黑曲霉诱变方法比较研究_陈凤莲

由于自然突变几率很低，在育种中只靠自然突变获得变体的数量很少，要从群体中筛出个别有价值的优良变异体的机会就更少。应用物理、化学或生物因子提高突变率，能够获得有价值的优良突变体，所以目前诱发突变已广泛应用于微生物育种等许多方面。诱变育种就是利用物理、化学或生物因素，使微生物体内的遗传物质——

—DNA的分子结构发生改变，及产生基因突变，从而导致微生物的性状发生变异。然后用一些方式将少数有益的变异株选出来，从而达到获得优良菌株的目的。

诱变育种的方法有物理诱变、化学诱变以及复合诱变。现存资料有关对黑曲霉的诱变报道中，所采用的方法大多是紫外线物理诱变、亚硝酸或亚硝基胍化学诱变以及两者结合的复合诱变[1]。本研究在此基础之上，比较了黑曲霉的紫外诱变与复合诱变的效果，希望能够为以后深入的研究提供一个参考依据。1材料与方法

1.1材料

黑曲霉(Aspergillus niger A3)菌种：哈尔滨微生物研究所；α—淀粉酶；木瓜蛋白酶：南宁海江贸易有限公司；小麦麸皮：黑龙江地产。

1.2方法

1.2.1木聚糖粗提物的制备

将麦麸配制成一定底物浓度的溶液，装于1000mL 锥形瓶中在沸水浴中煮沸15min，冷却后加入一定量的蛋白酶，在水浴中维持50℃，反应4h，以除去麸皮中的蛋白质。水解结束后将水浴升温到80℃，维持20min对酶进行灭活，冷却。用油布进行过滤，残渣用蒸馏水反复冲洗，直至滤液澄清为止。所得残渣再次配成一定底物浓度的溶液，加入一定量的α—淀粉酶，在95℃搅拌酶解25min，以除去麸皮中的淀粉。冷却，用油布进行过滤，残渣用蒸馏水反复冲洗,直至滤液澄清为止。将麸皮平铺于滤纸上，自然晾干。

1.2.2培养基

斜面培养基：马铃薯培养基。

陈凤莲１，２，方桂珍２，许世玉２

（1．哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨150076；2．东北林业大学，黑龙江哈尔滨150046）

黑曲霉诱变方法比较研究

摘要：黑曲霉A3为出发菌株，采取两种方法对其进行诱变处理，第一种是利用紫外线进行物理诱变，第二种是利用紫外线和亚硝酸进行复合诱变，以得到产木聚糖酶较高的菌种，利用其产木聚糖酶来降解小麦麸皮中木聚糖得到低聚木糖。通过对诱变处理后菌种所产木聚糖酶活的比较得出，单纯的紫外线诱变的效果优于复合诱变的效果。

关键词：黑曲霉；木聚糖酶；诱变

COMPOSITION OF METHOD OF ASPERGILLUS MUTANT

CHEN Feng-lian1，2,FANG Gui-zhen2,XU Shi-yu2

（mercial University of Harbin,Heilongjiang150076,Harbin,China;

2.Northeast Forestry University,Heilongjiang150046,Harbin,China）

Abstract:Suppose the Aspergillus niger as a original strain.By treating of UV-ray and nitrous acid and UV-ray,a strain that would produce xylanase whose activity was high and which hydrolyze wheat oxylane to oxylooligosaccharides was gained.Though comparing enzymes activity of oxylanse produced by the strain,we conclude that enzymes activity of oxylanse produced by the strain obtained by treating of UV-ray is higher than another one.

Key words:Aspergillus niger；oxylanse;mutant

作者简介：陈凤莲（1975—），女（汉），教师，博士研究生，主要从事保

健食品和功能性食品方面的研究。

编号No.

