外源辅助T淋巴细胞表位影响HBVS基因DNA免疫的体液免疫应答

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论著·基金项目：国家自然科学基金资助项目（39970677）作者单位：510630广州，
中山大学附属第三医院传染病科外源辅助T 淋巴细胞表位影响HBV S 基因
DNA 免疫的体液免疫应答
彭晓谋
谢冬英
顾琳
黄仰
高志良
姚集鲁
【摘要】目的探讨外源辅助T 淋巴细胞（HTL ）表位对HBV S 基因体液免疫应答的影响。

方法
选用2种通用HTL 表位，破伤风类毒素的氨基酸残基（aa ）830-843片段（TTE ）和人工HTL 表位（PADRE ），以及3种特异性HTL 表位，结核杆菌热休克蛋白65的aa1-20片段（TBE ）、风疹蛋白E2-4的aa54-65片段
（ME ）和沙眼衣原体热休克蛋白60的aa35-48片段（CE ），以单个表位或复合表位形式插入HBV S 基因的翻译起始密码下游而构建成真核表达载体。

100µg 重组载体DNA 免疫BALB /c 小鼠，3周加强1次，共3次，第三次加强接种后1月取血采用Abbott 试剂盒检测抗-HBs 。

结果
HBV S 基因
真核表达载体pHB 和6种外源HTL 表位HBV S 基因真核表达载体pHB-TBE 、pHB-PADRE 、pHB-TTE 、pHB-MTE2、pHB-MTE3和pHB-MTE5构建成功，DNA 免疫的抗-HBs 水平（IU /L ）分别为10±5，5±5，49±7，29±6，16±8，23±7和28±8。

单个表位中，TTE 和PADRE 具有良好的免疫促进作用，而TBE 无促进作用。

复合表位均有不同程度的免疫增强作用。

结论
部分外源HTL 表位对HBV S 基因的体液
免疫应答有促进作用，复合表位中的单个表位间的促进作用无协同或迭加效果。

表位PADRE 可能用于新型高效乙肝疫苗的研制，而复合表位MTE5可能用于能克服人类白细胞抗原多态性的乙肝补种疫苗或治疗性疫苗的研制。

【关键词】疫苗；肝炎病毒，乙型；肝炎表面抗原，乙型；表位，T 淋巴细胞
Effect of exogenous epitopes of helper T lymphocyte on humoral immunity of HBV S gene DNA immunity
PENG Xiao-mou ，XIE Dong-ying ，GU Lin ，HUANG Yang-su ，GAO Zhi-liang ，Yao Ji-lu .Department of Infectious Diseases ，Third Affiliated Hospital ，Zhongshan University ，Guangzhou 510630，China
【Abstract 】Objective To study the effect of exogenous epitope of helper T lymphocyte （HTL ）on humoral immunity of HBV S gene DNA immunity.Methods Two universal HTL epitopes ，amino acid residue （aa ）830-843of the tetanus toxoid （TTE ）and artificial epitope （PADRE ）
，and 3unique epitopes ，aa1-20of tubercle bacteria hot shock protein 65（TBE ）
，aa54-65of rubella protein E2-4（ME ）and aa 35-48of trachoma hot shock protein 60（CE ）were chosen.Eukaryotic expression vectors were constructed by inserting single or multiple exogenous epitopes in HBV S gene just after the initial code of translation.BALB /c mice were inoculated with 100µ
g of recombinant DNA per mouse ，and given boost inoculation for 3times with 3-week interval.Mouse blood were collected one month just after the third boost inoculation.Anti-HBs was detected using Abbott test kits.Results HBV S eukaryotic gene expression vectors ，pHB and 6exogenous HTL epitope HBV S gene vectors ，pHB-TBE ，pHB-PADRE ，pHB-TTE ，pHB-MTE2，pHB-MTE3and pHB-MTE5were constructed successfully with anti-HBs level （IU /L ）of 10±5，5±5，49±7，29±6，16±8，23±7and 28±8respectively.Among 3single epitopes ，TTE and PADRE had obviously effect on promoting the anti-HBs response of HBV S gene ，while TBE had no promoting effect.All of the 3multiple epitopes were shown the effect of immune promoting.Conclusion Some exogenous HTL epitopes had obviously effect on promoting the anti-HBs response of HBV S gene.Multiple epitopes also had humoral immunity promoting effect ，but there was no synergic effect among their own HTL epitopes.PADRE might be an important candidate for new efficient HB vaccine.The multiple epitope cluster consisted form 5exogenous epitopes might be an important candidate for the reinoculating HB vaccine or therapy HB vaccine.
【Key words 】Vaccines ；Hepatitis B virus ；Hepatitis B surface antigens ；Epitopes ，T-lymphocyte
乙肝疫苗是目前预防乙型肝炎病毒（HBV ）感染的重要手段。

