特异性结合人的5T4抗原的全人源单域抗体及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611040981.8
(22)申请日 2016.11.23
(71)申请人 复旦大学
地址 200433 上海市杨浦区邯郸路220号
(72)发明人 应天雷　姜世勃　吴艳玲　周辰　
(74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事
务所(普通合伙) 31268
代理人 吴桂琴
(51)Int.Cl.
C07K 16/30(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/62(2006.01)
C12N 15/13(2006.01)
C12N 15/63(2006.01)
A61K 39/395(2006.01)
A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称
特异性结合人的5T4抗原的全人源单域抗体
及其应用
(57)摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性
结合人的5T4的全人源单域抗体和其抗原结合片
段，以及它们的应用，如癌症的诊断和治疗。

本发
明公开了针对人的癌胚抗原5T4(h5T4)的全人源
单域抗体及其抗原结合片段。

其主要特征在于此
单域抗体是由存在于抗体重链基因可变区中的
互补决定区(complementarity-determining
region，CDR )特异性基因序列决定的，并在原核
和真核细胞中获得有效表达的特异性结合5T4的
抗体。

利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原
核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不
同形式的基因工程抗体，可用于制备在临床上诊
断或治疗肿瘤相关疾病的制剂。

权利要求书2页 说明书4页序列表5页 附图1页CN 108084265 A 2018.05.29
C N 108084265
A
1.一种针对h5T4的全人源单域抗体，或抗原结合片段，其特征在于，其包含：
抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1的26-33位，51-58位，和/或97-109位氨基酸残基；或
抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:5的26-33位，51-58位，和/或97-109位氨基酸残基,其中单域抗体或抗原结合片段特异性结合h5T4。

2.按权利要求1所述的单域抗体或抗原结合片段，其特征在于，包含：
抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1的26-33位，51-58位，和/或97-109位氨基酸残基；或
抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:5的26-33位，51-58位，和/或97-109位氨基酸残基。

3.按权利要求1或权利要求2所述的单域抗体或抗原结合片段，其特征在于，
其中，
重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的相同性；或
重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少90％的相同性。

4.按权利要求1-3中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中的单域抗体或抗原结合片段是全人源的。

5.按权利要求1-4中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中的单域抗体为VH，抗原结合片段为VH。

6.一种双特异性抗体，含有权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段。

7.按权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，或权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，与一种效应分子偶联。

8.按权利要求7所述的免疫偶联物，其特征在于，其中的效应分子是可检测标记。

9.按权利要求8所述的免疫偶联物，其特征在于，其中的可检测标记是荧光标记，放射性标记，亲和素，生物素，或酶。

10.按权利要求7所述的免疫偶联物，其特征在于，其中的效应分子是毒素或化疗剂。

11.按权利要求10所述的免疫偶联物，其特征在于，其中的毒素是绿脓杆菌外毒素或其变体。

12.一种融合蛋白，其包含权利要求1-5中任一项所述的单域抗体和异源蛋白。

13.按权利要求12所述的融合蛋白，其特征在于，其中异源蛋白是人的Fc。

14.一种核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，权利要求6所述的双特异性抗体，权利要求7-11中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求12或权利要求13所述的融合蛋白。

15.按权利要求14所述的核酸分子，其特征在于，可操作地连接至启动子。

16.一种质粒，其含有权利要求14或权利要求15所述的核酸分子。

17.按权利要求16所述的质粒，其特征在于，其中质粒是一种病毒质粒。

18.一种宿主细胞，其特征在于，可转化权利要求14所述的核酸分子或权利要求16-17所述的质粒。

19.一种药用组合物，其特征在于，含有有效治疗剂量的权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，权利要求6所述的双特异性抗体，权利要求7-11中任一项所述的免疫偶联物，权利要求12或权利要求13所述的融合蛋白，权利要求14-15中任一项所述的核
酸，或权利要求16-17中任一项所述的质粒和一种药学可接受载体。

20.在受试对象中治疗表达5T4的癌症的方法，其特征在于，包含选择患有表达5T4的癌症的受试对象，并向所述的受试对象施用治疗有效剂量的权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，权利要求6所述的双特异性抗体，权利要求7-11中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求12或权利要求13所述的融合蛋白，从而抑制肿瘤的生长和转移。

21.确定受试对象是否患有癌症的方法，其特征在于，包含：
含有来自受试对象的样本，及有效剂量的权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，权利要求6所述的双特异性抗体，权利要求7-11中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求12或权利要求13所述的融合蛋白，并检测单域抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，免疫偶联物或融合蛋白与样本的结合。

其中，与所述抗体和对照样本的结合相比，所述抗体与所述样本的结合的增加确定受试对象患有癌症。

22.确定受试对象的癌症诊断结果的方法，其特征在于，包含：
来自被诊断患有癌症的受试对象的样本，及有效剂量的权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或抗原结合片段，权利要求6所述的双特异性抗体，权利要求7-11中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求12或权利要求13所述的融合蛋白，检测单域抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，免疫偶联物或融合蛋白与样本的结合。

