用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs及其分离培养方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910674796.1
(22)申请日 2019.07.25
(71)申请人 四川大学
地址 610041 四川省成都市武侯区一环路
南一段24号
(72)发明人 李中瀚　陈红　
(74)专利代理机构 成都九鼎天元知识产权代理
有限公司 51214
代理人 余小飞　管高峰
(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)
A61L 27/38(2006.01)
(54)发明名称用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs及其分离培养方法和应用(57)摘要本发明提供一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs，属于组织工程技术领域。

所述MDPSCs 为从牙间充质组织中分离的CD24a阳性细胞，所述MDPSCs在3D培养条件下展现自更新能力，形成阳性表达多能相关标志基因Sox2，Nanog，Oct4和Ki67的细胞小球。

本发明还提供所述多能干细胞的制备方法及应用。

本发明多能干细胞MDPSCs用3D培养的方法对其成功分离和富集，并结合流式细胞术定义了MDPSCs的特征性表面标记。

MDPSCs 裸鼠体内移植能够再生牙髓，可替代传统根管治疗，在消除牙髓炎症的前提下保存活髓。

本发明多能干细胞MDPSCs具有形成血管化牙髓-牙本质复合体的能力，为研究功能性牙髓再生以及临床
转化应用提供了细胞基础。

权利要求书1页 说明书8页 附图6页CN 110408592 A 2019.11.05
C N 110408592
A
1.一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs，其特征在于，所述MDPSCs为从牙间充质组织中分离的CD24a阳性细胞。

2.如权利要求1所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs，其特征在于，所述MDPSCs 在3D培养条件下展现自更新能力，形成阳性表达多能相关标志基因Sox2，Nanog，Oct4和Ki67的细胞小球。

3.一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用酶与螯合剂复合消化法进行牙间充质细胞的原代分离培养：
2)当牙间充质细胞密度达到70-90％用酶消化进行传代培养得到P2代牙间充质细胞；
3)将P2代牙间充质细胞接种至培养板上进行3D培养获得呈细胞小球状态的MDPSCs细胞。

4.如权利要求3所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，其特征在于，所述步骤1)的具体操作为：
A、分离牙齿完整牙胚，从牙冠钙化边缘下掏出牙间充质组织，冲洗后剪碎成乳糜状；
B、用酶和螯合剂消化液对剪碎后的组织进行消化，消化完成后终止消化；
C、经洗涤、离心、去上清后将培养基重悬细胞后置于原代培养瓶中，放入培养箱中培养；
D、补充培养液至稍稍浸没组织块，并视细胞生长情况适当换液或传代。

5.如权利要求4所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，其特征在于，所述消化为置于37℃水浴锅中消化20-30分钟，每隔5分钟摇晃一次；所述培养箱为37℃，5％CO 2。

6.如权利要求3所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3)的具体操作为：
A、将P2代牙间充质细胞弃培养液，洗涤后加入蛋白酶消化；
B、用α-MEM培养基终止消化，离心，去上清，适量培养液重悬后计数；
C、将计数后的所得细胞加入3D培养液中吹打混匀，并将细胞接种至培养板，培养期间补充新鲜培养液并观察细胞成球情况。

7.如权利要求6所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，其特征在于，所述3D培养液由细胞培养液和胞外基质预制备物按3:2体积比混合组成。

8.如权利要求7所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养液是在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比血清或血清替代物、1％体积比的细胞生长因子的培养基，其中细胞生长因子为TGF β、EGF、BMP -2、BMP -4以及FGF因子的混合物。

9.如权利要求6所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，其特征在于，步骤C中，所述细胞以1×104cells/cm 2的密度接种至6-well低粘附培养板；所述补充新鲜培养液的具体操作为：每两日补充一次1/10初始体积的新鲜培养液。

10.如权利要求1所述一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的应用，其特征在于，所述细胞在构建完整牙胚，增强体内外成骨/成牙向分化能力，促进牙髓牙本质复合体在体内功能再生中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 110408592 A
用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs及其分离培养方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于组织工程技术领域，具体为一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs及其分离培养方法和应用。

