第10章_酶促反应动力学
酶促反应动力学(有方程推导过程)
酶促反应动力学(kinetics of enzyme- catalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶促反应的影响因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。
01
酶促反应动力学
02
3.4 酶促反应动力学
酶浓度的影响
在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大于100 Km时，速度与酶的浓度呈正比。 酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，[ES]也增加，而V=k3[ES]，故反应速度增加。
，所以
(2)
将（2）代入（1）得：
(3)
当[Et]=[ES]时，
(4)
所以
将（4）代入（3），则：
01
Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底
02
物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓
03
度时相应的反应速度。从米氏方程可知：
04
当底物浓度很低时
05
<< Km,则 V≌Vmax[S]/Km ，反应速度
〔E〕〔S〕
〔ES〕
〔E〕〔I〕
〔EI〕
ki
解方程①②③得： 〔ES〕=
〔E〕t
（1 + ）＋1
Km
〔S〕
〔I〕
Ki
又因vi＝k3〔ES〕,代入上式得： Vi＝
（1 + ）＋〔S〕
Km
〔I〕
Ki
Vmax〔S〕
〔I〕
Ki
很多药物都是酶的竞争性抑制剂。例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。
第10章酶促反应动力学
反应初速度随底物浓度变化曲线
V Vmax
[S] 当底物浓度较低时
反应速度与底物浓度成正比；反 应为一级反应。
V Vmax
[S]
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应
为混合级反应。
V Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；
反应为零级反应
（一）中间络合物学说
• 单分子反应
v = kc
• 双分子反应
v = kc1c2 c 、c1、c2 ：反应物浓度（mol/l）
k：比例常数/反应速率常数
2.反应级数
能以v = kc表示，为一级反应； 能以v = kc1c2表示，则为二级反应； v 与反应物浓度无关，则为零级反应。
双分子反应、一级反应
蔗糖的稀水溶液中，水的 浓度比蔗糖浓度大得多， 水浓度的减少与蔗糖比较， 可以忽略不计，故可将水 的浓度可以作为常数。因 此反应速度只决定于蔗糖 的浓度。
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
具体推导过程
稳态：指反应进行一段时间后，系统的 复合物ＥＳ浓度，由零逐渐增加到一定数值， 在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度不断 地变化，复合物ＥＳ也在不断地生成和分解， 但当反应系统中ＥＳ的生成速率和ＥＳ的分解 速率相等时，络合物ＥＳ浓度保持不变的这种 反应状态就称为稳态。
➢ 反应速度取其初速度，即底物的消耗量很 小（一般在5﹪以内）时的反应速度；
➢ 底物浓度远远大于酶浓度。（[S] 》[E]）
酶工程 第十章 酶的催化特性与反应动力学 2013-2
½Vmax 分数级反应 一级反应 [S]<<K
零级反应 [S]>>K
K
[S]
当v = ½Vmax时，K=[S]，即米氏常数，记做Km
35/138
3. 稳态学说
中间复合物假说
假定[ES]处于稳态中，即形成速率等于分解速率： k1[E][S]=k-1[ES]+k2[ES] k1[E][S] [ES]= k-1+k2 酶以ES形式存在的比例: [S] k-1+k2 +[S] k1
41/138
（4）直接线性作图法：
Vmax
Vmax (Vmax, Km)
v1
v2 [S]2 -[S]1 -[S]3
Km
42/138
（5）常用动力学数据处理方法的比较 Lineweaver-Burk法最常用，优点是v和[S]在不同轴上 ，但误差分布不均衡 直接线性作图法优点是v 和[S]直接表现在图线上，具有 统计合理性，可采用Vmax和Km的中位数。采用非线性回 归进行拟合，可得到最优Vmax和Km的值。
15/138
4. 酶专一性的确定
（1）选择底物，测定最适温度、pH等条件 （2）确定米氏常数Km和最大反应速度Vmax （3）选用结构类似物确定专一性 （4）相对专一性的酶确定几个底物的Km、Vmax （5）确定是否有立体异构专一性
