细胞生物学实验讲义
细胞生物学实验讲稿 (16)
视频3.6 单个核细胞分离结果分析同学们好！我们在前面的视频中学习了“研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞”和“密度梯度离心法分离外周血单个核细胞”的原理、操作等内容，本视频我们一并对两个实验结果加以分析。
首先，让我们先复习一下单个核细胞的概念及组成。
单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。
其并非某种特定细胞类群。
因此，观察单个核细胞形态和计算纯度时要综合考虑这几种细胞。
1、密度梯度离心法正常分离效果：纯度， 80%左右；回收率，60%左右。
图1中细胞纯度接近80%，算比较好的分离结果。
图2中单个核细胞比率很低，混有大量红细胞和血小板。
2、脾脏单个核细胞理想分离效果：活细胞比率﹥90%，如图3。
图4则死细胞偏多。
3、外周血单个核细胞分离纯度低的原因：吸取单个核细胞层时操作不当。
（1）扰动了分层液，使沉于管底的红细胞上浮；（2）吸取上层含血小板液体太多。
4、外周血单个核细胞回收率低的原因（1）血液在普通玻璃或塑料容器中放置时间过长，部分细胞因贴壁而损失。
（2）吸取单个核细胞不完全。
（3）离心收集单个核细胞时速度偏低、时间偏短。
（4）用普通低速离心机离心时，部分细胞沉于管壁而非管底，吸弃上清和重悬时易损失。
5、脾脏单个核细胞活率低的原因（1）研磨力度过大。
（2）在同一位置反复研磨。
（3）没有及时用D-Hanks液将研磨游离的细胞冲入悬液。
6、改善外周血单个核细胞分离纯度的方法：吸取单个核细胞的吸管进入细胞悬液前先排出部分气体；缓慢进入单个核细胞层；小心吸取中间层细胞。
避免在液体中反复挤压吸管。
7、提高外周血单个核细胞回收率的措施（1）血液一经采集尽快分离。
（2）用聚丙烯离心管代替普通离心管盛装血液和分离细胞。
（3）有条件时使用水平离心机。
（4）淋巴细胞分离液密度较大，如吸入较多，应适当调大离心速度并延长离心时间。
8、改善脾脏单个核细胞活率的方法（1）组织块分割要小。
细胞生物学 国家精品课程 教案讲义
细胞生物学国家精品课程教案讲义第一章绪论教学目的：1.掌握本学科的研究对象及内容；2.了解本学科的来龙去脉（发展史及发展前景）；3.掌握与本学科有关的重大事件和名词。
教学重点：本学科的研究对象及内容。
教学方法：讲授法。
教学过程第一节细胞生物学研究内容与现状一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科（一）细胞学（Cytology）：是研究细胞的结构、功能和生活史的科学。
（二）细胞生物学（Cell Biology）：运用近代物理学和化学的技术成就以及分子生物学的概念与方法，从显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能及各种生命活动规律。
二、细胞生物学的主要研究内容1．细胞核、染色体及基因表达基因表达与调控是目前细胞生物学、遗传学和发育生物学在细胞和分子水平相结合的最活跃领域。
2．生物膜与细胞器的研究膜及细胞器的结构与功能问题（“膜学”）。
3．细胞骨架体系的研究胞质骨架、核骨架的装配调节问题和对细胞行使多种功能的重要性。
4．细胞增殖及调控控制生物生长和发育的机理是研究癌变发生和逆转的重要途径（“再教育细胞”）。
5．细胞分化及调控一个受精卵如何发育为完整个体的问题。
（细胞全能性）。
6．细胞衰老、凋亡及寿命问题。
7．细胞的起源与进化。
8．细胞工程改造利用细胞的技术。
生物技术是信息社会的四大技术之一，而细胞工程又是生物技术的一大领域。
目前已利用该技术取得了重大成就（培育新品种，单克隆抗体等），所谓21世纪是生物学时代，将主要体现在细胞工程方面。
三、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域1．染色体DNA与蛋白质相互作用关系；2．细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控；3．细胞信号转导的研究；4．细胞结构体系的装配。
第二节细胞生物学发展简史1．细胞学创立时期 19世纪以及更前的时期（1665—1875），是以形态描述为主的生物科学时期；2．细胞学经典时期 20世纪前半世纪（1875—1900），主要是实验细胞学时期；3．实验细胞学时期（1900—1953）；4．分子细胞学时期（1953至今）。
本科《细胞生物学实验》讲义
（3）载物台：戴物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。
（4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式 （可改变倾斜度）两种。
（5）滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等颜色。根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。
图1.普通光学显微镜
五、实验步骤及内容
1．低倍镜的操作
（1）置显微镜于固定的桌上。窗外不宜有障碍视线之物。
2．高倍镜的操作