背景技术
[0002]牙齿是承担人类咀嚼、发音以及维持颜面美学的重要器官，而其功能的维持则主要依靠牙髓。

牙髓能够诱导牙本质形成，维持营养供应，并为牙齿提供对外界刺激作出反应的感觉神经网。

牙髓炎症和坏死以及根尖周炎是口腔临床的常见病和多发病，根管治疗(root canal therapy)作为国际上针对此类疾病最常用的有效治疗手段，其原理是利用机械和化学方法去除根管内炎症、坏死的牙髓组织，并通过药物消毒和根管充填防止感染再次发生。

根管治疗需要摘除患牙牙髓组织以达到保留整个牙齿或牙根的目的，这将导致牙髓的永久失活和功能丧失，同时患牙也会因此失去正常的生理弹性，牙体变脆易蹦碎。

此外，根管治疗手术步骤繁琐，一般需要2-4次就诊，经过多个治疗步骤和拍摄多张X光片才能完成，治疗期间还可能出现疼痛等不适症状，病人要承受的痛苦也较大。

若治疗失败，消毒不彻底导致牙髓腔再次感染，很容易导致牙齿拔除。

[0003]随着干细胞与再生医学的发展，基于干细胞的细胞治疗越来越受到人们的关注。

如何利用干细胞再生功能性牙髓替代传统根管治疗术成为治疗牙髓炎和牙髓坏死的新趋势。

目前的研究表明，牙齿组织中分离出的多种间充质干细胞群(如SCAP，SHED，DPSCs以及DFCs等)均显示有不同程度的牙髓-牙本质再生潜能，但是其存在再生效率批次差异大，缺乏明确的分子标记对细胞多能性进行评估以及间充质细胞本身存在较大异质性以致品控不易等缺陷，导致这些细胞产品主要以储存服务的形式在市场上推行，尚未广泛用于临床治疗。

[0004]已有的牙源性干细胞的另一个缺陷在于，其培养体系依赖于传统的二维培养方式，即细胞群以单层细胞方式饲养于培养瓶中，并基于细胞的生长速度和密度进行传代和扩增。

二维细胞培养作为非常经典的细胞培养方式，在生命科学研究发展过程中起到了非常大的促进作用，但是，由于培养瓶本身材质的硬度远远超过体内组织，其生物力学环境与组织生理条件存在显著差异。

就干细胞而言，其多能性的维持对环境的依赖性较大，不仅需要符合生理环境的基质材料，还需要辅助以支持性的生长因子，而这些对生理微环境的模拟在二维培养环境中较难实现。

[0005]与传统的二维(2D)贴壁培养技术不同，三维(3D)培养可以模拟干细胞在体内的天然生存微环境，维持细胞的多能状态，并对有较强自更新能力的细胞有富集作用。

以往对成体干细胞体外3D培养的研究，主要集中在上皮来源的干细胞群体，例如乳腺上皮干细胞、肠上皮干细胞等，而对间充质来源的干细胞报道较少，Muse细胞的发现是目前报道的证据较为充分的间充质细胞三维培养体系。

因此，我们希望利用该系统研究异质性的牙乳头细胞群中是否存在尚未被定义的多能牙髓再生干细胞亚群。

尽管3D培养可以对某些干细胞亚群进行富集和纯化，但纯化后的细胞群体仍可能是异质性的。

鉴于流式细胞术的广泛应用，细
胞表面蛋白在不影响细胞活力的前提下相对更易量化，使得它成为定义不同类型细胞的理想工具。

对细胞表面标记物的识别和探索性研究使从异质性细胞群中分离出独特的亚群成为可能。

因此，探索从牙源性异质细胞群中富集和分离多能干细胞的专门技术，以进一步应用于牙髓再生，对细胞治疗临床转化和生物医学研究具有广阔的应用前景。

发明内容
[0006]本发明的目的在于弥补传统根管治疗技术的缺陷，提出一种多能干细胞MDPSCs，明确分离和培养方法，并对其特征性表面标志物进行定义，以期获得大量体外扩增应用，达到再生牙髓，保存患牙活髓的目的。

[0007]本发明目的通过以下技术方案来实现：
[0008]一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs，所述MDPSCs为从牙间充质组织中分离的Cd24a阳性细胞。