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（二）酶催化作用的效率高
转换数（每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数）一般 103 min-1，β-半乳糖苷酶的转换数为12.5×103min-1， 碳酸酐酶的转换数达到3.6×107min-1 。 酶的催化作用可使反应速度提高107～1013倍 例如：H2O2的分解反应
H2O2 → H2O +
10章酶反应动力学-教学用
将实验测定的米-曼氏曲线的坐 标作平移，并用新坐标系 (x，y) 表示旧坐标系(v0，[S])，米-曼 氏方程可以转变为 xy = -Km 其 曲线为以坐标轴(x，y)为渐近线 的直角或等轴或等边双曲线
Vmax 2
从米-曼氏方程或其曲线可以看出三种情况：
当[ S ] [ K m ]，v0 Vmax[ S ] Km
基于快速平衡模型或平衡稳态模型的米氏方程: 早年的米式方程 最初，Michaelis 和 Menten 根据“快速平衡假说”推出米式方程。 快速平衡假说：一些假设
k1 E S ES k-1
反应可逆，且很快达到平衡 限速步骤，K2 << K-1 P的生成不足以破坏快速平衡
k2 ES PE
5为初始底物浓度s的函数所做的底物饱和曲线也称米曼氏作图或米曼氏曲线将实验测定的米曼氏曲线的坐标作平移并用新坐标系xy表示旧坐标系v0s米曼氏方程可以转变为xykm其曲线为以坐标轴xy为渐近线的直角或等轴或等边双曲线从米曼氏方程或其曲线可以看出三种情况
第 10 章
教学内容
酶促反应动力学
酶促反应动力学： 研究酶促反应的速度及其影响因素的科学。为酶的机理研究提供实验 证据，指导酶在生产中的应用。
2. Kcat 的意义: 催化常数或转换数
3. Kact/KM 的意义: 催化效率指数或专一性常数
1. KM的意义: 真实解离常数和表观解离常数
① 米氏常数KM是 v0=1/2 Vmax时的底物浓度。遵循米-曼氏动力 学的酶,也称为米-曼型酶, 是指呈现v0对[S]的双曲线关系的酶。 ② KM的真实意义决定于酶促反应机制的特定方面, 如反应步骤 数目和各步的速率常数。对于简单的二步反应： KM=(K-1+K2)/K1 当K2是限速步骤的速率常数时，即k2<<k-1 ，KM即Ks。 此时， KM 的意义是真实解离常数，代表ES复合体中酶对 底物的亲和力大小， 但是这种意义对大多数酶是不适用的。 当 k2、k-1 相当时，KM是三个速率常数的函数。
第十章酶动力学
（二）可逆抑制作用： • 抑制剂以非共价键与酶分子可逆性 结合造成酶活性的抑制，且可采用 透析等简单方法去除抑制剂而使酶 活性完全恢复的抑制作用就是可逆 抑制作用。 • 可逆抑制作用包括竞争性、反竞争 性、和非竞争性抑制几种类型。
抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大 小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。
四、pH对反应速度的影响
观察pH对酶促反应速度的影响，
通常为一“钟形”曲线，即pH过高 或过低均可导致酶催化活性的下降。 酶催化活性最高时溶液的pH值就 称为酶的最适pH。
pH对酶促反应速度的影响
木瓜蛋白酶
乙酰 胆碱 酯酶
人体内大多数酶的最适pH在6.5～ 8.0之间。 酶的最适pH不是酶的特征性常数。
与 图 形 特 征
反 竞 争 性 抑 制 的 速 度 方 程
反竞争性抑制的双倒数图形特征
• • • • •
反竞争性抑制的特点： ⑴ 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的 ⑵ 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； ⑶ 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制 ⑷ 动力学参数：Km减小，Vm降低。
1. 反应体系中不加I。 2.反应体系中加入 一定量的不可逆抑 制剂。
v
1
2
3
3.反应体系中加入一定 量的可逆抑制剂。
4、可逆抑制强度与时间 无关，而不可逆抑制强 度与时间有关
[E]
v
[I ]→
v
[I ]
[E]
不可逆抑制剂的 作用 可逆抑制剂的作用
[E]
• 1.竞争性抑制（competitive inhibition)： • 抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结 合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的 催化活性降低，称为竞争性抑制作用。
酶促反应的动力学及其影响因素
种因素。
在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量＜5%时的反应速度。
