造血干细胞分离培养方法

一造血干细胞分离

（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备

1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法

抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。

2 percoll液密度梯度离心法

①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。

②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。

3 Ficoll分离法

方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。

方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。

取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。

（二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。

去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。

（三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化

流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。

磁性标记CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂, 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞, 于4℃冰箱中充分混合孵育30 min。用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。

MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS缓冲液漂洗。以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块, 细胞通过分离柱, 以500μL PBS 缓冲液冲洗3次。将分离柱从分离器中移出并放置在合适的试管中, 于分离柱顶端滴注P BS 缓冲液 1 m L, 用分离柱配备的活塞加压将保留的细胞冲出。重复磁性分离步骤，将洗脱的细胞移至一个新的漂洗过的MS分离柱洗涤，用500μL PBS 缓冲液洗脱保留的细胞。

二造血干细胞培养

1 粒-巨噬细胞集落生成单位(GFU-GM)培养（CD34+细胞的培养）

采用甲基纤维半固体培养基体系进行集落培养。培养体系中含有50μg / L重组干细胞生长因子( rhSCF)、10μg / Lrh GM-CSF、10μg / L重组白细胞介素( rhIL) -3。在1 mL培养体系中加入1×105个有细胞。5 %CO2 , 37℃条件下培养14 d , 倒置显微镜下计数CFU-GM 集落数。

2 MNCs与HSCs的体外培养

（1）MNCs体外培养：用含10 %小牛血清的高糖DMEM培养基培养, MNCs以5×104个/ mL接种于24孔板中，每孔1 mL；(2)HSCs体外培养：用无血清高糖DMEM培养基，HSCs 以1×104个/ mL 接种于24孔板中。细胞均置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

3 由MNC制备基质细胞层

取新鲜分离的单个核细胞1×106培养于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培养板中,于5%CO2,37℃饱和湿度的CO2孵育箱中,每7天半量换液1次,3周后培养孔底

铺满了基质细胞,去除悬浮细胞,用PBS洗2遍后,用含有EDTA的胰蛋白酶消化,1500RD

照射后将1x104/ml基质细胞移种于24孔板中,每孔1ml,继续培养2天备用。

4 由CD34+细胞制备基质细胞层

取新鲜分离的脐血CD34+细胞1x105培养于1ml无血清培养液(SCGM)中，加入细胞因子

FL+TPo+GM-IL-1+IL-6，细胞因子浓度为FL50ng/ml，TPO50ng/ml，GM一CSF、IL-1

和IL-6分别为10ng/ml，置于24孔培养板中，于5%CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中, 每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，去除悬浮细胞，用PBS洗2遍后, 用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500拉德照射后将1xl了/ml基质细胞移种于24孔板中，每孔1ml，继续培养2天备用。