整理)慢病毒稳转细胞株步骤
2020年整理)慢病毒稳转细胞株步骤
作者：空青山作品编号：89964445889663Gd53022257782215002时间：2020.12.13稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》）（大肠杆菌-８0℃保存2-3年,质粒-２0℃保存2—3年,病毒液—80℃保存１年)(１)载体质粒:两端得LＴR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于env序列中得RRＥ,含宿主RNＡ聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）:包含了pｏl、gａｇ包装成分（３）包膜质粒（pＭD2、G):用其她病毒得包膜蛋白代替了ｅnv基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTＲEME—ＧENＥ(－20℃保存，不可分装），一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存)：5ＸPＥG800０／NaＣｌ溶液(聚乙二醇)：NaCl ８、766 g; PEG８00050ｇ溶解在2０0mｌMilｌi-Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存３天）:滴度一般为10８TU/ml6、10ｍｇ/ml polyｂreｎｅ（-20℃分装保存）:溴化己二甲铵。
就是带正电得小分子，与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏｌybrｅnｅ能提高感染效率２～1０倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度(1～１0μｇ/ｍl）7、无血清培养基:ｏｐtｉmｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、puromｙcin:嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤＜一〉病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,10×1０５个293Ｔ细胞，加入全培养基双抗ＤMＥM４—5ml，过夜2、配制5ＸPＥG８0０0/NaCl溶液称取NaCｌ8、766 g； PEG800０ 50g溶解在200ml Miｌli-Ｑ纯水中;1２1摄氏度３０miｎ湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天１、配管2、加入２ml全培养基DMEM3、将1加入2,孵育10ｈ，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9：00与1７：0０各收取一次5ｍｌ培养液,共20mｌ（－80℃保存)2、过滤:用孔径为０、４5mm得过滤器除去上清中得29３T细胞3、加入5ml 5ＸPEＧ８０0０/NaＣｌ溶液,每30miｎ－1ｈ上下摇匀一次4、４℃过夜第六天１、4℃,3500rｐｍ，20ｍiｎ２、弃上清,倒扣纸上静置1－2min，吸干残余液体３、加入120—１50μlＰBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶４、５0μｌ分装，—80℃保存。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
慢病毒转染细胞的操作具体方法及步骤
慢病毒转染细胞的操作步骤
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml 新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
(完整word版)Vigene稳转株构建流程
Vigene 稳转株构建流程稳转株即稳定表达细胞株，指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。
慢病毒感染-药物筛选法是目前广泛应用的稳转株构建方法，具有高效整合、目标细胞广泛等特点。
一．准备及预实验1.确定细胞系相关信息，需包括如下内容注:为避免慢病毒感染后细胞死亡，务必保证细胞无支原体污染！2.预实验确定MOI值（1）查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI；（2）参考查阅得到的数据，设计梯度实验,摸索最适MOI。
3.预实验确定筛选药物用量:（1）查阅Puromycin/Blastincidin等在目标细胞系中稳转株筛选的致死用量信息；（2）参考查阅得到的数据，确定3个药物浓度梯度（如没有相关信息，则需将药物浓度梯度范围增大，数量增多至6个）；（3）Day0将细胞铺于6孔板中，使Day1细胞融合度约90%；（4）Day1按(2）中设置的药物梯度，加入药物；（5）Day4换液，并重新加入药物；（6）Day7观察，找到致死率100％的孔，该孔使用的药物浓度，即为药物筛选浓度。
附1：经验筛选药物用量二．稳转株筛选及构建注:以下实验参数，按1株稳转株为例描述，实验需考虑有无对照稳转株！4.细胞铺板：将细胞接种于6孔板中（4个孔），使次日细胞融合度约70％5.病毒感染：根据预实验确定的MOI值,计算慢病毒体积,添加慢病毒(每孔添加ADV-HR 2μL）; 6.换液：慢病毒感染次日，将细胞进行换液处理；7.观察感染效率：感染后72小时，观察感染效率,效率最低不应低于40%。
