间接免疫荧光讲

试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺wenku.baidu.com层浸湿的纱布垫）
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒 内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸 泡，每缸3-5 min，不时振荡。
间接免疫荧光法
(Indirect immunofluorescence, IFA)
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原 反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧 光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗 原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病 毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免 疫病理检查。染色程序分为两步，第一步，用未知 未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上， 在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然 后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标 记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步 发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和 已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗 体。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项
1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一 定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度 过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原 而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min 已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于 37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性 乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。 低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
• 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，
阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就 有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。