大豆肽钙螯合物的制备、稳定性及表征
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大豆肽钙螯合物的制备、稳定性及表征
王俊强; 孔祥珍; 华欲飞
【期刊名称】《《中国油脂》》
【年(卷),期】2019(044)010
【总页数】5页(P46-50)
【关键词】大豆肽钙螯合物; 制备; 稳定性; 表征
【作者】王俊强; 孔祥珍; 华欲飞
【作者单位】江南大学食品学院江苏无锡214122
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.2; TS202.3
钙是维持人类生命健康重要的矿物质之一,其约占成年人体重的2%,缺钙会增加人体骨折和患骨质疏松症的风险,随着全球人口老龄化现象的加剧,研究新型钙补充剂,以增加人体对钙的吸收利用率越来越受到人们的关注[1]。
另外,钙还具有
参与细胞内代谢、凝血、神经传导、骨骼生长等重要功能[2]。
大豆蛋白作为一种优质的植物蛋白[3],具有降血脂、降胆固醇和预防骨质疏松、
更年期综合征等生理功能[4-5]。
大豆蛋白的水解产物可以良好地保留大豆蛋白中
的氨基酸,同时,大豆蛋白被水解成小分子的多肽后,更容易被人体吸收利用[6]。
另外,有研究认为大豆肽可以参与调节细胞免疫、神经递质,同时具有促进脑功能的作用[7]。
Bao等[8]的研究表明,大豆蛋白水解产物具有钙螯合能力,可以作为
钙补充剂的生产原料。
吕莹等[9]通过Caco-2实验证实,大豆肽钙螯合物对促进
肠道细胞对钙的吸收和转运过程起到了重要的作用。
本文研究了大豆肽具有螯合能力的相对分子质量分布,结合氨基酸分析说明了具有钙螯合能力的大豆肽的特征,研究了大豆肽钙螯合物在磷酸盐缓冲液中的钙保留率和不同pH条件下的稳定性。
同时通过Zeta电位分析和XRD研究大豆肽钙螯合
物的作用类型。
最后,通过DSC和TGA对比大豆肽及大豆肽钙螯合物的热稳定性。
以期为大豆肽钙螯合物的进一步研究提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
低温脱脂豆粕,山东禹王集团;碱性蛋白酶,诺维信(中国)生物技术有限公司。
氢氧化钠、盐酸、无水氯化钙、无水乙醇、硝酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠,分析纯;乙腈,HPLC。
K9840自动凯氏定氮仪,Himac CR21 GⅡ型冷冻离心机,恒温干燥箱,AA-240原子吸收分光光度计(火焰型),D-2000 Elite 高效液相色谱仪,835-50 型氨基酸
自动分析仪,Nano Brook Omni 型多角度粒度与高灵敏度Zeta电位分析仪,尼鲁喷雾干燥机,制备级高效液相色谱仪,X射线衍射仪,DSC3型差示扫描量热仪,TGA2型热重分析仪。
1.2 实验方法
1.2.1 大豆肽的制备
将低温脱脂豆粕粉碎后,按料液比1∶5加85%乙醇醇洗60 min,42℃干燥后,按料液比1∶9加入去离子水,于pH 4.5条件下酸沉1 h,8 500 r/min离心30 min,沉淀加入9倍体积的去离子水充分分散,于pH 9.0、60℃条件下加入2%
的碱性蛋白酶水解4 h,调pH至中性灭酶,8 500 r/min离心30 min,上清喷
雾干燥,即得大豆肽。
1.2.2 大豆肽钙螯合物的制备
配制100 mL 4%的大豆肽溶液,调节pH至7.8,加入4 mL 2 mmol/L的CaCl2溶液,于40℃恒温水浴振荡器中反应1 h,4 000 r/min离心10 min,上清中加入8倍体积无水乙醇,静置30 min,离心,加入85%乙醇洗两次,每次醇洗时间为30 min,离心后沉淀于42℃烘干,即得大豆肽钙螯合物。