（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移到视野正中处。
（2）旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。
3．油镜的操作
4．用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。
六、数据整理
七、实验过程中应注意事项及心得
1.取、送显微镜时要轻拿轻放，一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。不可把显微镜放在实验台的边缘，以免碰翻落地。取拿显微镜罩子的时候也一定轻取，以免将目镜从镜筒上带出摔坏。
2.显微镜的光学部分只能用特殊的擦镜纸擦拭，切忌乱用他物擦拭，更不能用手触摸透镜，以免汗液玷污透镜。
实验一、光学显微镜的基本使用方法
一、实验目的
1. 了解光学显微镜的结构、原理和保养方法；
细胞生物学实验讲稿 (7)
视频2.5 冰冻切片法制备小鼠脾脏组织细胞标本同学们好！冰冻切片法是利用冷冻切片机制备冰冻组织细胞标本的制片方法。
具有组织硬化快、制作省时、抗原保存效果好等优点，主要用于制备人与动物柔软组织的切片标本。
实验原理：利用物理降温法使柔软的组织材料硬化，然后利用切片机锋利的切面，将材料按照一定的厚度切成适合于显微观察的标本片。
冰冻切片机的组成主要有：1、操作室；2、冷冻台；3、标本台；标本头；4、防卷板；5、厚度调节旋钮；6、切片刀架；7、切片刀；8、操作室和冷冻头温度调节；9、手转轮；10、标本头冷冻回缩键。
操作流程：开机——设定冷冻温度——切片刀安装及调节——准备标本台——材料准备——材料包埋及冷冻——安装标本头——设定切片厚度——切片及观察使用操作：1.开机。
2.设定冷冻温度：开机后根据需要切片的材料特点，利用“+”和“-”键设定箱体和样品头的温度。
本次箱体温度设定为-20℃，标本头温度设定为-22℃。
3.切片刀安装及调节：将刀片固定锁钮向上扳动，取下旧刀片，将新刀片安装于刀座上；再将刀片固定锁钮向下扳动，锁紧刀片。
4.准备标本台：将干净的标本台插入座槽内，在其上均匀滴加适量的水或组织包埋剂，冰冻后形成小平台。
5.材料准备：用锋利刀片将新鲜小鼠脾脏切成一定大小的组织块。
6.材料包埋及冷冻：将准备好小鼠脾脏平铺在标本台的平台中央，然后，快速在样品上滴加OCT包埋剂，均匀地包埋住样品。
避免产生气泡。
继续在冷冻台上冷冻约30min。
7.安装标本头：将包埋有样品的包埋台安装到标本头上，旋紧锁钮。
8.设定切片厚度：设定切片厚度为40微米；接近待切组织后用手转轮微调。
9.切片及观察1）掀开防卷板，看清标本位置，用标本头“前进”和“回缩”键调节标本和刀片到合适距离。
2）转动手转轮，调整标本至待切平面。
3）将切片厚度调节到6微米，进行试切；用毛刷清扫切片垃圾；放下防卷板，开始切片；均匀旋转手转轮，每转动一周，切下一片；用手转轮固定锁将手转轮卡住。
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细胞生物学实验讲义细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。
2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。
二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。
利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。
这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。
三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。
2、材料：鸡血。
3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。
4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。
再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g 溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。
（2）2%甲基绿染液：称取 2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。
甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。
（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。
（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。
该液应现配现用，不宜久置。
四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。
