β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶的研究

1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。

β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。

1 β-葡萄糖苷酶的分类

β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。

2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法

2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法

不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。

2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法

粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-

葡萄糖苷酶的进一步纯化，往往是根据具体情况，采用多种方法逐步分离。目前分离β-葡萄糖苷酶的方法较多，其中离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析两种手段结合使用最为普遍，多数是先离子交换柱层析，后用凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析方法中常用的是阴离子交换层析，如DEAE阴离子交换层析；同时，阳离子交换层析法也有一定的使用。除上述两种分离方法外，也有其它层析方法用于分离β-葡萄糖苷酶，如使用疏水层析法和羟基磷灰石层析法等。此外，也有人采用双水相萃取和亲和层析的方法来分离β-葡萄糖苷酶，但关于这方面的研究报道较少。

2.3 β-葡萄糖苷酶活性测定方法

β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性。由于测定葡萄糖含量的方法很多，也有人通过测定葡萄糖含量来确定酶活力。孙迎庆等用多种方法测β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定β-葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在515 nm下比色测定β-葡萄糖苷酶活性。

3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质

不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等电点、最适反应pH值、pH 值稳定性范围、最适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别（见表1）。

3.1 β-葡萄糖苷酶的分子量大小

β-葡萄糖苷酶由于其来源不同，它们的相对分子量也可能不同，而且它们的结构和组成也有很大差异。β-葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在40～250 kDa之间，而其结构可能是由单亚基、双亚基或多亚基构成。此外，有的菌株本身含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶，因此，有时来源于同一菌株的β-葡萄糖苷酶是两种不同分子量酶的混和物，甚至是多种不同分子量酶的混合物。

3.2 β-葡萄糖苷酶最适pH值及pI值

目前很多的研究结果表明，β-葡萄糖苷酶为酸性蛋白酶，其最适反应pH值一般在3.0～7.0范围内，其中许多酵母、细菌的胞内β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值接近6.0左右；一般β-

葡萄糖苷酶的pH值稳定性范围较广，在pH值3.0～10.0范围内，糖苷酶的稳定性较好。对大部分β-葡萄糖苷酶而言，它们的pI值都在酸性范围，并且变化不大，一般在3.5～5.5之间。如来源蜜蜂的β-葡萄糖苷酶，其pI值接近4.5～4.8。

3.3 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和热稳定性

β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为40～110 ℃。一般来说，来自古细菌的β-葡萄糖苷酶其热稳定性和最适反应温度要高于普通微生物或动物来源的β-葡萄糖苷酶。

3.4 β-葡萄糖苷酶底物特异性

大多数的β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差，能裂解C-O糖苷键、C-S键、C-N键、C-F键等；β-葡萄糖苷酶对底物糖基部分的C4和C2构形也不专一，能同时水解β-葡萄糖苷键和β-半乳糖苷键，有些甚至C6位的专一性也不高，能水解木糖。在很多底物中，β-葡萄糖苷酶对纤维二糖和人工合成的底物对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG) 表现出较高的酶活性。此外，也有一些β-葡萄糖苷酶对底物表现出很强的专一性。Franck E. Dayan等(2003)从Podophyllum peltatum的叶子中提取的β-葡萄糖苷酶对足叶草毒素-β-D-葡萄糖苷（podophyllotoxin-4-O-β-D-glucopyranoside）有很高的专一性，对烃基-β-葡萄糖苷（如寡糖、纤维二糖、纤维三糖等）的水解作用较小，对芳香基-β-葡萄糖苷根本没有水解作用。

3.5 金属离子及化合物对β-葡萄糖苷酶的影响

许多β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究都表明，葡萄糖是β-葡萄糖苷酶的典型抑制剂。Hg2+、Cu2+和Ag+对大部分酶抑制作用较明显，SDS(十二烷基磺酸钠)及脲对酶也有不同程度的抑制作用。但Mn2+ 和Co2+对该酶有明显的激活作用。

4 β-葡萄糖苷酶的结构及催化机理

4.1 β-葡萄糖苷酶的结构

按糖苷酶的氨基酸序列分，大多数β-葡萄糖苷酶属于糖苷酶族1，糖苷酶族1有明显的桶状结构。但是，也有一些β-葡萄糖苷酶属于糖苷酶族4，属于糖苷酶族4的β-葡萄糖苷酶往往要求在催化过程中有脱氢酶和辅助因子参与，有文献报道，6-磷酸-β-D-葡萄糖苷酶在催化过程中需要Mn2+和辅酶NAD+的参与。

4.2 β-葡萄糖苷酶的活性中心结构

有研究表明，β-葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是两个谷氨酸残基。采用定点突变的方法证