1.2.3 大豆肽钙螯合物在磷酸盐溶液中的稳定性
向pH 8.0的磷酸盐(10~200 mmol/L)缓冲液(PBS)中添加大豆肽钙螯合物,使溶液中钙含量为1 mg/mL,于37℃下振荡水浴30 min,离心后,测定上清中钙含量,计算钙保留率,同时,向溶液中添加相同含量的CaCl2作对照。
钙保留率按下式计算。
钙保留率=离心后上清中钙含量/溶液中钙含量×100%
1.2.4 氨基酸组成的测定
采用OPA FMOC柱前衍生,通过氨基酸自动分析仪进行测定。
称取约0.1 g大豆肽或大豆肽钙螯合物于水解管内,加入8 mL 6 mol/L的HCl溶液,混匀后放于110℃的烘箱内消解22 h。
取出冷却,将消解液转移到25 mL容量瓶中,用4.8 mL 10 mol/L氢氧化钠溶液中和,并用水定容至刻度。
采用双层滤纸过滤,取1 mL滤液离心(10 000 r/min,10 min),取上清液进行测定。
1.2.5 大豆肽钙螯合物的脱钙
称取25 mg大豆肽钙螯合物,加入5 mL 0.2 mol/L的pH 8.0 PBS中,于旋涡振荡器上振荡5 min,10 000 r/min离心10 min,上清液为脱钙后的大豆肽钙螯合物。
该方法可脱除大豆肽钙螯合物中99%以上的钙,且大豆肽无损失。
1.2.6 大豆肽钙螯合物在不同pH条件下的稳定性
将一定量的大豆肽钙螯合物溶解于去离子水中,使溶液中钙含量为1 mg/mL,分别调pH至2.0~8.0,于37℃下振荡水浴2 h,离心(10 000 r/min,10 min),
测定上清的相对分子质量。
1.2.7 Zeta电位分析
参考刘成梅等[10]的方法并加以改进。
将大豆肽或大豆肽钙螯合物配制成0.1%的
溶液,调节pH至7.8,进行Zeta电位的测定。
1.2.8 XRD分析
分别将大豆肽、氯化钙、大豆肽钙螯合物制成粉末,进行XRD分析,扫描角度5°~90°。
1.2.9 DSC分析
分别称取3 mg左右的大豆肽及大豆肽钙螯合物于坩埚内,置于差示扫描量热仪中,进行热稳定性分析,同时进行空白对照。
温度范围25~200℃,升温速度
10℃/min,N2流速50 mL/min。
1.2.10 TGA分析
分别称取大豆肽及大豆肽钙螯合物3 mg于坩埚中,将坩埚置于热重分析仪中,测定温度25~900℃,升温速度10℃/min,N2流速30 mL/min,记录样品质量,计算并绘制质量损失率曲线。
1.2.11 数据处理
所有实验数据均通过IBM SPSS Statistics 25和Origin 2018进行数据处理与作图。
2 结果与讨论
2.1 碱性蛋白酶水解大豆肽的水解度和钙结合量
低温脱脂豆粕经醇洗酸沉后用碱性蛋白酶进行水解,水解4 h过程中的水解度随时间的变化见图1。
图1 豆粕水解度随时间变化趋势
由图1可知,豆粕在pH 9.0条件下水解,其在最初0.5 h迅速水解,之后水解速
度逐渐降低,经过4 h,水解度可达19.84%。
对经此工艺水解获得的大豆肽进行钙螯合力的测定,得到其钙结合量为53.03 mg/g。
2.2 大豆肽钙螯合物在磷酸盐溶液中的稳定性
人体摄入的磷元素主要以无机盐形式在肠道被吸收,浓度约为20 mmol/L[11]。
为了模拟大豆肽钙螯合物在人体内的稳定性,并为后续分析大豆肽钙螯合物的性质提供依据,研究了大豆肽钙螯合物在不同浓度的PBS溶液中的钙保留率。
结果见图2。
从图2可以看出,与无机钙相比,大豆肽钙螯合物在低浓度的PBS中具有更高的钙保留率,在10 mmol/L的PBS中,钙保留率可达74.5%,当PBS为20 mmol/L时,大豆肽钙螯合物的钙保留率仍有62.17%,表明大豆肽钙螯合物在低浓度的PBS中具有更好的稳定性。
