现代分子生物学技术

标记物:核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等
非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素
（1）双链DNA探针
缺口平移法
☻ 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合 酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3„羟基末端。 ☻ 同时该酶具有从5„→3‟的核酸外切酶活性,能从切口的5„端 除去核苷酸。 ☻ 由于在切去核苷酸的同时又在切口的3„端补上核苷酸,从 而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放 射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 ☻ 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
Rosalind Franklin
成像
X-ray 光源 DNA
Maurice Wilkins
1953- Franklin & Wilkins
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
Jacob and Monod
（二）两大技术保证：
10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
500~25 50~1
☻在紫外线的照射下 结合溴化乙锭（简称 EtBr）的DNA分子发 出荧光,每条DNA带中 仅含有0.05μg的微 量DNA也可以被清晰 地检测出来。
电泳操作基本程序
称样
溶解
加热
制板
倒胶
取样
点样
电泳
检测
结果分析
（二） 核酸的分子杂交
将带有互补的特定核苷酸序 列的单链DNA或RNA混合在一 起，其相应的同源区段就会 退火形成双链结构。如果退 火的核酸来自不同的生物有 机体，所形成的双链分子就 被称为杂种核酸分子。 DNA/DNA 或DNA/RNA
不同 温度 下DNA 的构 型变 化
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电 泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管 或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在 凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的， 因此，核酸杂交也被称为“印迹杂交”。
蛋白质样品的制备
SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳
蛋白质的电转移：硝酸纤维素滤膜
靶蛋白的免疫学检测
Step 1.靶蛋白于第一抗体（一抗）反应
Ste p 3. 显 色 反 应 ： 酶 促 反 应
Step 2.与 标记 的第 二抗 体（ 酶标 二抗 ）反 应
4、原位杂交（in situ hybridization ）
不能和下一个核苷酸通 过磷酸二酯键连接起来
3’
AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG
添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一种标记的ddNTP
5’
在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.
ddTTP
ddCTP
ddGTP
ddATP
3’
5’
AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’ T TCGAT T 反应 TCGATT TCGATTT TC TCGATTTC C反应 TCGATTTCC G 反应 TCG A 反应 TCGA
分子生物学研究方法
基因操作
DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定点突变 PCR扩增等
核心技术
一、发展历程及基础
（一）三大成就 ：
1、 40年代确定了遗传信息的携带者，即基 因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗 传的物质基础问题；
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复 制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
DNA加样孔
阴极
阳极
大分子量的DNA 移动的慢
小分子量的DNA 移动的快
电泳缓冲液
DNA和RNA被称为多聚阴离子（polyanions），核酸分子放 置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强 度下，DNA分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和 构型。
琼脂糖凝胶电泳
☎琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间
是将RNA分子从电泳凝胶 转移到硝酸纤维素滤膜或 其他化学修饰的活性滤纸 上，进行核酸杂交的一种 实验方法。
分离的 mRNA (不同长度)
探针 DNA结合
3.Western blotting（蛋白质杂交技术）
☎将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体 进行反应。 主要步骤：
(5)PCR反应的缓冲溶液 : 提供合适的酸碱度和
某些离子：10～50mmol/L Tris-HCl缓冲液、 50mmol/L KCl、明胶
PCR仪
（五） 核苷酸序列分析
1. Sanger双脱氧链终止法(dideoxytermination sequencing)
原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核 苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’ 端不 具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在 每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度 的DNA片段测定出核苷酸序列。
（四）基因扩增
☎聚合酶链式反应，即PCR技术，是一 种在体外快速扩增特定基因或DNA序 列的方法，故又称为基因的体外扩增 法。
1、 基本原理 ：PCR由变性--退火--延伸三个
基本反应步骤构成。
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右,一定 时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备；
Southern Blotting的过程
（1）碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA
（2）通过电泳液的移动转移胶中的DNA （3）固定胶中的DNA （4）预杂交和杂交（放射性和荧光检测） （5）结果检测
☻常用 的荧光 染料： C 5、 C 3 等
2.Northern blotting （RNA印迹技术）
1.DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶
限制性酶
连接酶
2. DNA的核苷酸序列分析技术
二、 DNA操作技术
（一） 核酸的凝胶电泳
基本原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一 定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用 下的迁Baidu Nhomakorabea速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和 电泳分子本身所携带的净电荷数成正比,与分子的摩 擦系数成反比
