液1∶2 000稀释），二抗为羊抗兔IgG－HRP（PBS 缓
冲液1∶10 000稀释），显色底物为DAB。

参照以上步骤，以迟钝爱德华菌
EIB202 全菌蛋白多克隆抗体为一抗，Western blotting分析融合蛋白抗原性。

1.2.6 融合蛋白的溶血性分析采购健康欧洲鳗鲡，参照涂小林等［8］介绍的方法
制备1%红细胞悬液，加入96孔微量板，每孔50μL。

以PBS为空白对照，E.coli BL21（DE3）全菌蛋白为阴性对照，迟钝爱德华菌EIB202OMP提取物为阳性对照，融合蛋白为试验组，各组均设平行组，各蛋白初始浓度均调整为0.265 mg／mL，用PBS 倍比稀释后加入96孔微量板，每孔50μL，与等量1%欧洲鳗鲡红细胞混匀，37 ℃水浴1h，4℃静置16h观察。

以溶解50%红细胞的最高稀释度为
溶血价。

参照以上方法做溶血抑制试验，于96孔微量板中用PBS倍比稀释迟钝爱德华菌EIB202 OMP，分别加入等体积1∶20稀释的兔免前血清和兔抗血清（均56 ℃补体灭活30min），37 ℃孵育1h后，再加1%欧洲鳗鲡红细胞，观察溶血抑制效果。

1.2.7 菌体凝集试验取10mL过夜培养迟钝爱德华菌EIB202菌液，3 000r／min
离心10min，取沉淀，PBS洗涤并重悬，调D600nm为1.0，0.4%福尔马林灭活，4 ℃保存备用。

以PBS 为空白对照，兔免前血清为阴性对照，兔抗血清为试验组，血清经补体灭活和E.coli BL21（DE3）菌体吸附后，用PBS倍比稀释25倍，各
取25μL血清与菌体悬液，吹打混匀，37 ℃培养箱中静置10min，观察凝集结果。

2 结果与分析
2.1 PuAH 基因的克隆及质粒构建
PCR扩增获得大小约700bp的片段（图1），与预期大小一致。

重组克隆载体和重组表达载体的PCR鉴定和双酶切鉴定结果均表明目的片段分别与pMD19－T 载体和pET32a载体成功连接（图2、3）。

图1 迟钝爱德华菌EIB202 PuAH 基因的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplification of E.tarda EIB202 PuAHgeneM，DL2000DNA Marker；1，阴性对照；2，迟钝爱德华菌EIB202 PuAH 基因PCR 产物M，DL2000 DNA Marker；1，Negative control；2，PCR product of E.tarda EIB202 PuAH gene
图2 重组克隆载体pMD19－T－PuAH 的PCR 和双酶切鉴定电泳图Fig.2 Identification of recombinant clone vector pMD19－T－PuAH by PCR and double enzyme digestionM，DL2000 DNA Marker；1，重组克隆载体pMD19－TPuAH 的双酶切产物；2，重组克隆载体pMD19－T－PuAH的PCR 产物M，DL2000 DNA Marker；1，Double enzyme digestion product of recombinant clone vector pMD19－T－PuAH；2，PCR product of recombinant clone vector pMD19－T－PuAH
2.2 融合蛋白的表达及纯化
PuAH 基因编码一个含226 个氨基酸残基的蛋白，预测分子质量为23.5ku，带His标签的融合蛋白分子量理论值约为43.9ku，SDS－PAGE 电泳结果显示，经IPTG 诱导E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH 全菌裂解产物在约42ku处出现明显条带，与预期大小相近，而对照组无此条带（图4）。

薄层扫描分析结果表明，表达的融合蛋白占菌体蛋白的30%以上。

对比菌体裂解沉淀和裂解上清电泳结果，结果发现表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在（图5）。