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植物组织培养一、实验目的1、掌握植物细胞无菌培养技术。
2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。
二、实验原理植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。
它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。
植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。
组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。
三、实验用品1、材料半夏无菌苗。
2、仪器卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。
3、用具镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。
4、器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。
5、药品与试剂1).药品(见下表)2).70％酒精四、实验方法1、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。
母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。
(各类成分浓度、用量详见下表)。
表1 MS培养基母液配制(单位：mg)1).大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。
一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。
2).微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。
3).铁盐母液(100倍液)称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。
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细胞生物学实验一细胞分裂相的观察（综合性，3学时，生技、生工专业必修）一、实验目的1.掌握减数分裂标本的制备方法；2.掌握生殖细胞减数分裂发生过程及各个时期的染色体和细胞变化特点；3.了解植物生殖细胞的形成过程。
二、实验原理减数分裂是生殖细胞发生的一种特殊细胞分裂方式，特点是染色体复制一次，细胞分裂两次，形成4个子细胞，每个子细胞染色体数目减半。
经过受精作用后，染色体数目恢复，这样在物种延续过程中保证了遗传的相对稳定性和基因的多样性。
三、实验仪器、材料和试剂1.仪器、用具：眼科镊子、解剖针、刀片、吸水纸、显微镜、载玻片、盖玻片；2.材料：普通小麦(Triticum aestivum，2n=2x=42)或黑麦（Secale cereale，2n=2x=14）、大麦(Hordeum sativum，2n=2x=14)的幼穗（旗叶叶枕与幼穗顶部距离3～5cm，穗长约6～8cm）；或大葱（Allium fistolosum，2n=2x=16）花序（外包绿色总苞者，长2～3cm）；或玉米(Zea mays，2n=2x=20)幼穗（雄穗）。
3.试剂：苯酚品红、醋酸洋红。
注：以下染色剂的配制① 1％醋酸洋红（aceto carmine）：酸性染料，适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。
配方：洋红1g ； 45％醋酸100ml。
煮沸2h左右，并随时注意补充加入蒸馏水到原含量，然后冷却过滤，加入4％铁明矾溶液1～2滴（不能多加，否则会发生沉淀），放入棕色瓶中备用。
②改良苯芬品红染色液（Carbol fuchsine）核染色剂。
配制步骤：先配成三种原液，再配成染色液。
原液A：3g碱性品红溶于100ml 70％酒精中。
原液B：取原A液10ml加入到90ml 5％石炭酸水溶液中。
原液C：取原B液 55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林（38％的甲醛）。
（原液A和原液C可长期保存，原液B限两周内使用）染色液：取C液10～20ml，加45％冰醋酸80～90ml，再加山梨醇1～1.8g，配成10％～20％浓度的石炭酸品红液，放臵两周后使用，效果显著（若立即用，则着色能力差）。
《细胞生物学实验》课件
05
结论与讨论
实验结论
01 02
实验结论总结
通过本次实验，我们成功地观察到了细胞分裂的各个阶段，验证了细胞 周期的存在和细胞分裂的机制。实验结果与预期一致，进一步证实了细 胞生物学理论的正确性。
实验结果的意义
本实验结果对于深入理解细胞分裂和增殖的机制具有重要意义，为后续 的细胞生物学研究和应用提供了有力支持。
《细胞生物学实验》 ppt课件
目录
CONTENTS
• 实验概述 • 实验材料 • 实验操作 • 实验结果 • 结论与讨论
01
实验概述
实验目的
掌握细胞培养技术
通过本实验，学生将熟悉并掌握细胞培养的基本技术和方法，了 解细胞在体外生长和繁殖的条件和要求。