影响酶促反应速度的因素包括：1. 酶浓度：在其他因素不变的情况下，底物浓度的变化对反应速率影响的作图时呈矩形双曲线。
底物足够时，酶浓度对反应速率的影响呈直线关系。
2. 底物浓度：在其他因素不变的情况下，随着底物浓度的增加，反应速率也会相应增加。
3. pH值：pH值通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率。
4. 温度：温度对反应速率的影响具有双重性。
在适宜的温度范围内，随着温度的升高，反应速率加快。
但当温度过高时，酶的活性会受到抑制，反应速率反而下降。
5. 抑制剂和激活剂：抑制剂可逆或不可逆的降低酶促反应速率，而激活剂可加快酶促反应速率。
在实际生产中要充分发挥酶的催化作用，以较低的成本生产出较高质量的产品，就必须准确把握酶促反应的条件。
酶促反应的动力学研究与探讨的是酶促反应的速率及影响酶促反应速率的各种因素。
其中，主要的因素包括酶浓度、底物浓度、pH值、温度、激活剂和抑制剂等。
1. 酶浓度：在其他因素不变的情况下，底物浓度的变化对反应速率的影响呈矩形双曲线。
当底物浓度足够时，酶浓度对反应速率的影响则呈直线关系。
2. 底物浓度：在酶浓度不变的情况下，底物浓度的增加会促进反应速度的增加，但当底物浓度达到一定值后，再增加底物浓度对反应速度的影响不大。
3. pH值：pH值通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率。
4. 温度：温度对酶促反应速率的影响具有双重性。
在低温条件下，由于分子运动速度较慢，反应速度比较慢；随着温度的升高，分子运动速度加快，反应速度也会加快；但当温度升高到一定值后，过高的温度会使酶变性，反应速度反而下降。
5. 激活剂和抑制剂：激活剂可以加快酶促反应速度，而抑制剂可以降低酶促反应速度。
在实际生产中要充分发挥酶的催化作用，以较低的成本生产出较高质量的产品，就必须准确把握酶促反应的条件。
《生物化学》酶促反应动力学
k4
[ES]
(3)推导过程-1 由中间产物学说可知，酶促反应分两步进行
在稳态下,ES的生成速率与分解速率相等,达到动态平衡即:
VES生成 = VES分解
k1([E]- [ES]) [S]=(k2+ k3) [ES] 令Km = (k2+ k3)/ k1,则
([E]- [ES]) [S]/ [ES]= (k2+ k3)/ k1= Km
第二单元 酶化学
第8章 酶通论 第9章 酶促反应动力学 第10章 酶的作用机制和酶的调节
第9章 酶促反应动力学
一、化学动力学基础(P351) 二、底物浓度对酶反应速率的影响(P355) 三、酶的抑制作用(P368) 四、温度对酶反应的影响(P378) 五、pH对酶反应的影响(P379) 六、激活剂对酶反应的影响(P380)
1、不可逆的抑制作用
抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失， 不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称 为不可逆抑制（irreversible inhibition）。
2、可逆抑制作用
抑制剂与酶的必需基团以非共价键结合而引起酶活力丧 失，能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活， 称为可逆抑制（reversible inhibition）
4、抑制百分数：
i%= （1- a） × 100% = （1-vi/ v0）× 100%
（二）抑制作用的类型
抑制剂： 凡使酶的必需基团或酶的活性部位中的基团的化学
性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质， 称为抑制剂，用I表示，其作用称为抑制作用。
抑制作用一般分为: 不可逆抑制作用和可逆抑制作用两类。
的速率方程称为本征动力学方程，有具体的物理
酶促反应动力学分析
酶促反应动力学分析酶促反应是生物体内化学反应的重要形式之一，对于维持生命活动的正常进行起着至关重要的作用。
酶促反应动力学则是研究酶催化反应的速度以及影响反应速度的各种因素，通过对这些因素的分析，可以深入了解酶的作用机制、优化反应条件以及为相关的生物化学和生物技术应用提供理论基础。
酶促反应的速度通常用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。
在一定条件下，酶促反应速度与酶浓度、底物浓度、温度、pH 值、抑制剂和激活剂等因素密切相关。
首先来谈谈酶浓度对酶促反应速度的影响。
在底物浓度足够大的情况下，酶促反应速度与酶浓度成正比。
这是因为酶的浓度越高，能够与底物结合并催化反应的酶分子数量就越多，从而导致反应速度加快。
打个比方，就好像有更多的工人参与到一项工作中，工作完成的速度自然就会更快。
底物浓度对酶促反应速度的影响则较为复杂。