菌体裂解上清蛋白纯化后仅有分子质量约为42ku的单一条带（图6），BCA 法测定蛋白浓度为339μg／mL。

图3 重组表达载体pET32a－PuAH 的PCR 和双酶切鉴定电泳图Fig.3 Identification of recombinant expression vector pET32a－PuAH by PCR and double enzyme digestionM，DL10000DNA Marker；1，重组表达载体
pET32a－PuAH 的双酶切产物；2，重组表达载体pET32a－PuAH 的PCR产物M，DL10000DNA Marker；1，Double enzyme digestion product of recombinant expression vector pET32a－PuAH；2，PCR product of recombinant expression vector pET32a－PuAH
图4 SDS－PAGE分析融合蛋白的表达Fig.4 SDS－PAGE analysis of the expression of fusion proteinM，蛋白质分子质量标准；1，E.coli BL21（DE3）；2，未诱导E.coli BL21（DE3）／pET32a；3，经诱导E.coli BL21（DE3）／pET32a；4，未诱导E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH；5，经诱导E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAHM，Protein Molecular Weight Marker；1，E.coli BL21（DE3）；2，Not induced E.coli BL21（DE3）／pET32a；3，Induced E.coli BL21（DE3）／pET32a；4，Not induced E.coli BL21（DE3）
／pET32a－PuAH；5，Induced E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH
图5 SDS－PAGE分析融合蛋白的表达形式Fig.5 SDS－PAGE analysis of the solubility of fusion proteinM，蛋白质分子质量标准；1，经诱导的E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH 裂解上清；2，经诱导的E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH 裂解沉淀M，Protein Molecular Weight Marker；1，Cell lysates supernatant of induced E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH；2，Cell lysates precipitation of induced E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH
图6 纯化融合蛋白的SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE analysis of the purified fusion proteinM，蛋白质分子质量标准；1，经诱导的E.coli BL21（DE3）／pET32a－PuAH 裂解上清；2，纯化的融合蛋白M，Protein
Molecular Weight Marker；1，Cell lysates supernatant of induced E.coli
BL21（DE3）／pET32a－PuAH；2，Purified fusion protein
2.3 兔抗血清效价测定
间接ELISA 法测定兔抗血清针对融合蛋白和迟钝爱德华菌EIB202OMP 的抗体效价，以（阳性血清D492nm－空白对照D492nm）／（阴性血清D492nm－空白对照D492nm）≥2.1为阳性判断依据，结果显示兔抗血清针对融合蛋白的抗体效价为1∶1 024 000（P／N=3.000）；兔抗血清针对迟钝爱德华菌
EIB202OMP 的抗体效价为1∶128 000（P／N=2.284）（图7）。

图7 间接ELISA检测兔抗血清效价Fig.7 Rabbit antiserum titer detected by indirect ELISAa，融合蛋白为抗原，兔抗血清为一抗；b，迟钝爱德华菌
EIB202OMP为抗原，兔抗血清为一抗；c，融合蛋白为抗原，兔免前血清为一抗；d，迟钝爱德华菌EIB202OMP为抗原，兔免前血清为一抗a，Fusion protein as antigen and rabbit antiserum as primary antibody；b，E.tarda EIB202OMP as antigen and rabbit antiserum as primary antibody；c，Fusion protein as antigen and rabbit negative serum as primary antibody；d，E.tarda
EIB202OMP as antigen and rabbit negative serum as primary antibody
2.4 融合蛋白免疫原性和抗原性分析
Western blotting分析结果显示，兔抗血清能特异性识别融合蛋白，同时还可识
别迟钝爱德华菌EIB202OMP中分子质量约为23.5ku的蛋白条带（图8），结合兔抗血清效价测定结果可知，原核表达的融合蛋白具有较好的免疫原性；而迟钝爱德华菌EIB202 全菌蛋白多克隆抗体同样能识别纯化的融合蛋白（图9），说明原核表达的融合蛋白具有较好的抗原性。

图8 Western blotting分析融合蛋白免疫原性Fig.8 The immunogenicity analysis of fusion protein by Western blottingM，蛋白质分子质量标准；1，
迟钝爱德华菌EIB202OMP；2，纯化的融合蛋白；3，经诱导的E.coli BL21
（DE3）／pET32a全菌蛋白M，Protein Molecular Weight Marker；1，
E.tarda EIB202 OMP；2，Purified fusion protein；3，Bacterial protein of induced E.coli BL21（DE3）／pET32a
2.5 融合蛋白溶血性分析
溶血试验结果显示，迟钝爱德华菌EIB202 OMP 提取物具有溶血性，溶血效价为1.21×103 HU／mg，而融合蛋白不具有溶血性；但在溶血抑制试验中，用兔免前血清和兔抗血清对迟钝爱德华菌EIB202OMP进行中和后，其溶血效价分别降低
为3.02×102 和1.51×102 HU／mg（图10），兔抗血清的溶血抑制作用强于兔免前血清。