但近20年的实际应用发现，西方人种
按推荐方案接种的无应答（血清抗-HBs 含量<10
IU /L ）
率和低应答（血清抗-HBs 含量10～100IU /L ）率为5%～10%，母婴阻断失败率约为10%［1，2］。

东方人种的情况更为严峻，无或低应答率达10%～
15%，母婴阻断失败率达18%，高水平HBV DNA母
亲的阻断失败率可高达39.2%［3］。

乙肝疫苗接种失败的原因主要包括疫苗质量、接种方法、病毒感染或变异及宿主的年龄、性别、胖瘦、健康水平和遗传素质等方面。

其中消除个体素质特殊性对疫苗应答效果的影响是疫苗研究的难点之一。

在个体素质方面，目前已明确一些II类人类白细胞抗原（human lymphocyte antigen，HLA）的等位基因类型，如DRB1 *3、DRB1*7、DQB1*0202和DPB1*1101等，不利于乙肝疫苗产生抗体反应［4］。

东方人种不应答者主要表现为DRB1*4或DR14/DR52杂合体［5，6］。

改良乙肝疫苗以有利于该部分人群应答可望提高HBV感染的防治水平。

为此，本研究将人群应答良好的其他抗原中的通用辅助T淋巴细胞（helper T lymphocyte，HTL）表位，以及能与上述应答不良HLA II类抗原特异结合的HTL表位采用基因拼接技术以单个或复合表位的形式插入HBV S基因中，并采用DNA免疫的方式评价其对HBV S基因的体液免疫应答的影响。

材料与方法
一、材料
1.实验动物：6周龄雌性BALB/c（H-2d）二级小鼠，共80只，体重为13.2～15.2g，平均为14.2g±0.8g，购自广州中医药大学实验动物中心。

2.试剂:pUMTE5为本课题组构建的重组载体，可编码5种HTL表位，依次为结核杆菌热休克蛋白65的氨基酸残基（amino acid residues，aa）1～20片段（tuberculosis epitope，TBE）、风疹蛋白E2-4的aa54～65片段（German measles epitope，ME）、人工合成HTL 表位（pan-DR epitope，PADRE）、沙眼衣原体热休克蛋白60的aa35～48片段（chlamydia trachomatis epitope，CE）和破伤风类毒素的aa830-843片段（tetanus toxoid epitope，TTE）。

5种HTL表位中，TTE和PADRE为通用表位，可与多种类型的HLA II类抗原结合。

TBE、ME和CE为特异性表位，分别与乙肝疫苗应答不良的HLA II类抗原类型DRB1*3、DRB1*4和DRB1*7特异结合。

pcDNA3和pTZ19U-HBV（含双拷贝adw亚型HBV基因组）由中山大学附属孙逸仙医院黄志明教授提供。

引物从上海博亚生物工程公司合成，具体序列见表1。

Pfu DNA聚合酶（一种具有校对功能的耐热DNA聚合酶）和T4DNA连接酶购自美国Promega公司。

DNA凝胶回收纯化和质粒提取试剂盒购自德国Qiagen公司。

表1构建外源HTL表位HBV S基因重组载体的
引物和寡核苷酸片段
名称序列
HBSF15'TCCAAGCTTA TGGAGAACAT CACATCAGGA TTCCTA-
GGACCC3'
HBSF2-P15'TCCAAGCTTA TGGGATCCGA GAACATCACA TCAGGA-TTC3'
HBSF2-P25'TCCGAATTCT TTTGTTAGGG TTTAAATGTA TACC3'
TBE-P15'TCAGGATTCC TAGGACCCAT GGCTAAAACC ATCGCC3' TBE-P25'TCCGGATCCA TTCAGACCAC GTTCCAG3'
PADRE-P15'TCAGGATTCC TAGGACCCGC TAAATTCGTT GCTGCC3' PADRE-P25'TCCGGATCCA GCGGCAGCTT TCAGGGT3'
TTE-P15'TCAGGATTCC TAGGACCCCA GTACATCAAA GCTAAT3' TTE-P25'TCCGGATCCT TCGGTGATTC CGATAAAC3'
MTE2-P5'TCCGGATCCT CCCTGCAGCC AGTGTCC3'
二、方法
1.真核表达重组载体构建方案:计划共制备7种重组载体，其中1种为HBV S基因真核表达重组载体，6种为外源HTL表位HBV S基因真核表达重组载体。

