质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳

一、前言

质粒

质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。

天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷

贝，一般在20个以上，如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:⑴分子量小、多拷贝、松弛控制型;⑵具有多种常用的限制性内切酶的单切点;⑶能插入较大的外源DNA片段;⑷具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常用的

质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM 系列和pBluescript(简称pBS)等。

质粒的不兼容性

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性。

琼脂糖凝胶

从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有"分子筛"和"电泳"的双

重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太小，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度~为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA 片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

二、实验目的

1.学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA

2.学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作。

三、实验原理

1.质粒DNA的小量提取

碱裂解法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的变性与复性的差异达到分离的目的。

在强碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，彼此互相盘绕，仍会紧密地结合在一起。当将pH调到中性并有高浓度盐存在时，变性质粒DNA又回复到原来的结构保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，相互缠绕形成不溶性网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子DNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。提取的质粒DNA再用酚、氯仿抽提进一步纯化。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是最常用的鉴定DNA的方法，它简便易行，只需少量DNA。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。DNA分

观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料溴乙锭（EB）染色，EB在紫外灯照射下，发红色荧光，本实验使用Goldview。