其中，牙间充质组织优选为牙乳头，牙髓等。

[0009]进一步，所述MDPSCs在3D培养条件下展现自更新能力，形成阳性表达多能相关标志基因Sox2，Nanog，Oct4和Ki67的细胞小球。

[0010]一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的分离培养方法，包括以下步骤：[0011]1)采用酶与螯合剂复合消化法进行牙间充质细胞的原代分离培养：
[0012]2)当牙间充质细胞密度达到70-90％用酶消化进行传代培养得到P2代牙间充质细胞；
[0013]3)将P2代牙间充质细胞接种至培养板上进行3D培养获得呈细胞小球状态的MDPSCs细胞。

[0014]进一步，所述步骤1)的具体操作为：
[0015]A、分离牙齿完整牙胚，从牙冠钙化边缘下掏出牙间充质组织，冲洗后剪碎成乳糜状；
[0016]B、用酶和螯合剂消化液对剪碎后的组织进行消化，消化完成后终止消化；[0017]C、经洗涤、离心、去上清后将培养基重悬细胞后置于原代培养瓶中，放入培养箱中培养；
[0018]D、补充培养液至稍稍浸没组织块，并视细胞生长情况适当换液或传代。

[0019]步骤1)B中，终止消化采用含有化学血清替代物或血清α-MEM培养基。

[0020]步骤1)D中，培养液是在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比血清或血清替代物、1％体积比的细胞生长因子的培养基，其中细胞生长因子为TGFβ、EGF、BMP-2、BMP-4以及FGF等因子的混合物。

[0021]进一步，所述消化为置于37℃水浴锅中消化20-30分钟，每隔5分钟摇晃一次；所述培养箱为37℃，5％CO2。

[0022]进一步，所述步骤3)的具体操作为：
[0023]A、将P2代牙间充质细胞弃培养液，洗涤后加入蛋白酶消化；
[0024]B、用α-MEM培养基终止消化，离心，去上清，适量培养液重悬后计数；
[0025]C、将计数后的所得细胞加入3D培养液中吹打混匀，并将细胞接种至培养板，培养期间补充新鲜培养液并观察细胞成球情况。

[0026]进一步，所述3D培养液由细胞培养液和胞外基质预制备物按3:2体积比混合组成。

其中，细胞培养液是在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比血清或血清替代物、1％体积比的细胞生长因子的培养基，其中细胞生长因子为TGFβ、EGF、BMP-2、BMP-4以及FGF等因子的混合物；胞外基质预制备物优选胶原蛋白、甲基纤维素。

[0027]进一步，步骤C中，所述细胞以1×104cells/cm2的密度接种至6-well低粘附培养板；所述补充新鲜培养液的具体操作为：每两日补充一次1/10初始体积的新鲜培养液。

[0028]一种用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs的应用，所述细胞在构建完整牙胚，增强体内外成骨/成牙向分化能力，促进牙髓牙本质复合体在体内功能再生中的应用。

[0029]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030]本发明提供一种用于牙髓再生多能干细胞MDPSCs，并用3D培养的方法对其成功分离和富集，同时结合流式细胞术定义了MDPSCs的特征性表面标记。

MDPSCs裸鼠体内移植能够再生牙髓，或可在将来替代传统根管治疗，在消除牙髓炎症的前提下保存活髓。

本发明多能干细胞MDPSCs具有形成血管化牙髓-牙本质复合体的能力，为研究功能性牙髓再生以及临床转化提供了细胞基础。

附图说明
[0031]图1为原代DPCs分离培养三维细胞成球实验模式图；
[0032]图2为原代DPCs及DPC spheres光镜和电镜下的典型细胞形态；
[0033]图3为免疫荧光及RT-PCR检测多能性和增殖相关标志基因Oct4,Sox2,Nanog,Ki67的表达情况；其中a为免疫荧光，b为RT-PCR检测；
[0034]图4为成骨诱导液分别作用10天和7天后DPC spheres茜素红和碱性磷酸酶染色情况及定量分析；
[0035]图5为DPC spheres在小鼠肾被膜下分化为骨样/牙本质样矿化结构；
[0036]图6为DPC spheres复合TDM裸鼠皮下移植流程图。

