基因工程载体XXXX
基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
基因工程载体名词解释
基因工程载体是指能将分离或合成的基因导入细胞DNA分子，并在其中得以维持的DNA分子。
这些载体通常具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并保持其稳定性和表达。
基因工程载体的类型包括质粒DNA、病毒DNA和科斯质粒等。
其中，质粒是一种小型环状DNA分子，可以自我复制，并能够在细菌细胞中稳定存在。
病毒DNA则是一种感染细胞的病毒，其基因组可以插入外源基因并携带其进入细胞。
科斯质粒则是一种人工合成的质粒，具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并维持其稳定性和表达。
在基因工程操作中，载体被用来将外源基因导入受体细胞，并在其中表达。
通过使用载体，研究人员可以更容易地操作和调控基因的表达，从而更好地了解基因的功能和作用机制，为疾病治疗、药物研发等提供重要的支持。
基因工程载体的基本结构
基因工程载体是基因工程技术的核心组成部分，其基本结构对于成功进行基因转移和表达至关重要。
这些载体通常是DNA分子，具有特定的结构和功能，以便在宿主细胞中稳定存在并传递目标基因。
基因工程载体的基本结构通常包括以下几个部分：
复制起点：这是载体DNA复制的起始点，确保载体能够在宿主细胞中自主复制。
复制起点通常是来自病毒或质粒的序列。
选择标记：选择标记是用于在宿主细胞中识别和选择已成功导入载体的细胞。
常见的选择标记包括抗生素抗性基因和营养缺陷型互补基因。
多克隆位点：多克隆位点是一段位于载体上的DNA序列，用于插入目标基因。
该位点通常包含多个限制性内切酶识别序列，以便将目标基因方便地插入到载体中。
启动子和终止子：启动子是用于控制目标基因在宿主细胞中的表达的DNA序列，而终止子则标志着基因表达的结束。
这些元件确保目标基因在宿主细胞中以预期的方式表达。
复制子和原核序列：这些序列允许载体在特定的宿主细胞（如细菌）中复制和维持。
原核序列还为载体提供稳定性，并确保其在细胞分裂过程中传递给后代细胞。
此外，基因工程载体的设计还需考虑一些重要因素，如载体的大小、拷贝数、稳定性和毒性等。
为了获得理想的基因转移和表达效果，科学家们需要仔细选择和构建合适的载体，以满足特定的实验需求和应用场景。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
基因工程第五章-载体
• 最后：4℃ 12000rpm离心10分钟，将上清 转移到另一离心管中，上清中是质粒DNA 。 加等体积氯仿，振荡混匀，
4℃12000rpm离心10分种，将上清转移到 另一离心管中。用2倍体积的无水乙醇沉淀 双链DNA。温和振荡混匀，于-18℃放置20 分钟。用微量离心机于4℃以12000rpm离 心10分钟。弃上清，加入70%冷乙醇洗沉 202淀0/3/310 -2次真空干燥DNA沉淀后，将其溶于TE
• 共价闭合超螺旋形式：（covalently closed circular，简写 cccDNA）
• 开放环结构：一条保持着完整的环结构，另一条有一个或数个 切刻。
• 线性结构：质粒在限制性酶作用下，双链断裂，形成线性，又 叫L型。 克隆只有超螺旋可用。
2020/3/30
2. cccDNA分子分离特性：
2020/3/30
2、pUC质粒载体：
有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。如抗 药性、显色表型、营养缺陷型、荧光表型等. 有一个或几个限制性酶切酶的单一识别位点，便于外源基因 的插入。
适当的拷贝数。高拷贝数不仅利于载体的制备，也有利于克 隆基因的剂量的增加。
载体的分类：质粒载体――可容纳15KB的外源片断 噬菌体载体――25－45KB 人工染色体－－45KB以上
• 由于cccDNA分子团压成一个紧密 的结构，当我们用EBr、丫啶橙染 料分子作用后，线性分子染料插入 的分子个数多，cccDNA插入的分 子个数少，密度大，所以沉降系数 大，进行密度梯度离心时可将其分 开
• cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线 性和开放环结Байду номын сангаас的DNA），如果变性，由于团在一起，条 件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变 性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中 沉淀下来。
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程载体(质粒-3章)幻灯片(1)
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。
如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以 迁移但属于非接合型质粒。
2）F 因子
F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子 (fertility factor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有 三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式 存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双 链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因 或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式， 从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞 (高频重组细胞)。
如加入不同启动子序列，用于生产单链 DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加 入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片 段等等。
质粒载体的选择标记：
外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入 宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需 要利用质粒载体的可选择标记。
质粒载体的选择标记
抗生素抗性基因选择标记
蓝-白斑实验
构建的质粒人工载体，应用最广的是 PBR322，分子量为2.6×106，含46332bp。 含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来 自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因 来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9 （一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切 酶位点有9个
植物基因工程载体
4、植物病毒载体
与农杆菌Ti质粒载体相比, 植物病毒表达载体 系统具有许多优点: 首先，是病毒增殖水平较高, 可使伴随的外源基因高水平表达; 其次, 病毒增殖 速度快, 外源基因在很短时间(通常在接种后1~2 周内)可达最大量的积累; 第三, 病毒基因组小, 易 于进行遗传操作, 大多数植物病毒可以通过机械 接种感染植物, 适于大规模商业操作; 第四, 宿主 范围广, 一些病毒载体能侵染农杆菌不能或很难 转化的单子叶、豆科和多年生木本植物, 扩大了 基因工程的宿主范围; 第五, 病毒颗粒易于纯化, 可显著降低下游生产成本。所以植物病毒是外
而根瘤菌染色体上的操纵子表达产
物则与单链T-DNA结合形成复合物，
后者转化植物根部细胞。
植物根部 羟基乙酰丁香酸 Ti 质粒 单链 T-DNA
植物细胞
Ti 质粒的结构与功能
T-DNA的染色体整合机制
表达 特异性核酸内切酶
在LB和RB的第三和第四个碱基之间切开 单链T-DNA整合在植物的基因组上
Ti 质粒的结构与功能
名称
酵母人工染色体(YAC)