在反应刚开始时，反应速度随底物浓度的增加而急剧上升，此时反应速度与底物浓度成正比，这被称为一级反应。
然而，当底物浓度增加到一定程度时，反应速度不再随底物浓度的增加而增加，而是趋于一个恒定值，此时反应速度与底物浓度无关，被称为零级反应。
这种现象可以用酶与底物结合的中间复合物理论来解释。
简单来说，酶的活性中心数量是有限的，当所有的活性中心都被底物占据时，即使再增加底物浓度，反应速度也不会再提高。
温度对酶促反应速度的影响具有双重性。
一方面，在一定范围内，温度升高可以加快分子的运动速度，增加酶与底物的碰撞机会，从而提高反应速度。
另一方面，温度过高会导致酶的变性失活，使反应速度急剧下降。
每种酶都有其最适温度，在这个温度下，酶的催化活性最高。
就像人在适宜的环境温度下工作效率最高一样，酶在最适温度下也能发挥出最佳的催化效果。
pH 值对酶促反应速度的影响也不可忽视。
大多数酶的活性都有一个最适 pH 值范围，在这个范围内，酶的活性最高。
pH 值的改变会影响酶分子中某些基团的解离状态，从而改变酶的活性中心结构，影响酶与底物的结合以及催化反应的进行。
第10章 酶动力学
+抑制剂
1/v
(1+ KI/[I])/Vmax Vmax/(1+KI/[I])
斜率=Km/vmax
斜率= Km/vmax
[S]
Km/(1+ KI/[I]) Km
-1/Km - (1+ KI/[I])/Km
1/vmax
1/[S]
无I 有I
与 图 形 特 征
反 竞 争 性 抑 制 的 速 度 方 程
反竞争性抑制的特点： ⑴ 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与 底物的分子结构类似； ⑵ 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位 结合； ⑶ 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产 生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增 加而增加； ⑷ 动力学参数：Km减小，Vm降低。
非 竟 争 性 抑 制
（3）反竞争性（Uncompetitive ）抑制
反竞争性抑制剂
ES
k1 k-1
ES
I
KI’
k2
EP
v max [S ] Km K (1 I ) [S ] K [I ] (1 I ) [I ]
Km 降低 vmax 降低 斜率不变
v
vmax
v
EIS
I
E S
KI
k1 K-1
ES
v max [ S ]
k2
EP
v
EI
v
vmax
Km(1+[I]/KI)
[ S ] K m (1
[I ] ) KI
Km 升高 vmax 不变
+抑制剂
1/v
斜率=Km/vmax
斜率= Km(1+[I]/KI)/vmax
Km
[S]
第10章_酶动力学
2.5 12.0 32.0
22
②可以判断酶的专一性和天然底物
已知，Km=(K2+K3)/K1 当：k3<<k2 (k3为限速步骤的速率常数） Km≈K2/K1 即，Km相当于ES分解为E+S的解离常数（Ks)， Km代表酶对底物的亲和力。
Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大，酶的催化活性高。
酶的转换数（k3）
定义 ：当酶被底物充分饱和时，单位时间内 每个酶分子催化底物转变为产物的分 子数。 意义 ：可用来比较每单位酶的催化能力。
30
3、 Km与V的求取
31
Ｋm值与Ｖmax值可以通过作图法求取
（1）双倒数作图法（double reciprocal plot）， 又称为 林-贝氏（Lineweaver- Burk）作图法 Vmax[S] Km+[S] 两边同取倒数 Km 1/V= 1/[S] + 1/Vmax Vmax （林－贝氏方程）
51
（1） 非专一性不可逆抑制剂
①重金属离子 Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高浓度时可使酶蛋白变性失活； 低浓度时对酶活性产生抑制。
——通过加入EDTA解除
52
②烷化剂（多为卤素化合物）
E+S
两个假设：
•
k1
k2
ES
k3
E+P
E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而 ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速率取决 于慢反应即 V = k3[ES]。 (1)
•
S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的 初始阶段，S的浓度可认为不变即[S] =[St]。
10 酶促反应动力学-王镜岩生物化学(全)
½ Vmax
Vmax
[S]
Km
(2) 双倒数作图法 •将米氏方程式两侧取双倒数，以1/v-1/[s]作图，得出一直线.
