氯磺酸-吡啶法酯化修饰海参岩藻聚糖硫酸酯的研究

氯磺酸-吡啶法酯化修饰海参岩藻聚糖硫酸酯的研究
王瑞芳;吴光斌;谢远红;陈素艳;李莉莉
【摘要】用氯磺酸-吡啶法对海参岩藻聚糖硫酸酯进行酯化修饰，考察了硫酸酯化剂比例、反应温度及反应时间对酯化效果的影响.通过正交实验，优选出最佳酯化工艺条件：吡啶与氯磺酸体积比为1：1，反应温度为50℃，反应时间为2h；硫酸基的含量由10.75%可提高至59.53%；红外光谱分析结果显示，酯化后硫酸酯的特征吸收峰显著增强.抗氧化活性测定显示，硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯对DPPH自由基和羟基自由基的清除率均显著提高.%Sulfated sea cucumber fucoidan (SSC-FUC) was prepared by the reaction of sea cucumber fucoidan (SC-FUC)with chlorosulfonic acid- pyridine. The effects of esterification agent ratio,reaction time and reaction temperature on sulfation properties were studied by orthogonal test design aiming to discuss the optimized sulfated esterifying technology for SSC-FUC. The optimized preparation condition for SSC-FUC were obtained as volume ra-tio of chlorosulfonic acid to pyridine 1:1,reaction time 2h and reaction temperature 50℃. The sulfur content could reach 59.53%fr om 10.75%. FTIR suggested that the characteristic absorption peak of sulfate significantly enhanced. Anti-oxidation analysis revealed that ability of SSC-FUC on scavenging DPPH and hydroxyl radical had been im-proved a lot.
【期刊名称】《内蒙古民族大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2016(031)004
【总页数】5页(P288-292)
【关键词】海参岩藻聚糖硫酸酯;硫酸酯化;抗氧化活性
【作者】王瑞芳;吴光斌;谢远红;陈素艳;李莉莉
【作者单位】集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021;集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021;集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021;集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021;集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021
【正文语种】中文
多糖硫酸酯化后可提高多糖的水溶性、增加其抗病毒活性中起重要作用的负电荷、改变多糖的空间立体结构，从而使其表现出更为广泛的生物学活性，如抗凝血、增强免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等〔1～7〕.自发现硫酸酯化多糖可抑制艾滋病病毒（HIV）的活性以来〔8～11〕，多糖硫酸酯化研究已成为多糖研究领域的热点. 海参岩藻聚糖硫酸酯（sea cucumber fucoidan，SC-FUC）是一类主要有岩藻糖及硫酸酯基团组成的多糖类物质，具有抗凝血、增强免疫、抗胃溃疡、抗氧化等多种功能〔12～18〕.而低值海参（海地瓜）口感差，精深加工产品少，资源利用不充分，SC-FUC的提取是实现其资源有效利用的重要途径之一.本研究组以低值海参为原料，经酶解提取、膜分离、醇沉、冻干后得SC-FUC粗品，其硫酸基含量为10.75%.本文以此粗品为原料，进一步硫酸酯化，研究硫酸酯化的工艺条件对酯化效果的影响，并考察了SC-FUC酯化前、酯化后清除DPPH自由基和羟基自由基的能力，以期了解酯化修饰对SC-FUC抗氧化活性的影响.所采用的酯化方法为氯磺酸-吡啶法〔19～23〕，N，N-二甲基甲酰胺为分散剂.关于SC-FUC的硫酸
酯化研究，目前还未见相关报道.
1.1 试剂材料海参岩藻聚糖硫酸酯粗品（硫酸基含量为10.75%），为本实验室自制；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯磺酸、吡啶、氢氧化钠、乙醇等试剂，均
为分析纯.
1.2 仪器设备旋转蒸发仪（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）；真空冷冻干燥
机（JDG-0.2B型，兰州科近真空冻干技术有限公司）；傅里叶红外光谱仪
（FT/IR-480型，日本岛津公司）；紫外可见分光光度计（Cary50型，美国Varian公司）；磁力加热搅拌器（WCT-200型，常州国华电）.
1.3 海参岩藻聚糖硫酸酯的酯化
1.3.1 酯化试剂的制备：无水吡啶置于150mL锥形瓶中，冰水浴冷却至0℃，磁
力搅拌下按照一定比例缓慢滴加氯磺酸，得淡黄色酯化试剂，现配现用.
1.3.2 酯化反应：取10mL DMF置于制备酯化剂的反应瓶中，加热至反应温度，
磁力搅拌下加入100mg的SC-FUC粗品，保温反应一定时间；反应结束后滴加
2mol/LNaOH水溶液至pH值为7.然后装入透析袋透析72h.旋蒸浓缩10倍后加入三倍体积的95%乙醇，4℃下醇沉24h，离心分离后将沉淀冷冻干燥，得到硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯（sulfated sea cucumber fucoidan，SSC-FUC）.
1.4 硫酸基含量的测定采用明胶-比浊法〔24〕测定硫酸基的含量.首先以硫酸钾为标准品制作标准曲线，得出吸光度（Y）对硫酸基浓度（X）的一元线性回归方程：Y=0.7030X+0.0148，R2=0.9992，线性范围:0～0.6 mmol/L，然后精确称取各
样品，按照明胶-比浊法的操作步骤进行测定，根据标准曲线求出各样品中硫酸基
的量.
1.5 红外光谱分析称取SC-FUC和SSC-FUC适量，分别与KBr研磨压片，在500～4000cm-1范围内进行红外扫描.