8.筛选:（1）多克隆稳转株:从感染72小时后开始于6孔板中加筛选药物，每隔2天,重新换液加入药物.药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察荧光细胞比例为100%。
注：第一次加入药物时在上午进行，4—6小时后观察细胞状态，如细胞死亡过多，需更换新鲜不含药物的培养基。
附2：多克隆稳转株多克隆稳转株的荧光通常强弱夹杂。
如何构建慢病毒稳转株
如何构建慢病毒稳转株构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含抗性基因进行筛选。
最常用的真核表达载体抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)。
常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
慢病毒感染方法筛选单克隆是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间稳定表达。
因此，慢病毒常用于制备稳定表达、沉默特定基因的单克隆细胞株。
特点及优势1. 长期在细胞中研究基因的功能（>2周）；2. 使用诱导表达系统，这主要是由于：a)过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素；b)目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。
3. 动物实验，需将细胞注射到动物体内；流程及注意事项1. 慢病毒载体构建，过表达载体或者干扰载体构建慢病毒过表达载体有基因容量限制，对于大于5k的基因，包装出慢病毒的概率很低，不建议包装病毒。
同时大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低，在做正式实验之前，可用先进行病毒的小量包装，成功后再进行病毒大量包装。
对于敲低，通常的策略是对一个基因同时选择3个干扰靶点，通过qPCR验证干扰效率之后，使用效率最好的靶点进行下一步实验。
慢病毒载体带有不同的标签，如果研究细胞定位，可以选择带荧光标签的慢病毒载体，比如带GFP/RFP等；如果准备筛选稳转细胞株，可以选择带筛选标签的慢病毒载体，比如puro/neo等载体；如果目的基因大小适中，也可以选择同时带荧光标签和筛选标签的载体。
2. 293T细胞培养及慢病毒包装细胞的状态对于病毒包装有很大的影响，如果细胞状态不好可能不出毒或者出毒量很低。
取状态良好，处于对数生长期的293T细胞进行慢病毒包装。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂１、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》)(大肠杆菌-８０℃保存2－3年,质粒－20℃保存2-3年,病毒液－８０℃保存1年)(1)载体质粒:两端得LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于eｎv序列中得RRE,含宿主RＮA聚合酶识别部分(2)包装质粒(psPAX2):包含了pol、ｇag包装成分(3)包膜质粒(pMD２、Ｇ):用其她病毒得包膜蛋白代替了env基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞:2９3T细胞3、菌株:大肠杆菌,用于提取质粒4、转染试剂:XTＲEＭE—GENE(-20℃保存,不可分装),一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂(配好后4℃保存,原材料室温保存):5X PEＧ8000/NaCl溶液(聚乙二醇):ＮaCl 8、7６6g;PEG８00050g溶解在2００ml Milli－Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊*也可直接从公司买来病毒液(—8０℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存3天):滴度一般为１08ＴU／mｌ6、10mｇ/mｌpolybrene(-2０℃分装保存):溴化己二甲铵、就是带正电得小分子,与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏlｙｂrene 能提高感染效率2~10 倍。
有一定细胞毒性,需要摸索浓度(1～1０μｇ/ｍl)７、无血清培养基:optiｍｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、pｕroｍｙcin:嘌呤霉素,用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一〉病毒包装与收集(中皿,转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,１0×1０5个293Ｔ细胞,加入全培养基双抗DMEM 4-5ｍl,过夜２、配制5X PEG80０0/ＮaＣl溶液称取ＮaCl 8。
766 g; ＰＥG8００0 50ｇ溶解在200ml Ｍilli－Q纯水中;１2１摄氏度30ｍｉn 湿热灭绝 30min;保存在４℃第二天Ａ+B混合室温静置２0miｎ2、加入2ml全培养基DMEM3、将１加入2,孵育10ｈ,换成5ｍl全培养基第四天第五天:１、9:00与17:0０各收取一次5ml培养液,共20ml(—80℃保存)2、过滤:用孔径为0、45mｍ得过滤器除去上清中得293Ｔ细胞3、加入5ml 5XPＥG8０00／NaCl溶液,每30ｍin－1ｈ上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃,3５0０rpｍ,20min2、弃上清,倒扣纸上静置１-2mｉn,吸干残余液体3、加入120－150μl PBＳ,缓慢吹打,以防形成气溶胶4、50μl分装,－80℃保存。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
