重叠pcr

如下图所示:以融合A,B两基因为例具体说
明,A,B两基因可以相同也可以不同,先分别 用F1,R1和F2,R2两对引物扩增出A基因和B 基因,然后再用F1和R2将两基因连接起来, 得到A,B的融合基因. 也可以设计多对引物, 融合多个基因
4 重叠pcr应用
4.1
构建突变基因 在重叠延伸PCR 中，两个重叠的DNA 片段是分别 从两个独立的PCR 扩增反应得到的。预设突变构建 在重叠区域，存在于两个扩增片段中。设计4 种引 物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序列 的DNA 片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及 其下游序列的DNA 片段，两个侧翼引物含野生型序 列，两个突变引物含有希望引进的突变位点，如置 换插入或缺失。混合两次PCR 的产物，由于两个突 变引物有重叠区，重叠片段之间退火，延伸成异源 双链，加入外侧引物进行第三次PCR，即可得到目 标突变体。
5 重叠延伸PCR构建长片段的
注意事项
5. 1
设计引物的注意事项 相连引物间的重叠区域以15～20个碱基为宜,重叠 区 域 中 应 尽 量 避 免 富 含 AT(ATTTA,AATAA 、 AATTAA等)的序列. 在片段合成过程中,接头区富 含AT的区域极易发生错配. 同时在引物设计中,除 了需考虑一般PCR引物设计的问题外,在Tm值的 控制方面,建议设计的全部引物最好有相同或相近 的Tm值,以便融合扩增步骤的顺利进行,否则可能 会导致引物无法组合使用,这是引物设计的关键,并 且尽量避免出现二级结构及引物二聚体等。
4.2 构建融合基因
重叠延伸PCR 法还可以用于两个或两个以上异源 基因DNA 片段的拼接 。如同致突变引物一样， SOE 引物亦含有末段互补序列，通过PCR 产生 的两个DNA 片段可通过引物延伸进行剪接和扩增， 从而获得重组体。与定点突变不同的是：一是待 融合的PCR 产物来自两个不同的基因；二是通过 SOE 引物在两种PCR 产物中产生相互重叠的链 进而获得融合基因
PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点 突变,操作非常简便,可以利用这一技术很快获 得利用内切酶消化的方法难以得到的产物,可 用于大片段基因的人工合成,且成功率非常高
(2) 此技术可以将任意的两个目的基因拼接
连接形成2个目的基因的融合基因,中间无任 何非目的基因的DNA序列,这样就避免因加 入连接序列可能出现的非目的基因序列,从 而在体外就可得到高质量的目的基因序列.
(3) 此技术可以得到短至几十碱基和长至20
以上的片段,弥补了一般PCR对短于100bp 和长几十片段的重组几乎无能为力的缺憾, 极大地丰富了PCR技术的扩增范围,并且在 获得长片段DNA方面,省去了常规亚克隆的 烦琐工作
3
引物的设计
采用一段已知的500～600bp碱基的DNA片
段为PCR模板,根据所要合成的DNA序列可 以设计一系列的PCR嵌合引物对,长度为 50～60bp,且从5′到3′方向顺序重叠,重叠碱 基数目为25～30bp,通过多重PCR全部引物 叠加所得到的DNA正是自己所要合成的长片 段DNA.
5.2
DNA聚合酶的选择 重叠延伸PCR为多重扩增,极易发生碱基错 配,要最大限度地避免碱基的错配,重叠延伸 PCR反应一般采用高保真DNA聚合酶.应避 免使用普通Taq酶,因其在PCR产物3′末端添 加一个突出A,从而造成移码. 最好使用具有 3′外切纠错功能的高保真DNA聚合酶,可以 保证嵌合序列正确的ORF
5. 3
热循环条件 对于重叠延伸PCR反应,循环不宜过多,变性的温度 也不宜过高. 考虑到DNA聚合酶的扩增效率、错 配率,每一轮反应的循环数控制在20～35个为宜。 高温会使DNA受到损伤,造成DNA酶终止合成。 反应的退火温度也要根据引物而定,在保证产物扩 增效率的前提下,应尽量提高退火温度以提高产物 的特异性,为下一轮PCR反应提供高质量的模板, 从而降低反应的错配率 在具体实验过程中,可采用 梯度PCR的方法来摸索最佳退火温度,优化反应体 系。

5. 4
其他影响因素 在具体的实验设计和操作过程中,一些小的 细节方面的问题需要仔细的考虑,比如多次 PCR体系的优化、PCR模板的浓度以及融 合基因模板的比例等,这些问题的处理都可 能直接导致实验的成功与否
6 展望
SOE PCR 的关键不仅仅在反应操作中，而
主要在于引物的设计。通过设计特定的搭桥 引物，将两个目的序列融合在一起，避免了 不必要地酶切和连接。更重要的是，重叠延 伸对融合位点及其附近序列没有特殊要求， 融合部位可以是任意位点，只要根据相应原 理设计好搭桥引物就可以按照常规PCR 轻松 操作。因此，此技术会在越来越多的实验室 得到广泛的应用
反应的退火温度也要根据引物而定在保证产物扩增效率的前提下应尽量提高退火温度以提高产物的特异性为下一轮pcr反应提供高质量的模板从而降低反应的错配率在具体实验过程中可采用梯度pcr的方法来摸索最佳退火温度优化反应体其他影响因素在具体的实验设计和操作过程中一些小的细节方面的问题需要仔细的考虑比如多次pcr体系的优化pcr模板的浓度以及融合基因模板的比例等这些问题的处理都可能直接导致实验的成功与否soepcr的关键不仅仅在反应操作中而主要在于引物的设计
重叠延伸PCR
1 原理
重叠延伸PCR 技术由于使用了具有互补末
端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，从 而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸， 将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA 片段连在一起，用 于嵌合基因的构建；
2 重叠延伸PCR的特点
(1) 不需 要 内切酶消化和连接酶 处理 , 利 用