理解细胞形态与功能的关系
通过观察不同类型细胞的形态和生长特点，学生将进一步理解细胞 形态与其功能之间的关系。
培养实践操作能力
本实验将提供实际操作的机会，培养学生的实验技能和动手能力， 提高其解决实际问题的能力。
实验原理
细胞培养的生物学基础
细胞生长与增殖的过程
介绍细胞培养的基本概念、发展历程 和应用领域，为学生提供相关的生物 学基础知识。
解释细胞在体外生长和增殖的过程， 包括细胞周期、分裂方式、接触抑制 等基本概念。
03
实验结论的应用
实验结论可应用于教学、科研和实际生产中，有助于提高人们对细胞生
物学领域的认识和理解。
结果分析
数据分析方法
在实验过程中，我们采用了显微 观察、图像处理和统计分析等多 种方法，确保实验结果的准确性
和可靠性。
实验误差分析
在实验过程中，可能存在一些误 差，如观察角度、显微镜倍数等 因素可能影响实验结果。我们通 过多次重复实验和交叉验证等方
细胞生物学实验讲稿 (4)
视频2.2 涂片法制备血细胞标本片及瑞氏染色同学们好！涂片法是用一张载玻片将细胞悬液均匀地涂布在另一张载玻片上制备细胞标本片的方法。
广泛用于血细胞及其他各种悬浮细胞材料标本片的制备。
实验原理：一定浓度的细胞悬液，用一张载玻片涂布于另一张载玻片后，可在载玻片上形成密度适可的单层细胞标本。
实验材料及用品有：抗凝全血；普通光学显微镜；酒精棉球缸；载玻片；吸水纸；蜡笔；吸管；废液缸；瑞氏染液；pH6.4的PBS缓冲液。
实验操作环节有：清洁载玻片——加样——涂片——干片——镜检涂片效果——瑞氏染色——细胞显微观察。
操作细节：1、清洁载玻片：用酒精棉球反复擦拭清洁载玻片；用吸水纸吸干表面水分和酒精。
2、加样：将载玻片平放在实验台上，用吸管吸取血液后与载玻片长轴一端距离边缘约1cm处接触，挤出1小滴血液。
3、涂片：另取一张载玻片，用其一侧短边接触加有血滴的载玻片；向后拖动使与血滴前沿接触；稍等，让血滴沿边缘展开；单方向匀速推动血样至载玻片另一侧。
4、干片：在空气中晃动细胞涂片，使其迅速干燥。
5、镜检涂片效果：显微镜下细胞应呈均匀分布的单层，密度适可。
6、瑞氏染色：用蜡笔在血涂片上画一个约3cm×2cm的椭圆形圈，作为堤防；向圈内连续快速滴加瑞氏染液至液面呈拱凸形；静置1min，使细胞固定；向瑞氏染液中缓慢滴加相同滴数的PBS缓冲液；水平轻轻旋动载玻片，至液面浮现一层黄色金属样物质；静置染色15~20min；蒸馏水冲洗标本除去浮液；用吸水纸吸干表面水分。
7、细胞显微观察。
注意事项1、要等血涂片干透后再进行染色。
否则，细胞在染色过程中容易脱落。
2、用蜡笔作堤防时切记画的圈要完整，以免染料从缺口处流失。
3、滴加瑞氏染液时要快速连续，并且一定要形成拱凸液面，以免因溶剂挥发至干导致染料颗粒沉积在血膜上。
细胞生物学实验讲义
《细胞生物学》实验指导目录实验一细胞大小测定和生物绘图法（验证性）2实验二细胞中过氧化物酶的显示（验证性）2实验三细胞内糖类的显示（验证性）2实验四细胞Feulgen反应（验证性）2实验五动物细胞培养（综合性）4实验六细胞膜通透性的观察和细胞活力测定（创新性）4实验一细胞大小测定和生物绘图法一、实验目的1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。
2. 掌握生物绘图的基本方法。
二、实验原理（一）测微尺的原理测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。
目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。
物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。
当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。
因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。
将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物测微尺格数目微尺每格所代表的实际长度= ×10um目测微尺格数例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。
测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为8×5=40um。
（二）生物绘图的基本要求1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。
形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。
2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。
3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。
4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。
细胞生物学重点讲义