最新整理病毒转染原理及步骤说课讲解
病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
稳转细胞株（系）构建方法
稳转细胞株（系）构建方法
稳转株即稳定表达细胞株，指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。
慢病毒感染-药物筛选法是目前广泛应用的稳转株构建方法，具有高效整合、目标细胞广泛等特点。
稳定转染：
转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。
需要在瞬时转染基础上对
靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，
从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。
筛选稳定细胞系有两种方法：
1）转染质粒后，筛选获得稳转细胞系；
2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。
慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
稳转株应用：
1）基因过表达服务
2）shRNA 干扰服务
3）miRNA过表达
4）任意非编码基因的过表达
稳转株构建中的常见问题
1.支原体污染问题
由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖，故被许多实验室所忽略。
但支原体易在病毒感染细胞后爆发，出现大量细胞碎片，甚至导致细胞死亡，导致稳转株筛选的失败。
我们建议在稳转株构建之初，务必排除细胞及培养环境中的支原体污染（赛业可提供稳定细胞株构建）。
2. 其他问题
除支原体污染之外，还有以下问题会经常出现于稳转株构建中。
稳转细胞株的构建
稳转细胞株的构建
稳转细胞株指的是将外源基因稳定地转入细胞，并成功表达该基因的细胞株。
构建稳转细胞株的步骤如下：（1）选择合适的表达载体：需要选择一种可以有效表达外源基因的表达载体，并确保它具有抗性基因，以便于后续的筛选技术。
（2）测序核对：将设计好的表达载体进行测序，以确保表达载体的正确性。
（3）质粒构建：采用合成DNA技术将外源DNA片段和表达载体结合起来，形成包含外源基因的质粒。
（4）转化质粒：将质粒转入细胞中，以希望能够实现外源基因的转化。
（5）筛选稳转细胞：使用抗性基因的筛选方法，选出外源基因转化成功、成功表达的细胞，即为稳转细胞株。
（6）稳定性分析：在不同环境条件下对稳转细胞株进行稳定性分析，确保该细胞株具有良好的稳定性。
shrna稳转细胞株 构建 步骤
shrna稳转细胞株构建步骤
构建shrna稳转细胞株的步骤如下：
1. 设计并合成shrna。
2. 构建包含shrna的表达载体，常用的是慢病毒载体。
3. 包装慢病毒，这一步通常需要借助病毒包装系统完成。
4. 滴度测定，测定病毒滴度是制备稳定转染细胞株的重要步骤。
5. 慢病毒感染，将目的细胞与慢病毒混合培养，使病毒进入细胞并整合到宿主染色体中。
6. 筛选稳定表达细胞株，在感染72小时后开始加入筛选药物，每隔2天重新换液并加入筛选药物。
药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察到的荧光细胞比例为100%。
7. 鉴定稳转细胞株，对筛选到的稳定表达细胞株进行鉴定，验证其是否稳定表达目的基因。
以上步骤仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
实验QA：如何用慢病毒转染构建稳转细胞系
实验QA：如何⽤慢病毒转染构建稳转细胞系这⾥说的稳转细胞系的构建是指慢病毒转染构建的稳转细胞系，可以构建表达细胞系，也能构建敲降细胞系，经常有⼈问我什么叫稳转和顺转的区别。
瞬转细胞系，⼀般情况下能够稳定表达最多长⼀周左右，⽽稳转细胞系，只要构建成功就能稳定表达，没有时间限制，但是也不是肯定的，⼀般实验构建的细胞系超过 10 代以后，这个细胞系就有可能不靠谱了。
接下来，咱们讲讲稳转细胞系的构建。
⼀般来讲 shRNA ⽤的是 HIV 病毒，虽然已经经过处理，但是⼀听这名字也觉得渗⼈，⽆论如何保护⾃⼰是在实验室永葆青春的基础，所以⼀定要保护好⾃⼰，需要⽣物安全柜（往⾥吹风最好），或者超净台（把风给关了（*^__^*））。
（下图是慢病毒构建载体⽰意图）病毒来了，需要分装，-80 保存，反复冻融影响病毒活性，⼀般情况系，我是将病毒分成 10 ul⼀管。
其次是看清你⾃⼰的病毒情况，是荧光标记（⼀般 GFP），还是⾮荧光标记（⼀般标签蛋⽩是过表达是 Flag，敲降是 scramble）。
元元做的是肿瘤相关实验，所以咱们这⾥讲的是贴壁的肿瘤细胞的稳转，⼀定注意，元元讲的是普适的⽅法，⼀定要看⼚家的说明书。
⼀般先⽤带有 GFP 荧光的病毒摸⼀下合适的病毒量。
先做⼀下预实验，（别⼈都讲 MOI 值，即感染时病毒与细胞数量的⽐值），元元不讲。
1. 慢病毒转染前 18～24 ⼩时，将贴壁细胞以 1×10^5（根据细胞⼤⼩⽽定，⼀般转染前细胞长到 40-60% 为宜）孔铺到 24 孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为 2×10^5/孔左右。