当PBS的浓度为40~120 mmol/L时,大豆肽钙螯合物的钙保留率稳定在50%左右,当继续增加PBS浓度时,钙保留率迅速下降,当PBS浓度为200 mmol/L时,钙保留率低于1%。
这表明大豆肽与钙离子在结合过程中,可能存在低亲和性位点和高亲和性位点两类结合位点,这一结果与张晓维[12]的报道相一致。
图2 大豆肽钙螯合物与CaCl2在不同浓度磷酸盐缓冲液中的钙保留率
2.3 氨基酸组成
为了研究大豆肽中氨基酸组成对大豆肽与钙离子反应的影响,测定了大豆肽及大豆肽钙螯合物的氨基酸组成,结果见表1。
表1 大豆肽和大豆肽钙螯合物的氨基酸组成及含量 %氨基酸大豆肽大豆肽钙螯合物天冬氨酸12.6314.14谷氨酸21.7035.69丝氨酸3.882.96组氨酸2.992.34甘氨酸3.893.48苏氨酸3.902.55精氨酸7.367.04丙氨酸4.412.32酪氨酸
2.801.59缬氨酸4.652.77甲硫氨酸1.350.89半胱氨酸1.60
3.20苯丙氨酸
4.282.06异亮氨酸
5.483.14亮氨酸7.513.09赖氨酸5.985.24脯氨酸5.597.50
由表1可知,大豆肽与钙反应后,谷氨酸含量由21.70%增加到35.69%,天冬氨酸含量从12.63%增加到14.14%,这两种氨基酸的含量大幅增加,可能是由于谷氨酸和天冬氨酸均属于酸性氨基酸,其侧链基团均含有—COOH,能够提供钙离子结合位点,因此在螯合反应过程中有重要作用。
这一结果与王小林[13]、崔宇[14]等的研究相一致。
2.4 相对分子质量分布
分别测定了大豆肽、大豆肽钙螯合物及大豆肽钙螯合物经0.2 mol/L的PBS脱钙后的螯合肽的相对分子质量,结果见表2。
表2 大豆肽、大豆肽钙螯合物和螯合肽的相对分子质量分布 %样品>10 kDa5~10 kDa3~5 kDa1~3 kDa0.5~1 kDa<0.5 kDa大豆肽
0.123.473.6514.9024.7753.08大豆肽钙螯合物
0.8314.6313.1521.4317.7032.27螯合肽0.083.566.877.6835.4846.33
由表2可知,77.85%的大豆肽相对分子质量小于1 kDa,超过50%的大豆肽相对分子质量小于0.5 kDa。
与大豆肽相比,81.81%的螯合肽相对分子质量小于1 kDa,有显著提高。
而相对分子质量在1~3 kDa的螯合肽占比减少,处于3~5 kDa的螯合肽则有所增加,表明与钙离子螯合能力较强的大豆肽相对分子质量主要集中在小于1 kDa。
与螯合肽相比,大豆肽钙螯合物的相对分子质量则明显向高相对分子质量范围迁移,如相对分子质量处于5~10 kDa的占比提高了11.07个百分点,处于3~5 kDa的占比提高了6.28个百分点,处于1~3 kDa的占比提高了13.75个百分点,而小于1 kDa的相对分子质量占比有明显的下降,表明大豆肽钙螯合物具有更高的相对分子质量。
2.5 大豆肽钙螯合物在不同pH条件下的稳定性
螯合肽与大豆肽钙螯合物的相对分子质量分布存在明显的差异,通过表征不同pH 条件下的相对分子质量分布可以说明大豆肽钙螯合物在不同pH条件下的稳定性,
结果见图3。
图3 不同pH条件处理后大豆肽钙螯合物的相对分子质量分布图
从图3可以看出,大豆肽钙螯合物在各pH条件下的相对分子质量分布没有明显差异,且与所制备的大豆肽钙螯合物的相对分子质量分布情况较为一致,表明大豆肽钙螯合物在各pH条件下均有良好的稳定性,不同pH条件下均没有发生较大程度的解离。
2.6 Zeta电位
目前的研究认为钙离子与多肽的结合位点主要是游离氨基和游离羧基,在反应过程中可能导致表面电荷性质的改变,因此通过Zeta电位分析可以反映钙离子与大豆肽作用的情况。