1 V = Km Km+[S] Vmax[S] 1 V
竞 争 性 非 竞 争 性 抑 制 作 用 机 理 示 意 图
底物与酶专一性结合
竞争性抑制作用
非竞争性抑制作用
2、可逆抑制作用的动力学（重点）
（1）竞争性抑制的动力学特征
Vmax不变，Km增大Fra bibliotek竞争性抑制（competitive inhibition）
抑制剂化学结构与底物相似，因而与底物竞争 性地与酶活性中心结合
2. 激活剂对酶作用的特点
• （1）激活剂对酶的作用具有一定的选择 性 ；即一种激活剂对某种酶起激活作用， 而对另一种酶可能起抑制作用 • （2）有时金属离子之间也可相互替代 • （3）激活离子对于同一种酶，可因浓度 不同而起不同的作用，低浓度激活，高 浓度抑制
六、抑制剂对酶促反应速度 的影响（重点）
酶的活力单位
国际单位（IU）：在标准条件下，
一分钟内催化1umol底物转化的酶 量为一个酶活力单位 Kat单位：在一定条件下，每 秒钟转化1mol底物所需的酶量
酶的比活力 酶的转换数
（Kcat）
每毫克蛋白所含酶的活力单位数
（常常作为酶制剂纯度的指标）
每秒钟、每个酶分子转换底物的 umol数
影响酶反应速度的因素
竞争性抑制
可逆抑制作用
非竞争性抑制
反竞争性抑制
酶促反应动力学
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18
五、Km和Vmax值的测定
(3) Hanes— Woolf作图法 将前式两边均 乘以[S]得：以 [s]/ v～[s]作图， 得一直线，横 轴的截距为 -Km，斜率为 1/ Vmax
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19
第二节 酶的抑制作用
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20
抑制与失活之间的关系
失活作用(inactivation) :使酶蛋白变性 而引起酶活力丧失的作用 ,变性剂对酶 的变性作用无选择性.
(3)反竞争性抑制:酶只有与底物结合后， 才能与抑制剂结合，即ES+I-ESI,不能分 解为产物。
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26
三、可逆抑制作用动力学
1．竞争性抑制 底物或抑制剂与酶的结合都是可逆的，存在着 下面平衡式：
Ki：为抑制剂常数 Ki= Ki2 / Ki1
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27
1．竞争性抑制曲线图
（1）V下降，发生抑制
底物浓度对酶反应 速率的影响
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3
底
物
浓
度
对
速
率
影 当底物浓度较低时，表现为一级反应（其反应速 响 率与浓度的关系能以单分子反应的动力学方程式 的 表示：v=dc/dt=kc （线性关系）
曲 随着底物浓度的增加，反应表现为混合级反应。
线 当底物浓度达到相当高时，表现为零级反应（与
图 底物浓度无关）。
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14
四、Vmax的意义
在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax 也是一个常数。 pH、温度和离子强度等 因素也影响Vmax的数值， 同一种酶对不同底物的Vmax也不同。
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15
转换数的定义
当底物浓度很高时，Vmax = k3[ES] = k3[E]，k3表示当酶被底物饱和时，每秒 钟每个酶分子转换底物的分子数，这个 常数又叫做转换数(简称TN)，又称为催 化常数(catalytic constant，kcat)。 kcat值越大，表示酶的催化效率越高。
酶催化反应动力学
酶催化反应动力学酶是生物体内一类非常重要的催化剂，可以加速化学反应的速率，而不影响反应的化学平衡。
酶催化反应动力学，即研究酶催化反应速率的变化规律以及影响反应速率的因素。
本文将重点介绍酶催化反应动力学的基本概念、实验方法和相关影响因素。
一、酶催化反应速率酶催化反应速率是反应物转化为产物的速度。
在酶催化下，反应速率明显增加，可以达到每秒数百倍甚至上千倍。
反应速率由酶的浓度、底物浓度、反应温度和pH值等因素决定。
酶催化反应速率通常遵循麦克斯韦-玛尔计算公式，即速率v等于最大反应速率vmax与反应物浓度[S]的比例关系：v = vmax[S] / (Km + [S])。
其中Km称为米氏常数，表示反应物浓度为一半时的速率。