《细胞生物学》重点讲义第1章—绪论1、概念：细胞生物学2、9世纪自然科学的“三大发现”：细胞学说、能量转化与守恒定律、达尔文进化论第2章—细胞基本知识概要1、概念：细胞2、如何理解细胞是生命活动的基本单位？3、病毒的结构及其增殖过程？第3章—细胞生物学研究方法略第4章—细胞膜与细胞表面1、概念：细胞膜、生物膜、细胞连接、胶原2、生物膜的基本结构特点是什么？这些特征与它的生理功能有什么关系？3、细胞连接有哪几种类型？各有何功能？第5章—物质的跨膜运输与信号传递1、概念：协同运输（共运输与对向运输）、细胞通讯、细胞识别、细胞信号通路、分子开关蛋白2、物质的跨膜运输方式与哪些？各有什么特点？3、Na+-K+泵的工作原理？4、胞饮作用与吞噬作用的比较？5、细胞有哪些方式进行通讯？各种方式之间有何不同?6、细胞有哪几种方式通过分泌化学信号进行细胞间相互通讯?第6章—细胞质基质与细胞内膜系统1、概念：蛋白质分选、信号肽、共转移、后转移2、信号假说的主要内容？第7章—细胞的能量转换—线粒体和叶绿体1、概念：呼吸、呼吸链、光合作用、光反应中心2、线粒体各结构上的标志酶分别是什么？3、光合作用的过程4、线粒体的氧化磷酸化与叶绿体的光合磷酸化的异同点5、氧化磷酸化偶联机制的化学渗透假说的内容第8章—细胞核与染色体1、概念：核孔复合体、染色体、染色质、核小体、常染色质、异染色质（结构异染色质和兼性异染色质）、2、核孔复合体的功能3、染色体DNA的三种功能元件第9章—核糖体略第10章—细胞骨架1、概念：细胞骨架、细胞核骨架2、微管和微丝的特异性药物第11章—细胞增殖及其调控1、概念：细胞周期、检验点、细胞周期同步化、联会、二价体、四分体、2、细胞周期中各个时期及其主要事件（包括有丝分裂和减数分裂）第12章—细胞分化与基因表达调控1、概念：细胞分化、细胞癌变、转分化、去分化、再分化、再生、细胞全能性、癌基因、抑癌基因2、细胞分化的影响因素3、癌细胞的基本特征4、良性肿瘤与恶性肿瘤的区别第13章—细胞衰老与凋亡1、概念：细胞衰老、Hayflick界限、细胞凋亡、细胞坏死2、细胞衰老的特征3、细胞凋亡的特征4、细胞凋亡与细胞坏死的区别。
细胞生物学实验讲稿 (18)
视频4.1 如何“养”好细胞？同学们好！这一节我们学习的内容是如何“养”好细胞。
希望回答下面几个问题：①什么是“养细胞”？②为什么要“养细胞”？③如何养好细胞？1、“养细胞”的含义“养细胞”即细胞培养(cell culture)，是指在体外模拟细胞体内生长的条件、使细胞得以在体外生长繁殖的过程。
按细胞材料来源分为原代培养和传代培养，如材料直接来源于生物体，称为原代培养；如分割细胞培养物进行再培养，则称为传代培养。
所培养的细胞，有的不粘附于支持物、呈悬浮状态生长，称为悬浮生长型细胞；有的需要粘附于一定固相支持物表面才能很好生长，称为贴壁生长型细胞或粘附依赖型细胞。
2、为什么要“养细胞”？（1）排除其他细胞干扰的情况下研究细胞本身的生理和功能。
（2）控制细胞生长条件，研究环境因素对细胞的影响。
（3）对细胞进行遗传改造及应用。
3、如何养好细胞？要养好细胞，需要做到如下几点：（1）分离获取活力好的细胞材料；（2）防止微生物污染；（3）防止混入有毒物质；（4）提供适宜生长条件。
4、如何获得活力好的细胞材料？如为原代培养细胞，材料要新鲜而且酶消化程度适可；对于传代培养细胞，酶消化前的细胞状态要好而且要消化适可。
5、如何防止微生物污染？需要从3方面入手。
（1）环境消毒；（2）应用无菌培养用品和无菌溶液；（3）操作过程严格避免微生物污染。
首先，要在预先紫外消毒的无菌室及超净工作台内操作。
其次，凡与细胞材料接触细胞培养瓶、培养皿、吸管、离心管、解剖器械、平衡盐、培养液等均应无菌。
需要购买使用无菌一次性用品或对非一次性用品预先灭菌。
无菌操作过程控制包括：实验前洗手；穿戴无菌工作服、口罩和帽子；在酒精灯附近操作；物品常消毒；材料尽可能少暴露；有细胞的器皿移出超净台要加盖。
6、如何防止有毒物质危害？（1）器皿充分清洁。
（2）要用去离子水配制溶液。
7、细胞生长的适宜条件包括：适宜的培养基；适宜的培养温度；适宜的气体环境。
2011级细胞生物学实验讲义
2011级细胞生物学实验讲义实验一细胞膜通透性观察一、实验目的1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2.了解溶血现象及其发生机制。
二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。
细胞膜的通透性孔径不会大于0.5-1.0nm，并非所有的物质都能通过。
各种物质出入细胞的方式是不同的，带电的物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们的分子体积，同时也大大降低了脂溶性，因此带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散。
各种非电解质进入细胞的快慢，决定于分子量的大小和极性。
相对分子质量大的物质进入细胞慢，非极性分子比极性分子容易穿膜。
在细胞膜上有专门的水通道-水孔蛋白、和运输特定物质的载体蛋白，它们的运输方式为易化扩散。
水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
