细胞生物学实验讲义

细胞内DNA和RNA的显示

一、目的要求

1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。

2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。

二、实验原理

核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。

三、器材与试剂

1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。

2、材料：鸡血。

3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。

4、试剂的配制

（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。

（2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。

甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。

（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。

（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。该液应现配现用，不宜久置。

四、内容与方法

1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。

2、固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中固定10分钟，取出后在室温下晾干。

3、染色：滴甲基绿派洛宁混合染液于血膜上，染色15min。

4、冲洗：用蒸馏水冲洗标本片，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干。

5、分化：将血涂片在95%酒精中迅速地过一下，进行分色，取出晾干。

6、观察：光镜下可见细胞质呈现红色，细胞核呈绿色。

五、作业与思考

1、简述DNA和RNA的染色原理。

2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色？为什么？

鸡血细胞体外融合

一、实验目的

（1）了解聚乙二醇诱导体外细胞融合的基本原理。

（2）通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。

（3）

二、实验原理

细胞融合又称体外细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体细胞同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组和在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：1.病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒；2.化学因子诱导的细胞融合，如PEG；3.电场诱导的细胞融合；4.激光诱导的细胞融合。

PEG是乙二醇的多聚合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。该方法应用相对分子质量为400-6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。

三、实验仪器、材料和试剂

（1）仪器、用具：注射器、离心管、离心机、水浴锅、滴管、显微镜烧杯、容量瓶、载玻片、盖玻片、酒精灯等。

（2）材料：鸡血细胞。

（3）试剂：

1）0.85%NaCl溶液

2）GKN液：8.0gNaCl, 0.4g KCl, 1.77g Na2 HPO4·2H2O, 0.69g NaH2PO4·H2O, 2.0g 葡萄糖，0.01g 酚红，溶于1L蒸馏水中。

3）50%（m/v）PEG溶液：取50g PEG4000 水浴融化后冷却至50~60℃加50m预热至50~60℃的GKN液，混匀，至于37℃备用。

4）Hanks 原液（10×）：

80.0g NaCl, 1.2g Na2 HPO4·2H2O, 4.0g KCl , 0.6g KH2PO4 , 2.0g MgSO4·7H2O, 10.0g 葡糖糖，1.4g CaCl2

○1称取1.4g CaCl2，溶于30~50mL蒸馏水中。

○2取1L的烧杯及容量瓶各一个，先在烧杯中放入800mL蒸馏水，然后按上述

配方顺序，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解之后，方可加入下一药品，

直到葡糖糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1L。

5）Hanks液：

Hanks 原液100mL

蒸馏水896mL

0.5%酚红4mL

配好的hanks液保存于4度冰箱。

四、方法与步骤

1.制作鸡血细胞储备液

取来鸡血后，按照100U肝素/5mL全血的比例制成抗凝全血，然后再在其中加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制成红细胞储液，置于4℃冰箱内可供一周使用。

2.细胞悬液的制备

取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL0.85%NaCl 溶液，混匀后，1200r/min离心5min，弃去上清液，再加入5mL0.85%NaCl溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入3mL的GKN溶液制成鸡血细胞悬液。

3.鸡血细胞的收集

吸取1mL鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mL Hanks液混匀，1000r/min离心5min。

弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。

4.PEG诱导细胞融合（KEY）

吸取1mL 37℃的50%PEG溶液，沿着管壁迅速加入然后立即轻轻摇匀（此步非常容易造成血液凝集，不要拿离水浴锅太长时间）。37℃水浴两到两分半钟。

5.终止PEG作用

缓慢加入5mL Hanks液，轻轻吹打混匀，置于37℃水浴锅中静置5min。

6.制备细胞悬液

用吸管轻轻吹打细胞团块分散（KEY），1000r/min离心5min,使细胞完全沉降。弃去上清液，加800mLHanks，混匀。

7.镜检

在载玻片上滴一小滴细胞悬液，盖上盖玻片，先在10倍镜下找到细胞，再在40倍镜下看，如看到有疑似融合的，先调焦做第一次确定，如若确定通过，再用100倍镜确定（另外，视野较暗会比较容易观察）。

Feulgen反应

一、实验目的

学习Feulgen反应的原理与操作步骤。

二、实验原理

Feulgen反应是由Feulgen和Rossenbeck 于1924年创立，是特异性显示DNA的最经典方法。它主要包括DNA水解和显色两个反应步骤。DNA在60℃条件下经稀酸（1mol/L HCL）水解，分子中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原