HBV S基因真核表达重组载体是在载体pcDNA3的限制性内切酶HindⅢ和Eco RI之间插入HBV S基因。

在S基因的起始密码后增加一个限制性内切酶Bam HI位点，以便插入外源HTL表位而制备外源HTL表位HBV S基因真核表达重组载体。

外源HTL表位采用PCR方法从pUMTE5质粒中获得，即3种单个表位:TBE、PADRE和TTE，3种复合表位:MTE2（含TBE+ME）、MTE3（含TBE+ME+ PADRE）和MTE5（含TBE+ME+PADRE+CE+ TTE）。

纯化后的外源HTL表位再与翻译HBsAg氨基端前11个氨基酸的DNA片段进行互补延伸拼接（splicing by overlap extension）［7］。

最后将拼接产物插入到HBV S基因真核表达重组载体的限制性内切酶HindⅢ和Bam HI之间，从而获得外源HTL表位HBV S基因真核表达重组载体。

HBV S基因真核表达重组载体中的HBV S基因与天然HBV S基因相比仅在翻译起始密码之后多了2个限制性内切酶编码的氨基酸。

这样可最小程度地改变疫苗的高级结构。

在外源HTL表位前加有编码HBsAg氨基端前11个氨基酸的DNA片段，以减小外源HTL表位对重组HBsAg分泌的影响。

2.HBV S基因克隆和DNA序列分析:以HBSF2-P1和HBSF2-P2为引物，以质粒pTZ19U-HBV为模板进行PCR扩增。

PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离，测定其分子大小，切下条带并采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收。

采用Eco RI和HindⅢ
分别消化纯化产物和pcDNA3，其纯化产物混合后经T4DNA连接酶连接过夜，再转化至大肠杆菌JM109。

常规提取重组质粒，采用Eco RI和HindⅢ进行限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism analysis，RFLP）。

根据插入片段的大小进行初步鉴定，并以DNA序列分析进行最后确认。

DNA序列分析在上海博亚生物工程公司的全自动序列分析仪上进行。

获得的重组质粒命名为pHB。

3.外源HTL表位片段制备:以pUMTE5为模板，以TBE-P1和TBE-P2为引物扩增单个表位TBE，以PADRE-P1和PADRE-P2为引物扩增单个表位PADRE，以TTE-P1和TTE-P2为引物扩增单个表位TTE，以TBE-P1和MTE-P为引物扩增复合表位MTE2，以TBE-P1和PADRE-P2为引物扩增复合表位MTE3，以TBE-P1和TTE-P2为引物扩增复合表位MTE5。

获得TBE、PADRE、TTE、MTE2、MTE3和MTE5等单个或复合HTL表位再分别与HBSF1片段进行互补延伸拼接。

拼接产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离，测定其分子大小，切下条带并纯化回收。

4.外源HTL表位HBV S基因克隆、DNA序列分析和重组载体DNA大量制备：采用Eco RI和Bam HI 分别消化纯化产物和pHB，纯化后经T4DNA连接酶连接过夜后转化至大肠杆菌JM109。