Zeta电位结果显示,大豆肽平均电位为-37.73 mV,在与钙离子结合后,电负值显著下降至-12.32 mV,表明大豆肽与钙离子结合的过程中大豆肽表面所带电荷明显减少,说明大豆肽与钙离子形成了新的化合物。
2.7 XRD分析
分别对大豆肽、氯化钙及大豆肽钙螯合物进行XRD分析,结果如图4所示。
图4 CaCl2、大豆肽及大豆肽钙螯合物的XRD图谱
从图4可以看出,CaCl2在XRD图谱中有明显的特征衍射峰,而大豆肽仅在20°时有1个较宽的衍射峰。
在大豆肽与CaCl2反应后,CaCl2的特征衍射峰消失,同时,大豆肽钙螯合物在20°的衍射峰强度有所下降,峰宽收窄,且衍射峰向右偏移至22.5°,同时在42.5°处出现1个微弱的衍射峰,表明大豆肽与钙离子发生了化学反应,形成了新的化合物。
2.8 DSC分析(见图5)
图5 大豆肽及大豆肽钙螯合物的DSC分析
从图5可以看出,大豆肽在136.60℃处有1个吸热峰,该吸热峰为大豆肽的化学键断裂导致的,键能为223.51 J/g,在钙离子与大豆肽发生螯合反应后,该吸热
峰向右偏移至159.58℃,键能为149.81 J/g,吸热峰值的升高表明大豆肽钙螯合物具有更好的热稳定性,而键能的降低是由于大豆肽的化学键受到了钙的影响。
2.9 TGA分析(见图6)
图6 大豆肽及大豆肽钙螯合物的TGA曲线
从图6可以看出,大豆肽及大豆肽钙螯合物都出现了3个失重区,温度范围分别
位于50~120℃、120~350℃、350~900℃。
王飞镝[15]研究认为在50~120℃范围内的失重对应的主要为可冻结水(自由水和束缚水),这部分水位于肽链外侧,最容易失去。
而处于120~350℃范围内的失重主要是氢键以及肽链上不同位置的化学键的断裂[16],在这一失重区,大豆肽失重率约为40%,而大豆肽钙螯合物
的失重率约为30%,大豆肽的失重率高于大豆肽钙螯合物的失重率,同时,在这
一区间,大豆肽钙螯合物的失重温度高于大豆肽的失重温度。
表明大豆肽钙螯合物相较于大豆肽具有更好的热稳定性,这一结果也与DSC的结果相一致。
当温度超
过350℃时,大豆肽及大豆肽钙螯合物的失重则主要表现为灰化的过程。
3 结论
大豆肽在水解4 h条件下,水解度可达19.84%,大豆肽与钙离子进行螯合反应,钙结合量为53.03 mg/g,且制备的大豆肽钙螯合物在低浓度磷酸盐存在时仍具有良好的稳定性,在磷酸盐缓冲液浓度为10 mmol/L时,钙保留率为74.5%,20 mmol/L磷酸盐缓冲液中钙保留率为62.17%。
具有较高螯合能力的大豆肽的相对分子质量主要集中在小于1 kDa的范围内。
谷氨酸和天冬氨酸是参与大豆肽钙螯
合反应重要的氨基酸。
大豆肽钙螯合物在各pH条件下均没有发生明显的解离现象,表明其在不同pH条件下均具有较好的稳定性。
Zeta电位分析表明,大豆肽与钙
离子发生反应后,其表面的电负性有显著的下降。
大豆肽钙螯合物在XRD图谱中的衍射峰有所收窄,且氯化钙的特征峰消失,表明大豆肽与钙离子形成了新的化合物。
对大豆肽及大豆肽钙螯合物的DSC分析和TGA分析表明,大豆肽与钙离子
发生螯合反应后,生成的大豆肽钙螯合物具有比大豆肽更好的热稳定性。
【相关文献】
[1] CAO Y, MIAO J, LIU G, et al. Bioactive peptides isolated from casein phosphopeptides enhance calcium and magnesium uptake in Caco-2 cell monolayers[J]. J Agric Food Chem, 2017,65(11):2307-2314.