渗透作用是细胞膜的主要功能之一。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。
各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。
将红细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，分子进入红血细胞，导致水的摄入，使细胞膨胀、破裂发生溶血。
溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量有关，相对分子质量大的进入细胞慢，发生溶血所需的时间也长。
因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。
本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。
二、实验仪器、材料和试剂1、仪器、用具：小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、秒表。
2、材料：含适量阿氏液的鸡血或兔血。
细胞生物学讲义
细胞生物学实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。
（一）显微镜的使用及保护①显微镜是细胞生物学实验的主要观察工具，使用时必须注意保持外观整洁、防湿、防高温、防药品侵蚀，使用时勿使染液或其它溶液沾污镜头，一旦沾污，及时用擦镜纸蘸上镜头清洗液（无水乙醚：无水乙醇＝7：3）轻轻擦拭干净。
②带光源的显微镜待电压稳定后，将电源的光亮度调节器调至最小，再打开显微镜的电源，缓慢调节光亮度适当进行量度观察，观察完毕后，则先将光亮度调节器调至最小，然后再关闭显微镜电源开关。
③镜头的清洗：实验完毕后，镜头的清洗很重要。
用擦镜纸蘸取少量镜头清洗液，先从镜头的中央开始清洗，轻轻旋转擦至镜头的边缘部分，如此重复2－3次。
④载物台必须保持清洁，必要时亦可用擦镜纸蘸少量清洗液擦试载物台。
聚光器上的污物的去除亦可采用类似的方法。
⑤使用完毕后，玻片一律取下，套上布袋.放回原处。
本桌的显微镜一律不准搬离本实验桌。
若需使用者，可到该桌使用，使用后务必保持该显微镜的清洁。
如若发现违章使用情况，必追究使用者责任，本次实验作零分计。
（二）实验时，实验室内，一律不准高声喧哗整洁，保持室内安静，认真操作，仔细做好各项观察与记录。
（三）实验室内的一切仪器、物品必须爱护。
节约材料、药品，取用时不要过量。
公用物品不得独自占用，用后归还原处。
（四）注意安全。
使用有毒物品、强酸、强碱等，应严格按照操作规程。
易燃物品远离火源。
禁止湿手拿取电源开关或接触电源。
如发生触电等事故，及时报告。
（五）取用各种试剂，要用及时盖上瓶盖。
按献宝取出所需之药品或溶液后，不得将原液倒回瓶内。
滴管、玻棒、吸管不可混用。
（六）实验中如有丢失、损坏仪器设备及用具，及时登记并报告，凡违反操作规程造成不应有的损失者，视其情节轻重，态度好坏，按有关规定处理。
（七）本实验室欢迎各位实验者对每一实验本身提出新的看法与做法，至于能否采用，视具体情况而定。
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细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。
2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。
二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。
利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。
这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。
三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。
2、材料：鸡血。
3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。
4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。
再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。
（2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。
甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。
（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。
（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。
该液应现配现用，不宜久置。
四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。
2、固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中固定10分钟，取出后在室温下晾干。