当[S]远大于Km时，速率v ≈ vmax，此时反应速率近似与反应物浓度成正比；当[S]远小于Km时，速率v ≈vmax[S]/Km，此时反应速率与反应物浓度成线性关系。
二、酶催化反应的实验方法进行酶催化反应动力学研究，需要了解反应速率及其影响因素。
实验方法主要包括测定酶催化反应速率的变化和测定酶的两个重要参数：最大反应速率vmax和米氏常数Km。
1. 测定酶催化反应速率的变化测定酶催化反应速率的变化，可以通过观察底物消失或产物增加的速度来确定。
常用的方法包括光度法、荧光法、比色法等。
这些方法都是通过测量反应物和产物的光学性质的变化，建立光学性质与反应速率之间的关系，来间接确定反应速率。
2. 测定最大反应速率vmax测定最大反应速率vmax是了解酶催化能力的重要指标。
最常用的方法是通过实验测量不同底物浓度下的反应速率，并将速率与底物浓度作图。
根据麦克斯韦-玛尔计算公式，绘制速率-底物浓度曲线，可以确定最大反应速率vmax。
3. 测定米氏常数Km米氏常数Km是衡量底物与酶结合力的指标。
测定Km的常用方法是选择一种底物，通过实验测量不同底物浓度下的反应速率，并将速率与底物浓度作图。
绘制速率-底物浓度曲线，可以确定Km。
第10章 酶动力学
24
kcat值越大，表示酶的催化速率越高 kcat/Km常用来比较酶催化效率的参数
（四）米-曼氏方程的线性化作图求Km和Vmax
1. 双倒数(Lineweaver-Burk)作图
v0
Vmax[S ] Km [S]
1 Km 1 1 v0 Vmax [S ] Vmax
26
E+S
k 2
ES
k -1
E+P
Ks
Kcat
在低底物浓度时：反应速度与 底物浓度成正比，表现为一级 反应特征。
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速； 反应为混合级反应。
当底物浓度达到一定值
反应速度达到最大值（Vmax），
此时再增加底物浓度，反应速度不 再增加，表现为零级反应。
（二）米-曼氏方程所确定的图形是直 角双曲线
单分子反应 A P v k[ A]
一级反应
AB P 双分子反应 v k[ A][B] 二级反应
2A P v k[ A]2
7
二、底物浓度对酶促反应速率的影响 （一）米-曼氏方程
k1 E+S
k-1
ES k2
E+P
8
米-曼氏方程的推导
26
k1 E+S
ES k2
E+P
k-1
27
d[ES] dt
2.Eadie-Hofstee作图法
第十章 酶动力学
Enzyme kinetics
本章内容
1. 有关的化学动力学概论（了解） 2. 底物浓度对酶促反应速率的影响（重点） 3. 多底物的酶促反应（了解） 4. 影响酶促反应速率的其他因素（了解） 5. 酶的抑制作用（重点、难点）
酶促反应的动力学
酶促反应的动力学酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。
这些因素主要包括底物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂和抑制剂等。
在研究某一因素对酶促反应速度的影响时，应该维持反应中其它因素不变，而只改变要研究的因素。
一、酶与底物浓度在酶的浓度不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的作用呈现矩形双曲线(图4-2-1)。
图4-2-1 底物浓度对酶促反应速度的影响在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系；当底物浓度较高时，反应速度虽然随着底物浓度的升高而加快，但不再呈正比例加快；当底物浓度增高到一定程度时，如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，说明酶已被底物所饱和。
酶促反应速度与底物浓度之间的变化关系，反映了[ES]的形成与生成产物[P]的过程。
在[S]很低时，酶的活性中心没有全部与底物结合，增加[S]，[ES]的形成与[P]的生成均呈正比关系增加；当[S]增高至一定浓度时，酶全部形成了[ES]，此时再增加[S]也不会增加[ES]，反应速度趋于恒定。
（一）米氏方程为了解释底物浓度与酶促反应速度的关系，1913年Michaelis和Menten把图4-2-1归纳为酶促反应动力学最基本的数学表达式---米氏方程：V=Vmax[S]/（Km+[S]）Vmax为反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。
（二）米氏常数（Km）的意义：1．当反应速度为最大速度一半时，米氏方程可以变换如下：1/2Vmax=Vmax[S]/（Km+[S]）所以 Km=[S]。
因此，Km值等于酶促反应最大速度一半时的底物浓度。
2．Km值可判断酶与底物的亲和力（Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；反之亦然）。