1.6 SC-FUC和SSC-FUC抗氧化活性的测定清除1，1-二苯基-苦肼基自由基
（DPPH·）的测定：取各浓度的样品溶液2.0 mL和0.1 mmol/L的DPPH·-乙醇
溶液2.0 mL，充分混合均匀，在室温下避光静置30 min，在波长517 nm处测
得吸光值记为A（S用50%的乙醇调零）.按照相同的操作方法，以2.0 mL无水乙醇代替DPPH·-乙醇溶液，吸光值记为A；以2.0 mL无水乙醇代替样品溶液，吸
光值记为A0.DPPH·清除率计算公式见式1.
清除羟基自由基（·OH）的测定：反应体系依次加入1.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.40，1 mol/L）、1.0 mL番红花红试剂（100 μg/mL）、1.0 mL EDTA-Fe2+
试剂（1 mmol/L）、0.5 mL各浓度样品溶液以及1 mL 3%H2O2溶液，混合均匀，37℃下保温静置30 min，波长520 nm处测得吸光值记为A（S用1.0 mL
磷酸盐缓冲液加3.5 mL蒸馏水调零）.按照相同的操作方法，以1.5 mL蒸馏水代替样品和H2O2溶液，吸光值记为A；以0.5 mL蒸馏水代替样品，吸光值记为
A0·.OH清除率计算公式见式2.
2.1 海参岩藻聚糖硫酸酯酯化的单因素试验结果
2.1.1 酯化剂的比例对硫酸酯化效果的影响：调节吡啶和氯磺酸的体积比为0.6:1、1:1、1.67:1、3:1，30℃下反应1h，考察不同酯化剂比例对硫酸酯化效果的影响.
实验结果如图1所示，硫酸基含量随着两者比例的增加先上升后下降.氯磺酸是一
种强酸性物质，当体积比0.6:1时，反应体系中氯磺酸的含量太高，酸性太强，多糖部分降解，影响了硫酸酯化的效果.但当吡啶和氯磺酸的体积大于1:1时，硫酸
基含量随着两者比例的增加而迅速下降.吡啶和氯磺酸的体积比太大或太小，都会
影响硫酸酯化的效果.
2.1.2 反应温度对硫酸酯化效果的影响：调节吡啶和氯磺酸的体积比为0.6:1，分
别在30℃、50℃、70℃和90℃下反应1h，考察反应温度对硫酸酯化效果的影响. 由图2可以看出，在温度低于50℃时，随着反应温度的增加，硫酸基含量逐渐升高；在50℃时，硫酸基含量最高达到23.82%，但当温度从70℃升至90℃时，硫
酸基含量却有所下降.原因可能在于：海参岩藻聚糖在高温的酸性环境下，发生了
降解，导致了硫酸基含量先升高后降低的现象.
2.1.3 反应时间对硫酸酯化效果的影响调节吡啶和氯磺酸的体积比为0.6:1，30℃
下分别反应1、2、3、4 h，考察反应时间对硫酸酯化效果的影响.
图3可见，当酯化温度和酯化剂配比一定时，随着反应时间的增加，硫酸基含量
先升高后有所下降.一定范围内，酯化时间增加，有助于酯化反应的进行；但是在
高酸性的条件下，酯化时间过长，也会引起多糖的部分降解，导致酯化度有所下降.
2.2 海参岩藻聚糖硫酸酯酯化正交试验结果在单因素实验的基础上，采用正交实
验法确定SC-FUC硫酸酯化的工艺条件.按照氯磺酸与吡啶的体积比、反应温度和
反应时间做三因素三水平L（933）正交试验，实验结果列于表1.
由表1可以看出：运用氯磺酸-吡啶法进行SC-FUC的酯化修饰，影响酯化反应因素的主次顺序为C＞A＞B，即反应时间对酯化度影响最大，其次是酯化剂的比例
和反应温度.最佳工艺组合为A2B2C2，即吡啶和氯磺酸的体积比为1∶1，反应温度为50℃，反应时间为2h，该工艺组合不在正交设计表中，故需作验证试验，验证结果显示，在此最佳工艺条件下，SC-FUC酯化后硫酸基的含量可达到59.53%.
2.3 红外光谱分析图4为SC-FUC和SSC-FUC的红外光谱图，图中3422 cm-
（1O-H及N-H的伸缩振动峰）、2936 cm-（1C-H伸缩振动峰）、1654 cm-（1C=O的伸缩振动峰）和1045cm-（1C-O-C的伸缩振动峰）都是多糖的特征
吸收峰，而1240cm-（1S=O伸缩振动峰）和848cm-（1C-O-S的伸缩振动峰）是硫酸酯的特征吸收峰〔25，26〕，酯化后硫酸酯的特征吸收峰显著增强.
2.4 SC-FUC和SSC-FUC的抗氧化活性不同浓度的SC-FUC和SSC-FUC溶液对DPPH·及·OH的清除效果如图5所示.从图5可看出，随溶液浓度的上升，两种糖
对DPPH·及·OH的清除效果均增大；SSC-FUC对DPPH·及·OH的清除效果显著
优于SC-FUC，由此可见SC-FUC硫酸化修饰后抗氧化活性显著提高.可能是因为
糖链引入硫酸基后，分子极性增强，由于静电排斥使糖链较为伸展，黏度降低，更易与自由基结合〔27～29〕.
采用氯磺酸-吡啶法可对SC-FUC进行酯化改性，其最佳酯化条件为：吡啶和氯磺酸的体积比为1∶1，反应温度为50℃，反应时间为2h；硫酸基的含量由10.75%可提高至59.53%.傅立叶红外光谱分析结果表明，酯化后硫酸酯的特征吸收峰显著增强.抗氧化活性测定显示，SC-FUC的酯化改性利于其抗氧化活性的提高. 〔1〕Zhang M，Cui S W，Cheung P C K，et al.Antitumor polysaccharides from mushrooms:a review on their isolation process，structural characteristics and antitumor activity〔J〕.Trends in Food
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