2. 加⼊ polybrene6-8 ug/ml（这个相当是破膜剂，只有细胞膜破了，病毒才有机会进⼊细胞内发挥作⽤），设置合适的病毒浓度梯度，⽐如 24 孔板，设置 5 个梯度，分别加⼊病毒量是0，1，2，3，4，5 ul，37 ℃孵育。
这时候⽤的是⽆⾎清的培养基培养。
构建细胞稳转株
构建细胞稳转株（一）慢病毒包装：1．转染前24小时，将293T细胞以4-5×106接种于10cm的大皿中，加入10ml DMEM 完全培养基，轻轻摇晃，混匀，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
注：细胞转染前密度应达到80%-90%。
3．充分混匀，离心管1，离心管2室温孵育5分钟。
4．将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
5．室温孵育转染混合液15分钟6．将步骤1准备的细胞换液（95%DMEM+5%灭活FBS）。
7．将1ml转染混合液逐滴加入换液好的细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀。
8．37℃培养。
4-6小时后，用10ml培养基换液（90%DMEM+5%灭活FBS+5%双抗）。
9．转染48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
（二）慢病毒感染待测细胞：1.取新包装的或冻存于-80℃冰箱的慢病毒于冰上缓慢解冻。
2.慢病毒与培养基（DMEM+5%灭活FBS+1%双抗）按一定的体积混匀，加转染增强剂polybrene至终浓度为10μg/ml。
3.待转染的细胞吸去原培养液，PBS洗3次。
4.把混合好的慢病毒培养基加到细胞培养瓶中进行感染。
5.将细胞培养瓶放回培养箱中培养过夜，PBS洗3次，更换为完全培养基继续培养。
6.感染72h后，荧光显微镜观察荧光，拍照，分析细胞生长状态。
（三）稳转细胞株筛选：将慢病毒感染成功的细胞继续培养，并在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。
筛选持续一周，在荧光显微镜下观察，至感染效率达到80%嘌呤霉素最佳筛选浓度测定：将对数生长期的细胞消化，均匀铺在24孔板上，5×104/孔。
隔夜将细胞换液，并设置嘌呤霉素梯度：0 ug/ml；0.5 ug/ml；1.0 ug/ml；1.5 ug/ml；2.0 ug/ml；2.5 ug/ml48 h后换正常培养基。
(2021年整理)慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验步骤编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（慢病毒包装实验步骤）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为慢病毒包装实验步骤的全部内容。
慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀,避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮.尽量少的细胞死亡,产生的病毒就越多;实验前要准备的试剂、耗材和仪器;试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基，0.25%胰酶,PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基.耗材准备：10cm细胞培养皿,6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1。
5ml，0。
22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。
仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜,电动移液器，吸引器,移液枪,二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。
第一天:上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）;实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟;把培养基和试剂放置常温；消化细胞:从37 5％的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出,加入1ml胰酶消化1—2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min，吸出上清液.细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2。
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稳转慢病毒
一、所需试剂
1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）
（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分
（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分
（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.