提取重组质粒采用RFLP进行初步鉴定。

然后，在上海博亚生物工程公司的全自动序列分析仪上进行DNA序列分析。

获得的重组质粒分别命名为pHB-TBE，pHB-PADRE，pHB-TTE，pHB-MTE2，pHB-MTE3和pHB-MTE5。

用质粒提取试剂盒大量提取上述重组质粒。

提取的质粒溶于生理盐水中，在紫外分光光度仪上调整质粒浓度至1µg/µl。

5.DNA免疫和抗-HBs检测:80只雌性BLBA/c 小鼠随机分成8组，空白组和pcDNA组各5只，实验组每组各10只。

每只小鼠左后大腿肌肉多点注射盐酸布比卡因100µl（1µg/µl）进行预处理。

5天后每只在预处理部位接种100µl（1µg/µl）重组质粒或质粒pcDNA3，空白对照组注射等体积生理盐水。

3周重复1次，共3次。

第三次接种后1月摘眼球取血分离血清进行抗-HBs检测。

小鼠血清抗-HBs的检测采用美国Abbott公司试剂盒（IMx AUSAB），按操作说明进行。

取小鼠血清155µl加入检测样皿中，然后放入IMX TM中进行检测，结果以IU/L表示，各组结果与pHB组比较，大于1时表示有促进作用。

6.统计分析:小鼠血清抗-HBs用几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）表示，用Student-Newman-Keuls-q检验进行统计分析。

各组免疫应答率之间的比较采用Fisher精确概率计算方法。

统计分析软件为SPSS10.0for Windows。

结果
1.HBV S基因克隆和DNA序列分析:以重组质粒pTZ19U-HBV为模板进行PCR扩增，获得了700 bp左右大小的DNA片段，与理论长度711bp相符。

经限制性内切酶HindⅢ和Eco RI消化，将其克隆至pcDNA3的相应限制性内切酶位点上。

获得的真核表达重组质粒经RFLP分析初步证明了克隆的正确性（图1）。

最后经DNA序列分析确定其序列完全正
确。

1、6.分子量标准（分别为DL2000和DL15000）；2.HBV S
基因片段；3.重组载体，经Eco RI和HindⅢ限制性核
酸内切酶消化；4、5.分别为重组载体和空载体经Hind
Ⅲ限制性核酸内切酶消化
图1HBV S基因重组载体RFLP鉴定分析
2.外源HTL表位制备:采用PCR成功地从pUMTE5扩增出HTL单个或复合表位片段（图2A）。

经互补延伸拼接获得了含HBV S基因小片段和相应限制性酶切位点的表位DNA片段，其分子量均与设计相符（图2B）。

3.HTL表位片段克隆至HBV S基因载体及其DNA序列分析:系列HTL表位经HindⅢ和Bam HI 限制性内切酶消化后插入pHB重组质粒中。

亚克隆重组质粒经HindⅢ、Bam HI和Eco RI等三种限制性内切酶消化后，获得的插入片段与理论长度相符（图3）。

DNA序列分析确定其序列完全正确。

4.DNA免疫结果:80只BALB/c小鼠接种不同
A B
A为HTL单个或复合表位片段；B为含HBV S基因小片段的相
应表位；A、B图中的条带从左到右依次为1.PADRE、2.TTE、3. TBE、4.MTE2、5.MTE3和6.MTE5、7.分子量标准（DL2000）
图2凝胶电泳分析外源HTL
表位制备产物
1、3、5、7、9、11分别为HTL表位PADRE、TTE、TBE、MTE
2、MTE3和MTE5，系纯化PCR产物；2、4、6、8、10、12分别为HTL表位的相应
重组质粒，13为pHB重组质粒，经限制性核酸内切酶HindⅢ、Bam HI和Eco RI消化；14为分子量标准（DL2000）图3外源HTL表位HBV S基因重组载体RFLP鉴定分析
重组载体后的抗-HBs检测结果见表2。

空白组和空载体pcDNA3组的抗-HBs均为阴性。

其他各组的抗-HBs血清转化率在30%～80%之间，抗-HBs水平在0～330.5IU/L之间。

三种单个HTL表位中，PADRE促进作用最明显（与pHB组相比，t=-2.29，P=0.048），TTE有促进作用但差异无显著意义，TBE则无促进作用。

3种复合HTL表位MTE2、MTE3和MTE5均表现出促进作用，且3者之间差异无显著意义。

与单个HTL表位相比，其促进作用高于TBE表位，低于PADRE和TTE，但差异均无显著意义。

各组之间的血清转化率差异无显著意义。

表2外源HTL表位对HBV S基因免疫应答的
影响（GMT±S.E，IU/L）
组别鼠数
抗-HBs
阳性例数浓度
促进作用
空白对照50--pcDNA350--pHB10610±5-pHB-TBE1035±50.52 pHB-PADRE10849±7* 4.69 pHB-TTE10729±6 2.76 pHB-MTE210716±8 1.56 pHB-MTE310623±7 2.23 pHB-MTE510728±8 2.65注：*与pHB组比较，t=-2.29，P=0.048
讨论
外来抗原与HTL表面上的HLA II类抗原分子结合是抗原提呈和HTL活化的重要环节，是大部分抗原产生抗体应答的先决条件［8，9］，并呈现出两种特性。