图9 Western blotting分析融合蛋白抗原性Fig.9 The antigenicity analysis of fusion protein by Western blottingM，蛋白质分子质量标准；1，迟钝爱德华
菌EIB202OMP；2，纯化的融合蛋白M，Protein Molecular Weight Marker；1，E.tarda EIB202 OMP；2，Purified fusion protein
2.6 菌体凝集试验结果
在凝集试验中，兔抗血清对迟钝爱德华菌EIB202 菌体有明显的凝集效果，而兔免前血清的凝集效果不明显，接近PBS空白对照组（图11）。

图10 兔抗血清溶血抑制试验Fig.10 Hemolysis inhibition test of rabbit antiseruma，PBS；b，兔免前血清；c，兔抗血清a，PBS；b，Rabbit negative serum；c，Rabbit antiserum
图11 迟钝爱德华菌EIB202菌体凝集试验Fig.11 Bacterial agglutination test of E.tarda EIB202a，25倍稀释兔抗血清；b，25倍稀释兔免前血清；c，PBSa，25－fold diluted rabbit antiserum；b，25－fold diluted rabbit negative serum；c，PBS
3 讨论
迟钝爱德华菌是一种胞内寄生的人畜共患菌，宿主种类多、危害范围广，而胞内寄生的特性导致了其防控难度大，有必要深入研究该菌的致病机制及其侵染过程中发挥重要作用的毒力因子，为高致病力病原菌的检测和免疫防控提供参考依据。

黏附是迟钝爱德华菌侵染宿主细胞的第一步，参与此过程的毒力因子包括黏附因子、溶血素等。

目前对黏附因子的研究已取得一定进展：Sakai等［9］克隆了迟钝爱
德华菌的一个菌毛亚基（FimA）基因，大小为19.3ku，并证明该基因与血凝作用相关，在细菌的黏附和侵入过程中发挥作用。

Tan 等［10］研究发现鞭毛蛋白是
迟钝爱德华菌的一种胞外毒力相关蛋白，直接参与该菌的侵染过程，并首次对迟钝爱德华菌的鞭毛蛋白基因进行了测序。

Wang等［5］发现EthA 溶血素可通过参
与宿主细胞微丝的重排而介导细菌侵入细胞，类似的报道还有很多。

而本试验所研究的迟钝爱德华菌EIB202 PuAH 基因即被推测与黏附、溶血、凝集等功能相关，通过NCBI数据库基因比对发现，该基因与迟钝爱德华菌TX01的Eta1基因（GenBank登录号：JN802138）的同源性为99%，Sun等［11］通过体内诱导抗原技术、基因缺失突变等方法对TX01的Eta1基因进行了鉴定，指出Eta1基
因编码的蛋白位于菌体外膜并暴露在表面，在细菌侵染初期上调，是参与病原菌与宿主相互作用的体内诱导抗原，并推测为细菌的黏附素。

原核表达载体pET32a所携带的硫氧还蛋白标签（trx－tag）有利于提高目标蛋白的表达量，可促进二硫键的形成，增加蛋白的可溶性。

已有较多利用该载体实现融合蛋白可溶性表达的报道［12－15］。

为进一步验证迟钝爱德华菌EIB202 PuAH 基因的特性，本试验也利用原核表达载体pET32a获得了融合蛋白，该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于菌体裂解上清中；Western blotting证明了该蛋白具有
较好的抗原性和免疫原性，但兔抗血清可同时识别迟钝爱德华菌EIB202OMP的
多个条带，造成此现象的原因可能是PuAH 基因所编码的蛋白和其他OMP间存
在共同的抗原表位；融合蛋白与天然蛋白构象间可能存在差异，导致其未表现出溶血特性，但兔抗血清可部分抑制迟钝爱德华菌EIB202OMP提取物对1%欧洲鳗鲡红细胞的溶血，因此推测PuAH 基因可能与溶血功能相关，由于OMP 提取物中
可能含有多种溶血成分，所制备的兔抗血清不能识别所有的溶血成分，导致只能部分抑制溶血；菌体凝集试验结果显示，兔抗血清凝集价高于兔免前血清，推测PuAH 基因所编码的蛋白可能存在与凝集相关的抗原表位并具有免疫原性。

本试验克隆表达了迟钝爱德华菌EIB202 PuAH 基因，证实了融合蛋白具有较好的抗原性和免疫原性，同时初步验证了该基因可能与溶血和凝集相关。

为该基因特性的研究及迟钝爱德华菌侵染机制的研究提供了参考数据。

基于本试验的结果，下一步将通过制备融合蛋白的特异性单克隆抗体并纯化迟钝爱德华菌PuAH 编码蛋白，对该基因特性进行更深入的研究。

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