人工染色体的种类和特点
宿主细胞
功能元件来 源
结构
插入片段 容量
参考文献
酵母细胞
酵母染色体
线状DNA 100~2000(kb)
Murry,et al.,1983
细菌人工染色体(BAC)
大肠杆菌
大肠杆菌F因子
环状质粒 <350(kb)
Shizuya,et al.,1992
来源于P1人工染色体(PAC)
电击法
将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原 生质体悬浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组 织培养基中生长 1 - 2 周，再生出整株植物。
简述基因工程载体的特点
简述基因工程载体的特点基因工程载体是基因工程中的一种重要工具，它具有以下特点：1. 大小适中：基因工程载体通常是一段双链DNA分子，它的大小通常在几千到数万个碱基对之间。
这样的大小既能容纳所需的基因片段，又能在细胞内稳定复制和传递。
2. 载体复制能力强：基因工程载体需要具备在宿主细胞内稳定复制的能力，以确保基因片段的传递和表达。
为此，载体通常包含一个或多个复制起始序列（origin of replication，ori），使宿主细胞能够识别并启动载体的复制过程。
3. 多克隆位点：基因工程载体通常具有多个克隆位点，用于插入外源基因片段。
这些位点通常是具有特定限制酶切位点的DNA序列，使得外源基因片段能够被限制酶切开并插入到载体中。
4. 选择标记：为了能够筛选出已经转化了外源基因的细胞，基因工程载体通常还包含一个选择标记。
选择标记可以是一段与宿主细胞耐药性相关的基因序列，例如抗生素抗性基因，转化了该载体的细胞在含有相应抗生素的培养基中能够存活下来。
5. 表达调控元件：为了实现外源基因的表达，基因工程载体通常还包含一些表达调控元件。
这些元件包括启动子、转录终止子和调控序列等，它们能够控制外源基因的转录和翻译过程，使其能够在宿主细胞中产生所需的蛋白质。
基因工程载体的特点使其成为了基因工程研究和应用中的重要工具。
其大小适中，能够容纳所需的基因片段，并能够在细胞内稳定复制和传递。
通过克隆位点的设计，可以将外源基因片段插入载体中，并通过选择标记筛选出转化了外源基因的细胞。
而表达调控元件的存在，则使外源基因能够在宿主细胞中得到表达，并产生所需的蛋白质。
基因工程载体的应用非常广泛。
例如，基因工程载体可以用于基因克隆，将外源基因片段插入载体中，并通过转化技术将其导入宿主细胞，从而实现基因的研究和功能分析。
此外，基因工程载体还可用于基因表达，通过插入外源基因并调控其表达，使宿主细胞产生所需的蛋白质，例如生产重组蛋白和抗体等。
基因工程载体XXX
质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒 挑选出来。
基因工程载体XXX
4.1 选择标记基因
基因工程载体XXX
4.2 筛选标记基因
(1)α-互补(α-complementation) • 是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操
是第一个真核生物的克隆载体。
基因工程载体XXX
基因工程载体XXX
5.2 pBR322
pBR322 为 4.36kb 的 环 状 双 链 DNA ， 其 碱 基 序 列 已 经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把 pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达 组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的 质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原 型质粒在使用上有优点。
• 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿
主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强
启动子；
基因工程载体XXX
• 按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载 体、人工染色体载体等。
• 按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。
基因工程载体XXX
第二节 克隆载体
• 克隆载体(cloning vector)：是指用于扩增 或保存外源DNA片段而设计的载体。
基因工程载体XXX
5.4 T-载体
基因工程载体XXX
6 质粒克隆载体的用途
• 用于保存和扩增片序。 • 作为核酸杂交时探针的来源。
基因工程载体XXX
二、 λ噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同分子生物学、分 子遗传学的创立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和 解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研 究成果。依据噬菌体的复制和生活周期等特点， 已经构建了许料。
基因工程的载体和受体情况讲解
4.载体的种类
• 质粒（plasmid） • 噬菌体或病毒DNA • 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 • 人造染色体载体
（一）质粒（plasmid） 1.质粒的定义
质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳 定遗传的一类核酸分子。
质粒常见于原核细菌和真菌中。 绝大多数的质粒是DNA型的。 绝大多数质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）。 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb。 功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮 、产生酶类、降解功能等。
2.质粒的基本特征
（1）质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型：
✓严紧型复制控制的质粒：1 - 3 拷贝 stringent plasmid
✓松弛型复制控制的质粒：10 - 60 拷贝 relaxed plasmid
✓ 当细菌侵入植物组织后，可以把细菌的DNA释放到植物细胞中。 这时，Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破 坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。
✓ Ti质粒大小约200 kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植 物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因 可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植 物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种 的目的。
✓ Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。
– ColE1：分子量约为5×106 Dalton，无接合作用，多拷 贝； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的 研究和用于体外复制系统上。
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(3)质粒的拷贝数:是指每个宿主细胞内质粒 的数量。根据每个宿主细胞中质粒拷贝数的 多少，把质粒分为严紧型复制质粒(拷贝数少， 为1-5个)与松弛型复制质粒(拷贝数多，可达 10-200个拷贝)。因此，作为载体的质粒应该 是松弛型的。
(4)质粒的不相容性(incompatibility,又称 质粒的不亲和性)：两种不同质粒，不能够在 同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。(亲缘 关系密切的,野生型和其衍生质粒。)