[0037]图7为DPC spheres在裸鼠皮下TDM管腔内形成牙髓-牙本质复合体样结构。

[0038]图8为DPC spheres再生组织中牙本质特异性标志物DMP1和DSPP，血管特异性标志物VEGF和CD31，神经组织特异性标志物GFAP、S100和NF200的表达情况。

[0039]图9为DPC spheres中富集的表面标志基因。

[0040]图10为RT-qPCR验证转录组测序结果的准确性。

[0041]图11为采用流式细胞术得到的FACS散点图和直方图分析结果。

[0042]图12为免疫荧光检测monolayer、spheres和DPC p2细胞各自CD24a表达情况。

[0043]图13为FACS对原代牙乳头细胞中的Cd24a阳性细胞进行分选，根据Cd24a表达情况得到3个亚群。

[0044]图14为根据CD24a表达情况得到的3个亚群各自成球效率的分析结果。

[0045]图15为免疫荧光和免疫组化分析小鼠发育中的牙胚组织切片。

具体实施方式
[0046]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0047]实施例1小鼠牙乳头中多能干细胞的分离培养
[0048]本实施例牙乳头细胞分离培养三维成球实验模式图如图1所示。

小鼠牙乳头中多能成球干细胞的分离培养具体包括以下步骤：
[0049]1)原代牙乳头细胞的分离培养
[0050]选择10只出生后1-3天的C57BL/6小鼠乳鼠，脱颈处死后75％乙醇浸泡5-10min消毒，分离上下颌骨，用显微镊在体式显微镜下剥离第一二磨牙完整牙胚，从牙冠钙化边缘下方掏出牙乳头组织，用含抗生素的PBS冲洗后眼科剪剪碎成乳糜状；
[0051]用胶原酶(625 CDU/ml)和螯合剂对组织进行消化，37℃水浴锅中消化20-30分钟，每隔5分钟摇晃一次；
[0052]用含10％FBS的α-MEM培养基终止消化，PBS洗涤，1000rpm离心3-5min，去上清，1ml 新鲜EpiCM培养基重悬细胞后转移至T25培养瓶中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；[0053]次日补充2-3ml新鲜培养液继续培养，视细胞生长情况每2-3天换液一次。

[0054]2)当DPCs密度达到约70-90％的时候用0.25％胰蛋白酶消化1-2min，10％FBS的α-MEM培养基终止消化，1000rpm离心3-5min，去上清，牙间充质培养基重悬后将1×106个细胞接种至T25进行传代培养；后述实验所用细胞均为P2代牙乳头细胞。

[0055]3)3D培养细胞成球
[0056]P2代牙乳头细胞，弃培养液，用1×PBS洗一次，0.25％胰蛋白酶1ml消化1-2分钟；等体积10％FBS的α-MEM终止消化，离心，去上清，适量培养液重悬后计数；细胞培养液和甲基纤维素按3:2体积比混合配制成3D细胞培养液；将计数所得细胞加入3D细胞培养液中吹打混匀，以1×104cells/cm2的密度接种至6-well超低粘附培养板每个孔；每两日补充1/10初始体积的新鲜培养液至6-well培养板每孔；培养期间显微镜下观察细胞成球情况，至第8天获得DPC spheres用于后续实验。

[0057]细胞培养液是在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比血清或血清替代物、1％体积比的细胞生长因子的培养基，其中细胞生长因子为TGFβ、EGF、BMP-2、BMP-4以及FGF等因子的混合物。

[0058]本实施例原代牙乳头细胞(DPCs)及DPC spheres光镜和电镜下的典型细胞形态如图2所示。

其中i是原代DPCs，ii是Day0的DPC spheres，iii是Day7的DPC spheres，iv是DPC spheres的扫描电镜图。

尽管原代DPCs在肾被膜下显示同DPC spheres相似的矿化能力，但原代DPCs在TDM诱导下无法形成牙髓牙本质复合体结构，而DPC spheres可以。

[0059]实施例2多能干细胞的检测
[0060]1、免疫荧光检测
[0061]将DPC spheres接种于共聚焦小皿中，待30-60min细胞小球沉降贴壁，4％多聚甲醛固定，免疫荧光染色对DPC spheres的多能性进行鉴定。

