细胞培养基本技术全面知识普及演示文稿
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细胞培养的基本方法 PPT课件
吸去旧培养基， PBS清洗 加入胰酶消化 终止胰酶消化并 吹打
细胞冻存的注意事项：
（1）冻存液要最先配置。 原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。 原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。 （2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。 （3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。 （4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃，细胞冻 存盒应先放在4 ℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻 存盒，则采用程序降温法。（4℃冰箱40min， -20℃冰箱30-60min， 置于-80 ℃ 过夜，次日转入液氮。）
（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。
（6）培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。
原代组织块培养法
（1） 剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。 （2） 摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布20~30块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞， 置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少 许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞培养主要的设施器材
设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。 二、塑料器材 多孔培养板（ 6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。 2 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头
细胞冻存的注意事项：
（1）冻存液要最先配置。 原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。 原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。 （2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。 （3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。 （4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃，细胞冻 存盒应先放在4 ℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻 存盒，则采用程序降温法。（4℃冰箱40min， -20℃冰箱30-60min， 置于-80 ℃ 过夜，次日转入液氮。）
（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。
（6）培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。
原代组织块培养法
（1） 剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。 （2） 摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布20~30块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞， 置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少 许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞培养主要的设施器材
设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。 二、塑料器材 多孔培养板（ 6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。 2 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头
《细胞培养基本技术》课件
讨论细胞培养在科学研究和 医学应用中的作用。
细胞培养实验步骤
1
细胞培养器具消毒
2
介绍细胞培养器具的消毒方法。
3
细胞培养
4
将细胞放入培养基中并提供适当的生长条件。
5
细胞准备
从组织样本中提取和准备细胞。
培养基制备
制备适合细胞生长的培养基。
细胞观察与维护
观察细胞生长情况，并进行细胞培养的日常 维护。
细胞培养中常见问题及解决方法
细胞污染
讨论细胞培养中的常见污染源 以及如何预防和解决细胞污染 问题。
细胞死亡
探讨细胞死亡的原因以及如何 识别和解决细胞死亡问题。
细胞特性变异
说明细胞特性变异的原因和影 响，并提供相应的解决方法。
细胞培养的应用领域
医学研究
探讨如何利用细胞培养技术进行疾 病研究和药物筛选。
生物技术
介绍细胞培养在生物技术领域的应 用，如基因工程和重组蛋白制备。
《细胞培养基本技术》 PPT课件
这个PPT课件将会介绍细胞培养的基本技术。通过这个课件，您将了解细胞培 养的背景和目的，并掌握其基本原理和实验步骤。
细胞培养的 细胞培养的重要性
了解细胞所需的培养基成分 和培养条件。
探讨细胞分裂机制以及如何 促进细胞增殖。
组织工程学
讨论细胞培养在组织工程学中的重 要性和应用。
细胞培养中的道德和安全问题
1
动物实验伦理
探讨使用动物细胞进行实验的道德与伦理考
实验室安全
2
量。
介绍细胞培养实验中的安全操作方法和注意
事项。
3
数据和结果处理
讨论研究数据和结果处理的道德和科学性要 求。
总结及未来展望
细胞培养技术17577PPT课件
群体中多数细胞处于间期，少数处于分裂期。分 裂期较短。
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6
整个细胞周期可划分为G1 → S → G2 → M → G1，如下图所示：
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细胞生长曲线
体外培养的细胞生长达到一定密度后，都需传 代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细 胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、 细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增 加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞 系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多 时细胞增殖比少时快。细胞增殖一代，一般要经 过以下三个阶段：
凋亡发生的过程表现（细胞缩小→致密染色质 边集→核碎片→凋亡小体） 1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触 区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来 2、细胞缩小：①胞浆细胞器集中
②胞膜出芽或起泡 ③细胞皱缩；
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3、保持胞浆细胞器完整性
扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，① 线粒体不肿胀，内膜不破裂；②短暂滑面内质网 （SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；③有 时有聚积排例的半结晶状核糖体；④可有与细胞 表面平行的微丝束。
取材 无菌环境中，从机体取出某种组织（视实验目的
而定），经过一定的处理（如消毒、消化分散等） 后接入培养器血中，这一过程称为取材。取材后 应尽快培养，因故不能马上培养时，置4℃的培养 液中保存，但时间不能超过24h。取组织时应严 格保持无菌，同时也要避免接触其他有害物质。 取病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌， 为减少污染，可用500～1000单位/ml青、链霉素 的PBS液漂洗5～10min。 （无论是传代培养还是原代，对细胞进行操作切 记：细心，专心，动作要轻）
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整个细胞周期可划分为G1 → S → G2 → M → G1，如下图所示：
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细胞生长曲线
体外培养的细胞生长达到一定密度后，都需传 代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细 胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、 细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增 加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞 系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多 时细胞增殖比少时快。细胞增殖一代，一般要经 过以下三个阶段：
凋亡发生的过程表现（细胞缩小→致密染色质 边集→核碎片→凋亡小体） 1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触 区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来 2、细胞缩小：①胞浆细胞器集中
②胞膜出芽或起泡 ③细胞皱缩；
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3、保持胞浆细胞器完整性
扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，① 线粒体不肿胀，内膜不破裂；②短暂滑面内质网 （SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；③有 时有聚积排例的半结晶状核糖体；④可有与细胞 表面平行的微丝束。
取材 无菌环境中，从机体取出某种组织（视实验目的