3、染色：滴甲基绿派洛宁混合染液于血膜上，染色15min。
4、冲洗：用蒸馏水冲洗标本片，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干。
5、分化：将血涂片在95%酒精中迅速地过一下，进行分色，取出晾干。
6、观察：光镜下可见细胞质呈现红色，细胞核呈绿色。
五、作业与思考1、简述DNA和RNA的染色原理。
2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色？为什么？鸡血细胞体外融合一、实验目的（1）了解聚乙二醇诱导体外细胞融合的基本原理。
（2）通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
（3）二、实验原理细胞融合又称体外细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体细胞同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组和在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：1.病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒；2.化学因子诱导的细胞融合，如PEG；3.电场诱导的细胞融合；4.激光诱导的细胞融合。
PEG是乙二醇的多聚合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。
PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。
该方法应用相对分子质量为400-6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。
融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
三、实验仪器、材料和试剂（1）仪器、用具：注射器、离心管、离心机、水浴锅、滴管、显微镜烧杯、容量瓶、载玻片、盖玻片、酒精灯等。
（2）材料：鸡血细胞。
（3）试剂：1）0.85%NaCl溶液2）GKN液：8.0gNaCl, 0.4g KCl, 1.77g Na2 HPO4·2H2O, 0.69g NaH2PO4·H2O, 2.0g 葡萄糖，0.01g 酚红，溶于1L蒸馏水中。
3）50%（m/v）PEG溶液：取50g PEG4000 水浴融化后冷却至50~60℃加50m预热至50~60℃的GKN液，混匀，至于37℃备用。
4）Hanks 原液（10×）：80.0g NaCl, 1.2g Na2 HPO4·2H2O, 4.0g KCl , 0.6g KH2PO4 , 2.0g MgSO4·7H2O, 10.0g 葡糖糖，1.4g CaCl2○1称取1.4g CaCl2，溶于30~50mL蒸馏水中。
○2取1L的烧杯及容量瓶各一个，先在烧杯中放入800mL蒸馏水，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。
必须在前一药品完全溶解之后，方可加入下一药品，直到葡糖糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1L。
5）Hanks液：Hanks 原液100mL蒸馏水896mL0.5%酚红4mL配好的hanks液保存于4度冰箱。
四、方法与步骤1.制作鸡血细胞储备液取来鸡血后，按照100U肝素/5mL全血的比例制成抗凝全血，然后再在其中加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制成红细胞储液，置于4℃冰箱内可供一周使用。
2.细胞悬液的制备取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL0.85%NaCl 溶液，混匀后，1200r/min离心5min，弃去上清液，再加入5mL0.85%NaCl溶液按上述条件离心一次。
最后，弃去上清液，加入3mL的GKN溶液制成鸡血细胞悬液。
3.鸡血细胞的收集吸取1mL鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mL Hanks液混匀，1000r/min离心5min。
弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
4.PEG诱导细胞融合（KEY）吸取1mL 37℃的50%PEG溶液，沿着管壁迅速加入然后立即轻轻摇匀（此步非常容易造成血液凝集，不要拿离水浴锅太长时间）。
37℃水浴两到两分半钟。
5.终止PEG作用缓慢加入5mL Hanks液，轻轻吹打混匀，置于37℃水浴锅中静置5min。
6.制备细胞悬液用吸管轻轻吹打细胞团块分散（KEY），1000r/min离心5min,使细胞完全沉降。
弃去上清液，加800mLHanks，混匀。
7.镜检在载玻片上滴一小滴细胞悬液，盖上盖玻片，先在10倍镜下找到细胞，再在40倍镜下看，如看到有疑似融合的，先调焦做第一次确定，如若确定通过，再用100倍镜确定（另外，视野较暗会比较容易观察）。