[2] PENG Z, HOU H, ZHANG K, et al. Effect of calcium-binding peptide from Pacific cod (Gadus macrocephalus) bone on calcium bioavailability in rats[J]. Food Chem, 2017, 221:373-378.
[3] 刘丽. 大豆分离蛋白冰淇淋的研制及其功能特性的研究[D]. 沈阳:东北农业大学, 2013.
[4] FRIEDMAN M, BRANDON D L. Nutritional and health benefits of soy proteins[J]. J Agric Food Chem, 2001,49(3):1069-1086.
[5] SLAVIN J. Nutritional benefits of soy protein and soy fiber[J]. J Am Dietet Assoc, 1991,91(7):816-819.
[6] JIN D H, ZHANG Y, SUZUKI Y, et al. Inhibitory effect of protein hydrolysates on calcium carbonate crystallization[J]. J Agric Food Chem, 2000,48(11):5450-5454.
[7] DILSHAT Y, PARIDA H, NURMUHAMMAT A, et al. Effects of soybean peptide on immune function, brain function, and neurochemistry in healthy volunteers[J]. Nutrition, 2012,28(2):154-159.
[8] BAO X L, SONG M, ZHANG J, et al. Calcium-binding ability of soy protein hydrolysates[J]. Chin Chem Lett, 2007,18(9):1115-1118.
[9] 吕莹, 王若敏, 任建华, 等. 体外Caco-2细胞模型评价不同亚基来源大豆肽-钙复合物对钙吸收的影响[J]. 中国食品学报, 2013,13(4):185-190.
[10] 刘成梅, 吴孛, 钟业俊, 等. 鸭血小分子肽同步酶解工艺的优化[J]. 食品科学, 2010,31(10):151-154.
[11] BELLASI A, KOOIENGA L, BLOCK G A . Phosphate binders: new products and challenges[J]. Hemodial Int, 2010, 10(3):225-234.
[12] 张晓维. 卵黄高磷蛋白的分离纯化、结构表征及功能特性研究[D]. 武汉:华中农业大学, 2014.
[13] 王小林, 孔祥珍, 华欲飞, 等. 大豆分离蛋白肽钙螯合物的制备及表征[J]. 中国油脂,
2017,42(7):50-54.
[14] 崔宇, 王小林, 孔祥珍, 等. 大豆肽螯合钙能力影响因素的研究[J]. 中国油脂, 2018,43(2):70-74.
[15] 王飞镝. 大豆蛋白的凝胶性与EDTAD改性大豆蛋白凝胶的制备与性能的研究[D]. 广州:广东工业大学, 2006.
[16] 黄顺丽, 赵立娜, 蔡茜茜, 等. 乳清蛋白钙螯合肽的分离及结构性质表征[J]. 中国食品学报, 2015,15(11):212-218.。