其中，与所述抗体和对照样本的结合相比，所述抗体与所述样本的结合的增加确定受试对象的癌症诊断结果。

23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其特征在于，其中所述的癌症是间皮素瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴性乳腺癌或卵巢癌。

特异性结合人的5T4抗原的全人源单域抗体及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合人的5T4的全人源单域抗体和其抗原结合片段，以及它们的应用，如癌症的诊断和治疗。

背景技术
[0002]基于抗体的免疫治疗在治疗多种癌症中是非常有效的，而开发成功的免疫治疗主要取决于发现肿瘤细胞中优先表达的细胞表面蛋白的抗体。

研究显示了胚胎滋养层细胞和恶性肿瘤细胞具有一些共同的生理过程，包括局部组织的入侵和免疫监视的逃逸，这一特性使得许多在滋养层细胞和肿瘤细胞共同表达的抗原被发展为肿瘤特异性免疫治疗的靶点，其中人的5T4抗原，是表达于胚胎滋养层细胞的糖蛋白，在多种实体瘤中高度表达，而正常组织中却很少存在，被认定是一种肿瘤相关抗原。

据报道，对于肠癌，胃癌和卵巢癌患者，相关研究表明肿瘤的恶性程度和预后性与5T4的表达程度密切相关。

有研究通过比较人类和小鼠的5T4序列，发现该分子在两个物种之间是高度保守的，跨膜区域和胞质部分的氨基酸一致性水平达到81％。

因此，5T4蛋白是这些肿瘤特异性免疫治疗的潜在靶点。

[0003]基于现有技术的基础，本申请的发明人拟提供特异性结合人的5T4抗原的全人源单域抗体及其应用。

[0004]与本发明相关的现有技术有，
[0005][1]Zhao Y,Wang Y.5T4oncotrophoblast glycoprotein:janus molecule in life and a novel potential target against tumors.Cell Mol Immunol,2007；4(2): 99-104.
[0006][2]Southall PJ,Boxer GM,Bagshawe KD,et al.Immunohistological distribution of 5T4antigen in normal and malignant tissues.Br J Cancer.1990；61(1):89-95.
[0007][3]Ying T,Du L,Ju TW,et al.Exceptionally potent neutralization of Middle East respiratory syndrome coronavirus by human monoclonal antibodies.J Virol.2014；88(14):7796-805.。

发明内容
[0008]本发明的目的在于基于现有技术的基础，提供特异性结合人的5T4抗原的全人源单域抗体及其应用。

[0009]本发明公开了特异性结合h5T4的全人源单域抗体。

本发明的全人源单域抗体包括n501和n502。

本发明还公开了这些抗体的抗原结合片段，双特异性抗体，与效应分子的免疫偶联物，及融合蛋白。

[0010]本发明进一步提供了上述的抗体和组合物用于制备肿瘤的诊断或治疗制剂中的用途。

[0011]在本发明的一些实施方案中，所述的单域抗体重链可变区的氨基酸序列，包含至
少一个(如三个)n501和n502的重链可变区的CDR区；其中，
[0012]SEQ ID NO:1是n501重链可变区的氨基酸序列；
[0013]SEQ ID NO:2是n501重链可变区CDR1的氨基酸序列；
[0014]SEQ ID NO:3是n501重链可变区CDR2的氨基酸序列；
[0015]SEQ ID NO:4是n501重链可变区CDR3的氨基酸序列；
[0016]SEQ ID NO:5是n502重链可变区的氨基酸序列；
[0017]SEQ ID NO:6是n502重链可变区CDR1的氨基酸序列；
[0018]SEQ ID NO:7是n502重链可变区CDR2的氨基酸序列；
[0019]SEQ ID NO:8是n502重链可变区CDR3的氨基酸序列。

[0020]此外，本发明还公开了编码这些单域抗体和抗原结合片段的核酸序列，在一些实施方案中，公开了包含这些核酸的载体，及包含这些载体的宿主细胞；在进一步的实施方案中，公开了包含这些单域抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，免疫偶联物，融合蛋白，核酸，和载体的药用组合物；在其它实施方案中，这些单域抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，免疫偶联物，融合蛋白，核酸，和载体被用来制备诊断或治疗肿瘤的制剂。

[0021]本发明中，所述的针对h5T4的全人源单域抗体，或抗原结合片段，包含：
[0022]抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1的26-33位，51-58位，和/或97-109位氨基酸残基；或
[0023]抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:5的26-33位，51-58位，和/或97-109位氨基酸残基,
[0024]其中单域抗体或抗原结合片段特异性结合h5T4。

[0025]本发明中，所述的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的相同性；或重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少90％的相同性。