酶活/(U/mL)Xylanace activity/(U/mL)

A B C D E F G H

5.38879.1829 4.38578.6539

6.7668 5.3987 4.2332 6.4629

平板培养基：以木聚糖粗提物10%作为碳源,取代察氏培养基中的蔗糖,再加0.2%的胆酸钠,121℃，高压灭菌30min。

1.2.3产木聚糖酶菌株的挑选

1）新鲜的黑曲霉A3接种到PDA培养基上，置于霉菌培养箱中培养，观察待孢子成熟后停止培养。

2）孢子悬液的制备：将培养7d的孢子斜面加入适量的生理盐水，刮下孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶中，在往复式摇床上振荡0.5h(200r/min)，使孢子分散，稀释成106个/mL～107个/mL孢子悬液。

3）用移液管分别移取1mL菌悬液到平板培养基中，然后用涂布棒均匀涂布，置于霉菌培养箱中培养2d～3d观察。从中挑取能利用木聚糖粗提生长的透明圈大的单孢子菌株8株，接种于斜面PDA培养基中培养7d，并命名A、B、C、D、E、F、G、H，一部分放入0℃～4℃冰箱中备用，另外的一部分制成相对应的浓度为5×106个/mL孢子悬液并进行液体发酵，后测其酶活，挑出产酶活较大的菌株两株。

1.2.4黑曲霉的诱变及筛选

1.2.4.1孢子悬液的制备

将斜面培养基中的孢子用适量的生理盐水洗脱，置于预先灭菌的带玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡20min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至镜检为分散的单孢子，稀释成5×106个/mL孢子悬液。

1.2.4.2紫外线诱变

取5mL单孢子悬液均匀地铺于一个已灭菌的直径9cm平皿中，成1mm左右的薄层，培养皿中放一无菌磁力棒，于磁力搅拌机上用15W的紫外灯置于30cm处分别照射1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5min。复合诱变者再保持黑暗3h。

1.2.4.3亚硝酸诱变

吸取4mL诱变液于锥形瓶中,加入2mL0.1mol/L 亚硝酸钠和2mL pH4.6醋酸缓冲液,于27℃条件下摇床处理30min。吸取诱变处理后的孢子悬液2mL，加入pH8.6的Na2HPO4溶液为终止液。

1.2.4.4平板初筛

用移液管分别移取1mL不同浓度梯度的菌悬液到平板培养基中，然后用涂布棒均匀涂布，置于霉菌培养箱中培养2d～3d观察。根据菌株所产木聚糖酶水解木聚糖形成透明圈大小判断该菌产酶能力。

1.2.4.5液体发酵培养复筛

将初筛得到的菌株，制备成5×106个/mL孢子悬液。250mL三角瓶中装50mL Mandels液体培养基，用55mg木聚糖粗提物做为底物，接种5mL孢子悬液，于28℃振荡培养72h。然后于5000r/min离心30min 制得木聚糖酶液，测木聚糖酶酶活。选取产酶活性高的菌株。

1.2.5酶活测定

采用DNS3,5—二硝基水杨酸法。

2结果与讨论

2.1木聚糖酶合成菌株黑曲霉A3的挑选

通过透明圈法初步挑选出8株合成木聚糖酶酶活较高黑曲霉菌株，以便进行诱变选育。采用DNS3，5—二硝基水杨酸法分别测定酶活。数据如表1所示。

表1黑曲霉初筛菌株所产木聚糖酶酶活

Table1Xylanase activity produced by Aspergillus niger in screening

由表1得出：最终选取B和D两个菌株进行紫外和复合诱变。

2.2黑曲霉的紫外诱变及筛选

紫外线之所以能够杀菌或诱变，主要是紫外线的光谱与核酸，特别是DNA的吸收光谱相一致，DNA对波长254nm的紫外线有强烈的吸收作用，所以DNA 最易受紫外线的影响。DNA吸收紫外线后，可引起其结构发生改变，其中最主要的是诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成：胸腺嘧啶二聚体多数是在一条DNA链上相邻的两个嘧啶之间形成，也可能在两条DNA链之间形成。正是由于这种二聚体的形成，使DNA分子变形，并干扰了DNA复制碱基的配对关系，从而发生突变[1]。本实验室紫外灯的瓦数和照射距离是固定的。调整好磁力搅拌器的转速，使搅拌子均匀的搅拌黑曲霉悬浮液，通过调整紫外灯的照射时间来确定黑曲霉的最佳照射强度，菌落诱变的最佳照射强度要求致死率在85%左右，即存活率为15%左右。

菌种致死率在85%时的诱变效果较好，因为照射时间短，诱变效果不明显，无法得到想要得菌种；而过长的照射时间又会使菌种全部死亡，也无法得到预期的效果。由表2试验数据表明：紫外照射的时间为2、2.5、3、3.5、4min，随着紫外照射时间的增加，致死率不