一是某些抗原表位可与多种类型HLA II类抗原分子结合，即所谓的通用HTL表位，另一些则只与某一类HLA II类抗原分子结合，如结核杆菌的HSP65蛋白的某些表位则主要与HLA-DRB1*3结合［10］。

本研究选用的HTL表位中，TTE和PADRE 表位为通用HTL表位，而TBE、CE和ME分别主要与DRB1*3、DRB1*4和DRB1*7等HLA II类抗原结合［11，12］。

乙肝疫苗在HLA II抗原类型为DRB1* 3、DRB1*4和DRB1*7的个体不发生免疫应答提示，乙肝疫苗可能是未充分与这些类型的HLA II类抗原有效结合。

一些研究已初步证明了这一点，如改变HBsAg中的HTL表位可使先天对HBsAg不应答的小鼠发生免疫应答［13］，将一个功能较强的破伤风类毒素HTL表位（TTE，aa73-99）插入HBsAg中，可以显著的提高HBsAg的免疫原性［14］。

TTE、PADRE和TBE以单个表位形式插入HBV S基因中进行比较研究显示，TBE无促进作用，而TTE和PADRE具有良好的免疫促进作用。

有研究表明TTE可促进HBcAg中的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位发生强烈的免疫应答［15，16］，本研究提示TTE还具有促进体液免疫应答作用。

PADRE具有广泛地免疫促进作用，可增强多种抗原的CTL反应［17-20］和体液免疫应答［21-23］。

但这类研究主要是以多肽（peptide）或脂多肽（lipopeptide）形式进行免疫接种。

仅个别使用DNA 拼接方式进行CTL反应研究［24］。

本研究表明，PADRE直接插入基因，并采用DNA免疫接种也可获得较好的体液免疫促进效果。

PADRE直接插入基因后，无任是获得重组蛋白后进行免疫接种，还是采用DNA形式直接进行免疫接种均更加有利于疫苗的大批量制备和广泛应用。

TBE以单个表位形式插入HBV S基因中无免疫促进作用的原因目前尚不清楚，但不排除本研究所用小鼠的HLA II类抗原类型不能与TBE有效结合的情况。

许多应答良好的抗原均有多个HTL表位，如破伤风类毒素和结核杆菌的HSP65等，表明复合HTL 识别表位可能是克服HLA多态性对疫苗应答影响的根本途径。

获得多个HTL表位的简单办法是与大蛋白交联，然而大蛋白本身存在免疫应答，会干扰
外源抗原的免疫应答。

因而常不能获得满意效果［25］。

为此，本研究仅取应答效果好的抗原的相应HTL表位，采用基因拼接方法以不同的组合方式插入HBsAg中，通过DNA免疫的方式比较显示，2种、3种和5种HTL表位组合而成的复合表位均有不同程度的免疫增强作用，但与单个表位比较似乎各HTL表位的增作用无协同或迭加效果，同时不排除部分表位可能存在相互干扰。

因而协助HBsAg免疫应答的最佳表位组合可能需要更多的试验进行筛选。

复合表位在克服人群HLA多态性对乙肝疫苗免疫应答的影响方面的作用也需进一步评价。

表位PADRE的免疫促进效果最好，可能成为新型高效乙肝疫苗的重要候选表位，而5种表位构成的复合表位可能成为能克服HLA多态性的乙肝补种疫苗或治疗性疫苗的重要候选复合表位。

DNA 免疫在评价重组蛋白的免疫效果方面具有快速和简便的优点，但实验中可见部分小鼠无应答，目前尚不能确定其原因是DNA免疫方法本身的问题，还是重组蛋白构型或在体内表达等方面的问题。

但许多其它DNA免疫研究中也有类似的问题［26］，因而是DNA免疫方法本身的问题的可能性大。

今后有必要将重组真核载体pHB-PADRE-和pHB-MTE5进行真核细胞表达，并纯化重组蛋白进行大动物研究以便探讨其应用前景。

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（收稿日期：2002-07-17）
（本文编辑：刘雪松）。