3．Km值是酶的特征性常数，只与酶的结构、酶所催化的底物和酶促反应条件有关，与酶的浓度无关。
酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。
课件：酶促反应动力学
竞争性抑制作用的动力学
➢ 有竞争性抑制剂存在时，Km值增大 (1+[I]/Ki)倍，Km值随[I]的增高而增大；
➢ 在[E]固定时，当[S] ﹥﹥ Km (1+[I]/Ki), Km (1+[I]/Ki)项可忽略不计，则v= Vmax， 即最大反应速率不变。
竞争性抑制的动力学曲线
a=1+[I]/Ki
底物浓度对酶促反应速率的影响
• 反应速率对底物浓度作图，得到的是一个 双曲线
• 在低底物浓度时, 反应速率与底物浓度成正 比，表现为一级反应特征。
• 当底物浓度达到一定值，反应速率达到最 大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反 应速率不再增加，表现为零级反应
• 此现象称为饱和效应，对应的图称为底物 饱和曲线，说明酶促反应中酶的底物结合 部位都被底物占据时反应达到最大速率
• 抑制剂：引起抑制作用的化合物。抑制剂 能够与酶的必需基团以非共价或共价的方 式形成比较稳定的复合体或结合物。抑制 剂对酶的抑制具有选择性。
• 酶的抑制作用机理：
– 在化学结构上与被抑制的酶的底物分子（底物 类似物）或底物的过渡状态相似——活性中心 结合。
– 非底物类似物——不与活性部位结合，但和酶 活性部位以外的必需基团结合，从而影响酶促 反应过程。
酶促反应动力学
• △G为负，说明热力学有利，其值与反应的 平衡常数有关
• 活化能是动力学的范畴，和反应的速率常数
• 酶促反应动力学研究酶促反应速率以及影 响此速率的各种因素
• 酶促反应速率指反应的初速率，一般指底 物浓度被消耗5％以内的速率
• 影响因素：底物浓度、酶浓度、产物浓度、 pH、温度、抑制剂、激活剂等
米氏方程
Vmax [S] V=
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（3） kcat/km的意义：
Vmax[S] V=
Km + [S]
∵Vmax=kcat[Et] ∴
kcat[Et][S] V=
Km + [S]
当[S] <<Km时， [E]＝[Et]
是E和S反应形成产物的表观二级速率常数。 其大小可用于比较酶的催化效率。
kcat/km＝ k3k1
k2+k3
kcat/km的上限为k1,即生成ES的速率，即酶 的催化效率不超过E和S形成ES的结合速率
k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES]
(Ⅰ)
E的质量平衡方程
[E]=[Et] - [ES]
(Ⅱ)
k1
k3
E+S
ES
P+E
k2
稳态时ES浓度不变
反应速度
V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度
E的质量平衡方程 米氏方程
V[S] V=
Km + [S]
k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES]
酶促反应动力学
二、底物浓度对酶反应速率的影响
研究前提
➢ 单底物、单产物反应；
➢ 酶促反应速度一般在规定的反应条件下， 用单位时间内底物的消耗量和产物的生成 量来表示；
➢ 反应速度取其初速度，即底物的消耗量很 小（一般在5﹪以内）时的反应速度；
➢ 底物浓度远远大于酶浓度。（[S] 》[E]）
初速度
Km
[S]
＝ Vmax[S] Km + [S]
Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
①Km是酶的特性常数：
与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无 关，可以鉴定酶。
酶
底物
Km(mmol/L)
脲酶
尿素
25
溶菌酶
6-N-乙酰葡萄糖 胺
0.006
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
k1
k3
E+S
ES
P+E
k2
稳态时ES浓度不变
反应速度
(Ⅲ) V=k3[ES]
ES的生成速度=消耗速度
k1
k3
E+S
ES
P+E
k2
Km越小，亲和力越强。
[S]很小时，反应速度就能达到很大。
性能优，代谢中这类酶更为重要
③根据Km：
判断某[s]时v与Vmax的关系 判断抑制剂的类型
④ Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径 催化可逆反应的酶对正/逆两向底物Km不同 —— Km较小者为主要底物
一底物多酶反应
乳酸脱氢酶
（1.7×10-5）