从M13载体衍生序列合成单链DNA探针
从RNA合 成单链 cDNA探针
（三） 细菌转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自
另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变 的生命过程。
提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的
细菌菌株则被称为受体菌株。
处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。
随机引物法
☎ 随机引物合成双 链探针是使寡核 苷酸引物与DNA 模板结合,在 Klenow酶的作用 下,合成DNA探针。 产物平均长度为 400-600个核苷 酸。
（2）单链DNA
从M13载体衍生序列合成单链DNA探针
从RNA合成单链cDNA探针
（3）寡核苷酸探针
（4）末端标记DNA探针 （5）RNA探针
步骤：
1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预 处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀 （形成原生质球）。
2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复 合物。
3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合 物便会被细胞所吸收。
4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、 细胞活性恢复 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。
5’ 到3’ 方向聚合的能力 3’到 5’ 外切酶活性
通常具有 Taq
DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性
(3)镁离子浓度: Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过
高导致非特异扩增，一般常用1.5mmol/L
(4)底物浓度:dNTP浓度在20～200 mol/L，四种
dNTP必须浓度相等
第一次PCR 循环的结果是产生两个靶序列的复制。
No. of
1 cycle = 2 Amplicon
No. Amplicon Copies of Target
2 cycle = 4 Amplicon
Cycles
3 cycle = 8 Amplicon
1 2 3
2 4 8
4 cycle = 16 Amplicon
每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs 处
T
C
G
A
3’ C C T T T A G C T
反应终止后，四个反应 管中的反应混合液分别进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离.
这四个反应管中延伸的 寡核苷酸仅相差一个碱基. 电泳结构通过显色指示.
5’
过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个 系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种 双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后 电泳→凝胶干燥→放射自显影（该法亦适合mRNA的序 列分析） 。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应 中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。
DNA的定位
RNA定位
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进 行杂交，称为原位杂交。 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的 靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
核酸原位杂交的基本步骤
☻细胞或组织的固定：载玻片 ☻组织细胞杂交前的预处理: 用去垢剂或蛋白酶除
去核酸表面蛋白质
☻探针的选择和标记 ☻杂交
☻杂交结果检测
检测重组体克隆的菌落杂交技术
5、探针的标记
探针的种类:根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根
据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非 放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探 针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记 探针。
材料：尼龙滤膜 、硝酸纤维素滤膜 、二乙氨基乙基纤维素滤 膜（DEAE） 步骤：
第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印 迹转移、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和 噬菌斑印迹法;
第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的 DNA或RNA探针进行杂交
1、Southern Blotting（DNA印迹技术）
长度：15～30个核苷酸 碱基分布随机 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性
3′端必须互补
5′端可游离 引物浓度一般为0.1～ 0.5mol/L
（2）DNA 聚合酶
在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化
新链的合成
需要具有 具有
3’ -OH 的引物
5 cycle = 32 Amplicon
4
16
32 64 1,048,576 1,073,741,824
6 cycle = 64 Amplicon
5 6
7 cycle = 128 Amplicon
20 30
2、PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ （1）PCR引物设计
一对引物，与3′端互补
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热 变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用 下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保留 复制原理，合成一条 新的与模板DNA互补 的链。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
☎聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1到1000个碱基对之间
☻凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强；反之浓 度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100
2. DNA序列测定的自动化
1）模板制备:可自动化 2）定序反应:可自动化 3）凝胶电泳:自动化有一定困难
4）核苷酸序列阅读与计算机输入:可自动化
（六）DNA与蛋白质相互作用研究
1. 凝胶阻滞试验:凝胶阻滞试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变 动试验（DNA mobility shift assay），是用 于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特 殊的凝胶电泳技术。