[0062]免疫荧光染色步骤为：
[0063] a.细胞小球经4％多聚甲醛固定1h，用PBS洗涤3次；
[0064] b.加入0.5％TritionX-100室温打孔30min，PBS洗3次；
[0065] c.5％BSA室温封闭30min；
[0066] d.弃封闭液，加一抗孵育，4℃过夜；
[0067] e.复温10min，PBS洗5min/次，共3次，加相应荧光二抗，37℃孵育1h；
[0068] f.PBS洗3次，DAPI染细胞核5min；
[0069]g.PBS洗3次，荧光显微镜下观察。

[0070]免疫荧光检测所使用的一抗主要有：rabbit anti-Sox2(ab97959,Abcam,USA), rabbit anti-Nanog(ab80892,Abcam,USA),rabbit anti-OCT4(D121072,Sangon Biotech, China),rabbit anti-Ki67(ab15580,Abcam,USA)。

免疫荧光染色结果如图3所示，DPC spheres阳性表达多能相关及增殖标志基因Sox2，Nanog，Oct4和Ki67。

[0071]2、RT-PCR
[0072]离心收集低粘附培养板中的DPC spheres，2000rpm，5min，RT-PCR对免疫荧光染色结果进行验证。

[0073] a.提取细胞小球总RNA
[0074]1)PBS清洗离心获得的DPC spheres，加入1ml RNAiso Plus裂解液，混匀后室温静置5min；
[0075]2)向裂解液中加入0.2ml氯仿，振荡器剧烈振荡15s，待其充分乳化后，静置5min；[0076]3)12000g，4℃，离心15min；
[0077]4)离心后分为三层：无色上清层、中间蛋白层及下层有机相。

转移上清液至新的RNase-free的EP管中；
[0078]5)吸取等体积异丙醇加入上清液中，混匀，室温静置10min；
[0079]6)12000g，4℃，离,10min；
[0080]7)离心后管底可见白色沉淀物，即总RNA；
[0081]8)沿EP管壁缓慢地加入RNase-free水配制的75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤；[0082]9)12000g，4℃，离心5min；
[0083]10)弃去乙醇，室温干燥5min；
[0084]11)RNA溶解：移液枪加入10μL RNase-free水，轻轻吹打溶解沉淀；
[0085]12)紫外分光光度计检测RNA溶液A260/A280，比值在1.8-2.2之间为合格RNA，-80℃保存备用。

[0086] b.逆转录(Reverse transcription，RT)
[0087]1)RT反应：反转录按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行，混匀后瞬时离心，放入梯度PCR仪。

[0088]2)反应条件：42℃，60分钟；70℃，5分钟。

[0089]3)cDNA产物置于-20℃保存备用。

[0090] c.PCR
[0091]1)反应配方：采用10ul反应体系，在PCR管内各加入预混溶液：Green mix(Cat# K1082,Thermofisher,USA)，5ul；Forward primer，0.5ul；Reverse primer，0.5ul；cDNA，1ul；H2O，3ul；至总体积为10μl。

将上述反应液震荡混匀，瞬时离心。

[0092]2)反应条件：95℃，2min→95℃，30s→55℃，30s→72℃，36s→72℃，5min→4℃，循环数35cycles。

[0093] d.琼脂糖核酸电泳
[0094]RT-PCR结果如图3所示：DPC spheres阳性表达多能相关及增殖标志基因Sox2，Nanog，Oct4和Ki67。

[0095]本实施例所涉及的引物序列如下表1所示：
[0096]表1
[0097]
[0098]3、成骨诱导液诱导体外成骨分化
[0099]将2×105个细胞接种至6孔板每个孔中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；细胞生长至对数期时取出，弃旧培养液，PBS缓冲液漂洗3遍，加入成骨诱导液分别培养7天和10天；弃成骨诱导液，使用PBS漂洗3遍；成骨诱导10天组，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗去除残留多聚甲醛；将预先配置好的茜素红S(Cat#A5533，pH＝4.3，Sigma-Aldrich，USA)加入孔板中，室温下染色5min，PBS清洗3次，显微镜下观察并采图，用10％氯化十六烷基吡啶溶解矿化结节，于405nm处测吸光度。