乳酸
丙酮酸
丙酮酸脱羧酶
（1.0×10-3）
丙酮酸脱氢酶
（1.3×10-3）
乙醛 乙酰CoA
丙酮酸浓度较低时： 代谢哪条途径决定于Km最小的酶
（2）Vmax和k3（kcat)的意义
一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一 个常数。 [S]很大时， Vmax＝ k3[E] 。 k3表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子 转换底物的分子数， ——又称为转换数、催化常数kcat kcat越大，酶的催化效率越高
[E]=[Et] - [ES]
V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et]
k2 + k3 Km=
k1
米氏常数
V 反 应
V[S] V=
初
Km + [S]
速
度
0
底 物 浓 度 [S]
反应初速度随底物浓度变化曲线
最V
大
反V
应
b.当[S]很大时 V=V[S]/[S]=V
速
率
混合级
V/2 a.当[S]很小时
葡萄糖-6-磷酸 6-磷酸-葡萄糖 脱氢酶
0.058
苯甲酰酪氨酰胺
2.5
胰凝乳蛋白酶 甲酰酪氨酰胺
12.0
乙酰酪氨酰胺
32.0
②可以判断酶的专一性和天然底物
Km值最小的底物——最适底物/天然底物
Km近似表示酶对底物的亲和力： Km越大、亲和力越小
k2>>k3时
k2 + k3 Km=
k1
Km≈k2（分离能力）/k1（亲合能力）
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应
为混合级反应。
V Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；
反应为零级反应
（一）中间复合物学说
k1 k3 E + S ES P + E
k2 k4
三个假设：
（1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而 ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于 慢反应即 V＝k3[ES]。
2. 加入3U/ml已在35 ℃水浴保温的酶溶液，准确作用5 分钟，终止反应；
3. 各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5 分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值；
4. 作图
（2）Eadie-Hofstee作图法
v=Vmax-Km[Sv]
v
Vmax
斜率－Km
产 酶促反应速度逐渐降低
物
0
时间
酶促反应的时间进展曲线
❖ 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速 度的影响呈矩形双曲线关系。
V
反 应 初 速 度
0
底 物 浓 度 [S]
反应初速度随底物浓度变化曲线
V Vmax
[S] 当底物浓度较低时
反应速度与底物浓度成正比；反 应为一级反应。
V Vmax
[S]
V=V[S]/Km 一级反应
0 Km （米氏常数）
[S]
米氏曲线
0 级反应
Km=?
V[S] V=
Km + [S]
若 V＝V/2
•Km = [S]
V1 ＝ V [S] 2 Km + [S] Km + [S] = 2[S]
2、动力学参数的意义
（1）米氏常数Km的意义
V
Vmax Vmax/2
Vmax 2
（2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初 始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。
（3）P→0 忽略 E + P k4 ES 这步反应
E + S ES
E+P
（二）酶促反应的动力学方程式 1、米氏方程的推导
❖ 1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程 式，简称米氏方程(Michaelis equation)。
kcat/km的大小可以比较不同酶或同一种 酶催化不同底物的催化效率。
3、 Km与V的求取
（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法
蔗糖酶米氏常数（Km）的测定
1. 配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、 0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、 0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水 浴保温；