而定），经过一定的处理（如消毒、消化分散等） 后接入培养器血中，这一过程称为取材。取材后 应尽快培养，因故不能马上培养时，置4℃的培养 液中保存，但时间不能超过24h。取组织时应严 格保持无菌，同时也要避免接触其他有害物质。 取病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌， 为减少污染，可用500～1000单位/ml青、链霉素 的PBS液漂洗5～10min。 （无论是传代培养还是原代，对细胞进行操作切 记：细心，专心，动作要轻）
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细胞培养技术文稿演示
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
聚光镜中央有挡光片，视野背 景是黑的，只允许被标本反射 和衍射的光线进入物镜，物体 边缘是亮的。
可观察 4~200nm的微粒子， 分辨率比普通显微镜高50倍。
（五）相差显微镜
把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各 种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上， 相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
（一）水
（二）平衡盐溶液
➢维持渗透压、调节PH值 ➢细胞生存能量、无机离子
（三）消化液
原代培养分散组织细胞
胰蛋白酶液：使细胞间蛋白质水解，
包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及 显微切割等。
细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将 不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon （1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年， Wilmut等克隆了绵羊Dolly。
镜口率可接近1.5； 普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约
为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微 镜的最大有效倍数为1000X。
（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope
特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。
用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光 观察、基因定位、疾病诊断。
（三）扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope，STM
原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个 纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压 （2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度 与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的 变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。
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细胞培养的应用
细胞培养的优点
1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构 、生命活动 2.可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段 可控制调节条件：物理、化学、生物等因素 可采用各种研究技术、记录方法： 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细 胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位 素标记等。
概念：原代与传代
原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分 开接种到新的培养器皿中。
培养细胞的生长方式
贴壁生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实
体组织来源细胞、上皮细胞。 悬浮生长：
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物 表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。
刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净，烘干。 泡酸、清洗：烘干后泡入酸液，12小时后从酸缸内捞出器
皿立即用自来水冲洗10次（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃 上难以清洗），过蒸馏水3次。 烘干、包装 高压灭菌 烘干备用
金属器皿
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂 刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒 精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗， 再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装 好，高压灭菌，再烘干备用。来自贴壁细胞贴壁细胞
贴壁细胞
贴壁细胞
悬浮细胞
细胞培养的环境
1、无污染环境：化学污染、微生物污染 2、温度环境：37℃。偏离这一温度范围，细胞的正
常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温 的耐受力较对高温强， 3、气体环境： 95%空气加5%二氧化碳 4、酸度环境：大多数细胞的适宜PH 为7.2-7.4，细 胞耐酸性比耐碱性大一些。 5、 细胞培养基：合成培养基、天然培养基。
液氮罐
培养瓶、培养皿
实验器材的清洗和灭菌
清洗的重要性
1. 除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等 2. 使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。
不要让污染了的器皿变干！！
灭菌的重要性
除去微生物污染
酸液配方
新的玻璃器皿的清洗灭菌
自来水刷洗，除去灰尘。 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12
细胞培养的应用
1. 药物研究与开发 (1) 新药筛选 (2) 疫苗研究与开发 (3) 基因工程药物研究与开发 (4) 细胞工程药物研究与开发 2. 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 3. 生物制药 (1) 疫苗生产 (2) 基因工程药物生产 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，
用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、
3. 样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。 4.经济、规模和机械化
细胞培养的局限性
人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工 所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相 同。缺乏体内的系统作用、失去神经体液 的调节和细胞相互间的影响。 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态 平衡的环境中，必然发生变化。
需配制的溶液
平衡盐溶液（PBS或D-Hank’s等） 胰酶 培养基
溶液除菌方式
高压蒸汽灭菌：平衡盐溶液
过滤除菌：不能高压的溶液，如培养基、 胰酶等
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基 和合成培养基。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。
成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需
要。
人工合成培养基只能维持细胞生存，
要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量 的天然培养基（如血清）。
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ； ③激素；
细胞培养基本技术 全面知识普及演示
文稿
内容
细胞培养的理论背景
设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策
细胞培养的概念
20世纪初才创立的一种研究动物细胞行为 的方法。
细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体 内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度 和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维 持其结构和功能的一种培养技术。
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
血清质量好坏是实验成败的关键。
常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
细胞培养成功的关键
1. 实验材料的清洗、灭菌。 2. 无菌操作 3. 勤劳
内容
细胞培养的理论背景
设备与器材准备、溶液配制
无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策
实验设备与器材
CO2培养箱 超净工作台
倒置显微镜
滤器
电动移液器
超纯水仪
橡胶和塑料
刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干。 泡入5％盐酸过夜。 自来水冲洗10次，过蒸馏水3次 烘干 高压蒸汽灭菌 烘干备用
滴管胶头可用75％酒精浸泡5分钟，紫外线照射消 毒。
水、溶液、培养基
水：超纯水。 至少为三蒸水或去离子水。
小时以除去脏物、铅、砷等物。 刷洗、烘干：泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗
涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用酸液浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿
用自来水冲洗10次，最后蒸馏水冲洗3-5次。 烘干、包装：移液管和滴管的尾端
要塞入棉花。 高压灭菌 烘干备用
使用后的玻璃器皿的清洗灭菌