细胞凋亡实验报告

实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测

一、实验目的

学习细胞凋亡诱导及检测。

二、实验原理

1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细

胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学

过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。

2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与

DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。

三、实验材料

8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液

四、实验步骤

1.细胞传代（上一次实验完成）

2.凋亡诱导

1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L

2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。

3. 染色

1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗

2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min

3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min

4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜

下观察并拍照。

五、实验结果与分析

1.观察：

实验开始前镜检：

细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。

染色后：

由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。

视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。

凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因

为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显

的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。

另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在

一起。

2.照片及分析：

Control:对照组的细胞核形态正常，表面光滑，染色质均一。

Stage Ⅰ：凋亡前期的细胞染色质凝集化，可以看到染色不均一，细胞核形态发生变化，表面不再光滑，核轮廓不规则。

Stage Ⅱa ：凋亡中期细胞核固缩，染色体凝集化边缘化，细胞核仍然形状不规则。

Stage Ⅱb ：凋亡后期核崩解，成为碎片，可以看到颗粒状的染色体碎片，它们会形成凋亡小体。

六、 讨论

1. 细胞凋亡的意义

确保正常生长、发育（如胎儿发育中指间蹼的消失），维持内环境稳定，发挥积极地防御功能

2. 区分凋亡、坏死

从形态学上区分：主要区别在于凋亡细胞膜完整直到形成凋亡小体且不释放细胞内含物；坏死细胞细胞膜破损且释放内容物

从信号通路区分：线粒体内凋亡信号入核，引发核内调控细胞凋亡的基因表达；细胞坏死则没有准确的信号通路

3. 荧光显微镜下区分凋亡和分裂细胞

分裂细胞两个大小基本一致，最重要的是核均匀

凋亡细胞核不均匀

4. 凋亡细胞特点

图1 Hela 细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化DAPI 染色（图片来自我拍的照片，用photoshop 把不同凋亡时期的不同细胞放在了一张图里以便观察。） control Stage Ⅰ

Stage Ⅱa Stage Ⅱb

细胞空泡化，体积缩小。

早中期：核固缩，核轮廓不规则，有深染区域

后期前期：出芽，染色体凝集化边缘化

后期：核崩解，成小碎片，被膜包围形成凋亡小体

5.本次实验应该注意的地方

1）由于会发生荧光淬灭，加入DAPI染色后要尽量避光操作；在显微镜下观察拍照时，要先用可见光找到细胞，再转换到紫外光拍摄，因为紫外对荧光的

淬灭效果比可见光强很多

2）实验要求设置阴性对照，不然无论什么结果都无法说明问题，由于材料有限，我们的阴性对照是由一位同学完成的

3）每一个步骤后都要PBS洗掉上一步的试剂，避免对下一步的影响。

4）在显微镜下观察时要操作迅速，因为细胞会变干而发生改变，而且紫外照射过久发生荧光淬灭也不不利于观察

七、实验小结

这次的实验其实是三天完成的，第一天传代，第二条诱导，第三天染色及观察，每

一次的操作都会对后续实验有所影响。比如第一天传代的时候如果能做得比较好，

得到细胞较多，在染色时可见较多贴壁细胞，就可以省去很多离心的步骤，使实验

变得简单。诱导的操作很简单，但是要理解它的意义，首先，细胞凋亡分自发凋亡

和诱导凋亡，诱导凋亡又有物理、化学、生物诱导之分，我们采取的是化学诱导法，即利用化学试剂双氧水进行凋亡诱导；然后，我们在诱导后24小时染色观察，这个时间是经过大量对照的实验得出来的，凋亡并不是同步的，但是在24小时，已经有很多细胞处于凋亡状态，足以观察。染色有两种方案，如果贴壁细胞多就可以直接

在平皿中进行，如果较少则需胰酶处理后经多次离心再染色制片，前者简单但是对

试剂的消耗较大，后者复杂但是更节约试剂。染色要求我们对染料有基本的认识，

DAPI染料会发生荧光淬灭，所以要注意避光，另外，它是一种很强的染料，所以不用担心放得太久会褪色（和H.E染色不同），知道这些在操作中便更清楚哪些是要小心地，哪些是不用担心的。

八、参考资料

细胞生物学实验指导王宏英、吴逸、常智杰、王伟 2007