Feulgen反应一、实验目的学习Feulgen反应的原理与操作步骤。
二、实验原理Feulgen反应是由Feulgen和Rossenbeck 于1924年创立，是特异性显示DNA的最经典方法。
它主要包括DNA水解和显色两个反应步骤。
DNA在60℃条件下经稀酸（1mol/L HCL）水解，分子中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂反应，形成紫红色的化合物，因此，细胞内含有DNA的部位会呈现紫红色阳性反应。
福尔根反应即可进行DNA定位显示，又可用显微分光光度计惊醒定量分析。
Feulgen反应对组织中的DNA高度专一，组织中除DNA外还有多糖、RNA和其他自由醛基，固定液也可能产生一些醛基。
但是，自由的醛基可能被盐酸酸解消除，绝大多数RNA经1M盐酸在60℃温度下处理会降解为可溶性成分，而多糖在此反应条件下则不会产生裸露的醛醛基。
材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。
三、实验用品1、材料：洋葱根尖2、器材：解剖刀、镊子、水浴锅、载玻片、盖玻片、3、药品与试剂:1mol/L盐酸：取82.5ml密度1.19g/ml浓盐酸加蒸馏水至1000ml。
Schiff试剂：称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角瓶），时时震荡，继续煮5min （勿使之沸腾），使之充分溶解。
然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCl，冷却至25℃时，加入0.5gNa2S2O5充分震荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处理静止至少24h（有时需2~3d），使其颜色褪至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力震荡1min，然后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。
滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。
如有白色沉淀，就不能在使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾，使之再转为无色，仍可使用。
亚硫酸水：200ml自来水、10ml 10％偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾溶液、10ml 1mol/L HCl，使用前，三者混匀使用。
四、实验步骤1、将洋葱根尖放在1mol/L HCl中，在60℃水浴锅中保温8~10min。
2、蒸馏水水洗。
3、Schiff 试剂遮光染色30min。
4、用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗涤3次，每次1min。
5、水洗5min。
6、将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片。
7、镜检，细胞中凡是有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。
8、找出根尖正在分裂的细胞，并找出它的前、中、后、末、间等五个时期。
对照组：先将材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，其他步骤同实验组。
细胞凝集反应一、实验目的了解细胞膜的结构与功能。
二、实验原理细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状外被。
目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。
凝集素(lectin)是一类含糖(少数例外)的并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。
凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
三、实验用品1、土豆块茎2、显微镜、粗天平、载玻片、滴管2支、离心管2支。
3、PBS缓冲液NaCl 7.2gNa2HPO4 1.48gKH2PO40.43gH2O 1000ml4、2％的红细胞四、实验步骤1、2％的红细胞的制备：取一定量的红细胞，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2％红细胞液。
2、称取去皮土豆块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h，浸提液中含有可溶性淀粉土豆凝集素。
3、用滴管吸取土豆凝集素和2％红细胞液各一滴，置于载玻片上，充分混匀，静置20min 后，于倒置显微镜下观察血球凝集现象。
4、以PBS液加2％血细胞液作对照实验。
五、实验报告：简图表示血细胞凝集原理。
细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。