[0026]本发明中，所述的单域抗体或抗原结合片段，其中的单域抗体或抗原结合片段是全人源的，优选的，其中的单域抗体为VH，抗原结合片段为VH。

[0027]本发明提供了一种双特异性抗体，含有所述的单域抗体或抗原结合片段；所述的双特异性抗体，含有所述的单域抗体或抗原结合片段与一种效应分子偶联；其中的效应分子是可检测标记，其中的可检测标记是荧光标记，放射性标记，亲和素，生物素，或酶；优选的，其中的效应分子是毒素或化疗剂，优选的，其中的毒素是绿脓杆菌外毒素或其变体。

[0028]本发明提供了一种融合蛋白，包含所述的单域抗体和异源蛋白，所述的融合蛋白，其中异源蛋白是人的Fc。

[0029]本发明提供了一种核酸分子，其编码所述的单域抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的免疫偶联物，或所述的融合蛋白；所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。

[0030]本发明提供了一种质粒，含有所述的核酸分子；优选的，所述质粒是一种病毒质粒。

[0031]本发明提供了一种宿主细胞，可转化所述的核酸分子或所述的质粒。

[0032]本发明还提供了一种药用组合物，含有有效治疗剂量的所述的单域抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的免疫偶联物，所述的融合蛋白，所述的核酸，或所述的质粒和一种药学可接受载体。

[0033]本发明还提供了在受试对象中用于干预表达5T4的肿瘤细胞的方法，包含选择患有表达5T4的癌症的受试对象，并向所述的受试对象施用治疗有效剂量的所述的单域抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的免疫偶联物，或所述的融合蛋白，从而抑制肿瘤细胞的生长和转移。

[0034]本发明还提供了确定受试对象是否患有癌症的方法，包含：
[0035]含有来自受试对象的样本，及有效剂量的所述的单域抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的免疫偶联物，或所述的融合蛋白，并检测单域抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，免疫偶联物或融合蛋白与样本的结合；其中，与所述抗体和对照样本的结合相比，所述抗体与所述样本的结合的增加确定受试对象有肿瘤存在。

[0036]本发明还提供了确定受试对象的肿瘤半段结果的方法，包含：
[0037]来自被诊断患有癌症的受试对象的样本，及有效剂量的所述的单域抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的免疫偶联物，或所述的融合蛋白，检测单域抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，免疫偶联物或融合蛋白与样本的结合，其中，与所述抗体和对照样本的结合相比，所述抗体与所述样本的结合的增加确定受试对象的肿瘤类型；所述的肿瘤类型是间皮素瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴性乳腺癌或卵巢癌。

[0038]本发明主要公开了针对h5T4的新型全人源单域抗体。

利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，可在临床上用于制备诊断或治疗肿瘤相关疾病的制剂。

[0039]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。

需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明
[0040]图1.利用多克隆噬菌体ELISA检测富集的特异性单域抗体(VH)。

[0041]图2.利用ELISA检测特异性单域抗体(VH)与5T4的结合能力。

具体实施方式
[0042]实施例1
[0043]5T4特异性单域抗体(VH)的筛选，
[0044]以人VH 3-23亚家族胚系抗体为模板，利用设计和抗体工程技术引入源于健康成年人、新生儿、癌症病人、艾滋病病人的所有抗体亚家族的重链CDR区(CDR1,CDR2,CDR3)，构建一个实际测量库容量为1500亿(1.5×1011)的超大型全人源单域抗体库；利用此噬菌体展示单域抗体文库，针对生物素标记的h5T4-hFc融合蛋白筛选抗体；将生物素标记的h5T4-hFc融合蛋白固定在链亲和素包被的磁珠上，1012个噬菌体展示的抗体在常温下于1,2,3,4轮分别与5,4,2,1微克抗原孵育两小时，每轮的筛选所用的噬菌体均为1012个，用多克隆噬菌体ELISA来检测抗体的富集；第1,2,3,4轮的噬菌体与包被的蛋白孵育，用抗噬菌体的HRP
耦合抗体检测噬菌体与蛋白的结合，根据多克隆噬菌体ELISA结果(如图1所示)，在第4轮筛选后得到显著的富集，选用第4轮筛选获得的噬菌体，感染TG1细胞并随机挑选克隆进行单克隆噬菌体ELISA，进一步测序鉴定富集的单域抗体；
[0045]特异性单域抗体(VH)与h5T4蛋白的结合能力的检测。

[0046]根据测序结果选择9个克隆，它们的可溶性表达产物的制备基本按文献进行，具体为：将9个克隆的质粒转入HB2151感受态细胞，从过夜生长的氨苄平皿中挑取单个菌落，接种SB细菌培养液，在30度IPTG诱导条件下表达12-14小时，收获细菌并用Ni-TNA从中纯化出单域抗体，将h5T4蛋白包被在ELISA板上，加入梯度浓度稀释的单域抗体孵育，用抗FLAG标签抗体来检测单域抗体与h5T4的结合能力，图2的ELISA结果显示，其中的3个单域抗体均能非常强的结合h5T4蛋白(n501和n504属于同一克隆)。

SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 特异性结合人的5T4抗原的全人源单域抗体及其应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
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1 5 10
图1图2
说　明　书　附　图1/1页CN 108084265 A。