成骨诱导7天组，按照ALP显色试剂盒(Cat#C3206，Beyotime，China)和ALP活性试剂盒(Cat#A059-2，Jiancheng，China)说明书指导，ALP染色和ALP活性检测。

结果如图4所示，其中(a)和(c)分别为茜素红和ALP染色结果，(b)和(d)分别为对茜素红和ALP染色结果的定量分析。

由此可见，成骨诱导液作用下DPC spheres显示更强的矿化能力和ALP活性。

[0100]4、小鼠肾被膜移植
[0101] a.DPC spheres来源的细胞按1.0×106/10μl的细胞密度与Matrigel(Cat# 354234,BD,USA)混合；
[0102] b.将上述混合液制成cell-matrigel小球(规格3.3×105/3μl)；
[0103] c.移植cell-matrigel小球到8周龄的雄性C57BL/6小鼠肾被膜下；
[0104] d.标准条件下饲养，温度21℃，光照周期12小时；
[0105] e.4周后取材，4％多聚甲醛固定，10％EDTA脱钙1周，石蜡包埋切片，以备组织学染色分析。

[0106]结果如图5所示，monolayer cells在肾被膜下移植4周后仅可见胶原纤维样结构形成，且DMP1和DSPP表达相对较弱，而DPC spheres可形成明显阳性表达DMP1和DSPP的矿化结构，这说明DPC spheres在体内显示更强的成骨/成牙分化能力。

实施例3 DPC spheres促进牙髓-牙本质复合体在体内的功能再生
[0107]1、裸鼠皮下移植，流程图如图6所示，具体操作过程如下：
[0108] a.TDM制备：猪下颌骨中拔出中切牙；小心地刮除牙周韧带组织，磨去牙骨质、牙髓组织和牙本质层；高速涡轮手环将根管切成长2-3毫米的小段；超声波清洗机震荡清洗根管3次，每次5～6min；根管转移至梯度EDTA溶液(17％到5％)5min，期间去离子水冲洗5min(3次)；将制备的TDM浸泡于青霉素(50 U/ml)和链霉素(50mg/ml)混合液中4℃保存备用。

[0109] b.DPC spheres来源的细胞按照1.0×106/10μl的细胞密度与Matrigel(Cat# 354234,BD,USA)混合；
[0110] c.将上述混合液用移液枪打入一端用盖随剂(Dycal,Cat#10800,DENSPLY,USA)封
口的TDM管腔中，37℃培养箱培养至凝固；
[0111] d.移植TDM-cell-matrigel样品到8周龄的雄性裸鼠皮下；
[0112] e.标准条件下饲养，温度21℃，光照周期12小时；
[0113] f.4周后取材，4％多聚甲醛固定，10％EDTA脱钙6周，石蜡包埋切片，以备组织学染色分析。

[0114]结果如图7和图8所示，图7表明DPC spheres在裸鼠皮下的TDM管腔内再生形成与天然牙相似的牙髓-牙本质复合体样结构。

图8表明DPC spheres再生组织中牙本质特异性标志物DMP1和DSPP，血管特异性标志物VEGF和CD31，神经组织特异性标志物GFAP、S100和NF200均呈阳性，与天然牙髓表达相似。

[0115]实施例4转录组测序分析DPC spheres中富集的表面蛋白标志基因
[0116]1、RNA-seqencing
[0117]提取总RNA，NanoDrop检测纯度；Agilent Bioanalyer 2100system(Agilent Technologies,USA)验证RNA样品的完整性；RNA-seq分析各组样品mRNA整体表达谱，产生150bp reads数；fastq文件经HISAT2 v2.1.0比对到小鼠基因组(Mus musculus,GRCm38)；FeatureCounts v1.6.0统计比对到每个基因上的reads数；以log FoldChange>2，p-adjusted value<0.01为标准，用R and DESeq2 package分析差异表达的基因。

CD标记物的收集：细胞表面蛋白数据库(http://wlab.ethz.ch/cspa/)和Human/Mouse CD标记手册(BD Biosciences)。

[0118]2、RT-qPCR验证RNA-seqencing结果
[0119] a.提取总RNA；
[0120] b.反转录为cDNA；
[0121] c.实时荧光定量PCR。