5 常用质粒克隆载体
Hale Waihona Puke 5.1 pSC101质粒载体
一种严谨型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质 粒载体。平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝；分 子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因 （tetr ）。有HindⅢ 、EcoRⅠ、BamH Ⅰ 、 SalⅠ 、Xho Ⅰ 、PvuⅡ、Sma Ⅰ 7种核酸内切限 制酶。其中在HindⅢ 、 BamH Ⅰ、 SalⅠ 3个位 点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。
Plasmid chromosome
ccc
2.质粒的生物学特性
(1)质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地 游离状态,但在一定地条件下又会可逆地整合 到寄主染色体上,随着染色体地复制而复制。
(2)质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可 以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿 梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体 在基因工程中应用广泛。
表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强 启动子；
按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载 体、人工染色体载体等。
按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。
第二节 克隆载体
克隆载体(cloning vector)：是指用于扩增 或保存外源DNA片段而设计的载体。 克隆载体的结构特征
pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切 识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部， 2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位 点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶 在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，
第四章 基因工程载体
§1 概述 §2 克隆载体 §3 大肠杆菌表达载体
第一节 概述
载体（vector）是指将外源DNA或基因携带进入宿 主细胞进行扩增或表达的工具。 按功能:克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内 表达和分泌表达载体。
克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆， 建立DNA和cDNA，其上有复制子即可；
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷 酸序列。
一、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成 的克隆载体,主要用于smid )的概念：
独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。 天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、 开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
(2)插入失活(insertional inactivation)
在质粒pBR322的抗四环素基因上插 入一个外源基因后，导致抗四环素基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这
样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来
筛选是否有外源基因片段插入到载体中， 这种筛选方法称为插入失活。
抗药性标记选择(插入失活法)
是第一个真核生物的克隆载体。
5.2 pBR322
pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已 经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把 pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达 组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的 质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原 型质粒在使用上有优点。
③载体都具有合适的遗传标记基因。 ④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害
的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其 他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源 基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细 胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代 而不易丢失。
4.标记基因
标记基因按其用途分为2类： 选择标记基因:用于鉴别目的载体的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来。 筛选标记基因:用于区别重组质粒与非重组 质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒 挑选出来。
4.1 选择标记基因
4.2 筛选标记基因
(1)α-互补(α-complementation) 是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操 纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵 基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互 补，从而产生具有β-半乳糖苷酶学活性的 蛋白，这种现象就称为α-互补。
3.质粒载体的发展概况
第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利 用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多 克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的 不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
ori
MCS
pUC Ampr 遗传标记
克隆载体具备的条件
①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞， 或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA 上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶 位点，即多克隆位点。
pBR322的结构来源
pBR322质粒载体的优点：
(1)、具有较小的分子量；
它的分子量为4363bp。意味着可以很容易纯化质粒本身及 其所携带的重组DNA分子。即使添加上6kb的DNA链，重组 的pBR322的大小仍在可操作的范围内(＜10kb)。
(2)、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的 选择记号。