三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞
3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒
4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物
5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌
**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml
6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）
7、无血清培养基：optimen
8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞）
9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞
二、具体步骤
<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）
第一天
1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜
2、配制5X PEG8000/NaCl溶液
称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃
第二天
2、加入2ml全培养基DMEM
3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基
第四天第五天：
1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）
2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞
3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次
4、4℃过夜
第六天
1、4℃，3500rpm，20min
2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体
3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶
4、50μl分装，-80℃保存。
<二>慢病毒转染靶细胞
1、第一天：准备96孔板，每孔加入10000个293T，为每个病毒准备20个孔（稀释10个浓度，各2个副孔）。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
2、第二天：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入207µl培养液，往第一个管中加入23µl病毒原液，混匀后，吸取23µl加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
3、第三天：换液
4、第四天：观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）/2/X孔的病毒液的含量（µl ）×1000。
（前面算出的是没μl病毒量，所以乘于1000）
第一天：
第二天
1、准备病毒液（可在第一天做）：在冰上融解
2、准备完全培养基和Polybrene 混合物（1:1000-1:2000稀释，终浓度在5-10μg/ml之间），加入相应培养板中（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl）
3、加入浓缩病毒液（12孔板30μl-50μl）（如果是直接购买病毒液需根据MOI确定病毒液量加入病毒液，自己包的病毒可以）
4、培养过夜，对polybrene毒性敏感的细胞在4-6小时候换液
第三天
1、对细胞进行换液
第五天
1、用药物进行稳定株的筛选（具体筛选药物根据载体的基因定，用氨苄青霉素0.5μg/ml-10μg/ml）
2、需设置空白对照（未处理细胞加入相同浓度氨苄青霉素，党对照全部死光为筛选周期）第六天之后（根据筛选周期）
1、换液传代
2、观察GFP报告基因确定转染效率，或用qRT-PCR确定转染效率
三、注意事项及知识点
1、名词解释
（1）病毒感染复数（multiplicity of infection MOI）：含义是感染时病毒与细胞数量的比值，即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染
2、慢病毒摸索时加入梯度（具体见自己的说明书）
3、慢病毒的储存与稀释:
可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）
A．病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度
B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中按照每次的使用量进行分装。
4、慢病毒载体示意图
《1》载体质粒（PLKO.1 抑制载体，PCDH-GFP+puro过表达载体）：
（1）5’LTR：long terminal repeat即长末端重复序列，不编码蛋白质，但含有启动子，增强
子等调控元件
（2）包组信号ψ：LTR-ψ通过包装细胞的RNA聚合酶转录为RNA，通过ψ信号起始包装（3）启动子、酶切位点和抗性基因（amp氨苄青霉素puro嘌呤霉素）
（4）stuffer：目的基因插入位点（慢病毒载体可插入5kbp左右）
（5）GFP：green fluorescent protein绿色荧光蛋白
（6）WPRE：Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) Posttranscriptional Regulatory Element 肝炎病毒转录后调控元件。
转录后可形成三级结构，促进基因的表达
（7）cPPT/CTS:逆转录病毒顺式作用区域,其中该cPPT和CTS区域诱导三链ＤＮＡ结构
（更新于2018.11）
《2》包装质粒
（1）gag基因编码病毒的核心蛋白基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白等（2）pol基因编码病毒复制所需的酶类，如反转录酶、整合酶、蛋白酶（3）pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶
（4）多种酶切位点和巨细胞病毒启动子
《3》包膜载体
（1）VSV-G：水疱性口炎病毒糖蛋白G基因，用于代替env基因。