[0122]反应体系:5μl Premix Ex TaqTMⅡ(2x)，0.5μl，10μM上游引物；0.5μl，10μM下游引物；1.0μl cDNA模板；3μl ddH2O至总体积为10μl。

[0123]反应条件：Polymerase Activation:95℃，30s，PCRCycling(40cycles)：95℃，15s-60℃，34s；MeltCurve:95℃，15s，60℃，15s，95℃，15s。

[0124]结果如图9和图10所示，图9为DPC spheres中富集的表面标志基因，Fold change 以灰色显示，FPKM值以黑色显示，比较DPC spheres与2D培养细胞的差异基因表达谱，并与表面蛋白数据库重叠(Fold change≥2)，筛选出15个候选表面标志物。

标记准备进一步验证的候选表面marke。

图10为RT-qPCR验证转录组测序结果的准确性，证实了测序结果的准确性。

[0125]本实施例所涉及的引物序列如下表2所示：
[0126]表2
[0127]
[0128]
[0129]实施例5牙乳头中CD24a阳性细胞成球能力更强
[0130]1、流式细胞术
[0131]预冷PBS冲洗monolayer cells，DPCs P2和DPC spheres的单细胞悬液两次；Anti-CD24a抗体(ab64064,Abcam,USA)冰上孵育约5×105个细胞30min；预冷PBS洗涤2-3次；anti-rat IgG-FITC(Cat#A21208，Thermofisher，USA)孵育30min；预冷PBS洗涤3次，70μm细胞筛过滤；Rat normal IgG(Cat#10700,Thermofisher,USA)为同型对照。

采用Becton-Dickinson Accuri C6(BD biosciences,USA)进行分析，BD Aria III(BD biosciences, USA)进行分选，FlowJo(版本7.6.1)处理数据。

[0132]得到的FACS散点图和直方图分析结果如图11所示，从上到下分别为散点图和直方图：以Rat normal IgG为阴性对照，DPC spheres分别为CD24a++(72.9％)、CD24a+ (19.7％)、CD24a-(2.91％)；monolayer cells分别为CD24a++(0.179％)、CD24a+(4.99％)、CD24a-(93.8％)；DPCs P2分别为CD24a++(9.32％)、CD24a+(50.8％)、CD24a-(33％)。

DPC spheres细胞中CD24a++细胞比例较高。

[0133]2、免疫荧光检测
[0134]实验过程如实施例2中免疫荧光检测所述。

[0135]免疫荧光检测所使用的一抗：rat anti-CD24(ab64064,Abcam,USA)。

免疫荧光染色结果如图12所示：DPC spheres细胞中含有丰富的CD24a阳性细胞群。

[0136]3、流式分选后成球实验
[0137]实验过程如实施例1中的步骤3)所述，5×103cells/cm2的密度接种至24-well超低粘附培养板。

[0138]结果如图13和图14所示，根据CD24a的表达情况，用流式细胞仪(FACS)对牙乳头细胞3个亚群进行分选。

RT-qPCR进一步证实FACS分选获得的各细胞亚群CD24a的表达情况。

将分选得到的细胞在MC培养基中3D培养7天后拍照并进行统计分析，结果表明只有CD24a++表现出较强的成球能力，CD24a++细胞成球效率(17.04±3.87‰)明显高于CD24-细胞(1.76±0.24‰)**P<0.01(student t-test)。

[0139]4、牙胚组织切片染色
[0140] a.选择1只出生后1-3天的C57BL/6小鼠乳鼠，脱颈处死后75％乙醇浸泡5-10min消毒，分离完整上下颌骨。

[0141] b.将分离得到的颌骨分别于10％，20％，30％蔗糖梯度脱水至沉底；
[0142] c.tissue freezing medium包埋脱水后的上下颌骨，冷冻切片机切片。

[0143] d.后续实验过程如实施例2中免疫荧光检测所述。

[0144]采用免疫荧光和免疫组化分析小鼠发育中的牙胚组织切片，结果如图15所示，小鼠发育中的牙胚组织中存在Cd24a阳性细胞。

[0145]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

图1
图2
图3。