工业微生物诱变育种诱变剂(ppt)
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第五章 工业微生物育种诱变剂讲解
辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内 在遗传因素，也受外界环境条件的影响。 1. 微生物的遗传背景 2. 微生物的生理状态 3. 可见光 4. 水分 5. 温度 6. 空气或氧气
三、非电离辐射——紫外线
紫外线是电磁波谱中波长从0.01~0.40微米辐射 的总称，不能引起人们的视觉。电磁谱中波长0.01~ 0.04微米辐射，既可见光紫端到X射线间的辐射。
绝对剂量单位：erg/mm2 相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀 菌率在90%~99.9%时，诱变效果较好。
移动式紫外灯
15W紫外灯
不同微生物所需杀菌时间
15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下 照射微生物，要使杀菌率达到90％～99.9％的效果：
芽孢菌约需10 min； 照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要1～3 min； 一般微生物营养体照射3～5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.5～2 min。
在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复，如 加入某些物质，提高突变频率。
（二）紫外线诱变
1. 紫外线的有效光谱
最有效波长为253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外 线。
30W紫外灯光谱分布范围广，诱变效率差，15W紫外 灯80%波长几种在2537Å，诱变效果比30W的好。
2. 紫外线的辐射剂量
第五章 工业微生物育种诱变剂
诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远 远超过自发突变率的物理因子或化学物质。
（1）物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电 磁波等
（2）化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、 调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、 化肥、化纤等。
（3）生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄 生虫等。
三、非电离辐射——紫外线
紫外线是电磁波谱中波长从0.01~0.40微米辐射 的总称，不能引起人们的视觉。电磁谱中波长0.01~ 0.04微米辐射，既可见光紫端到X射线间的辐射。
绝对剂量单位：erg/mm2 相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀 菌率在90%~99.9%时，诱变效果较好。
移动式紫外灯
15W紫外灯
不同微生物所需杀菌时间
15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下 照射微生物，要使杀菌率达到90％～99.9％的效果：
芽孢菌约需10 min； 照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要1～3 min； 一般微生物营养体照射3～5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.5～2 min。
在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复，如 加入某些物质，提高突变频率。
（二）紫外线诱变
1. 紫外线的有效光谱
最有效波长为253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外 线。
30W紫外灯光谱分布范围广，诱变效率差，15W紫外 灯80%波长几种在2537Å，诱变效果比30W的好。
2. 紫外线的辐射剂量
第五章 工业微生物育种诱变剂
诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远 远超过自发突变率的物理因子或化学物质。
（1）物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电 磁波等
（2）化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、 调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、 化肥、化纤等。
（3）生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄 生虫等。
工业微生物育种诱变剂
第五章 工业微生物育种诱变剂
5.1 物理诱变剂 5. 2 化学诱变剂 5. 3 生物诱变剂
工业微生物育种诱变剂
诱变： 通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生 物以引起突变，这一过程称为诱发突变。
诱发突变(induced mutation)的发现
➢ 1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。
1.4 非电离辐射——紫外线
工业微生物育种诱变剂
136-390nm
1.4 非电离辐射——紫外线
紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备 简单、操作方便、价格低廉。
紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而 且不易发生回复突变。
因此紫外线是一种使用最早也是沿用最 久的应用效果最明显的物理诱变剂。
DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上 百倍。 紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联； ②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成 嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。
(2) 紫外线的辐射剂量 绝对剂量：单位用erg / mm2 (1 erg = 10 –7 J )，需要用一种剂量仪来 测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。 相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示 剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照射微生物的距离及照射时 间。在灯的功率和灯管的距离固定的情况下，剂量大小则由照射 时间决定。 用紫外线的杀菌率表示时，一般认为90～99.9％效果较好。
0.006~1.4nm
非电离辐射 不产生离子
工业微生物育种诱变剂
紫外线
136~390nm
波长短于紫色 光的肉眼不可 见“光线”
1.2 物理诱变剂的生物学效应
1.辐射作用的时相阶段：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是 由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂 的连锁反应过程，通常可分为物理、物理－化学、化学和生物学 四个阶段。
5.1 物理诱变剂 5. 2 化学诱变剂 5. 3 生物诱变剂
工业微生物育种诱变剂
诱变： 通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生 物以引起突变，这一过程称为诱发突变。
诱发突变(induced mutation)的发现
➢ 1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。
1.4 非电离辐射——紫外线
工业微生物育种诱变剂
136-390nm
1.4 非电离辐射——紫外线
紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备 简单、操作方便、价格低廉。
紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而 且不易发生回复突变。
因此紫外线是一种使用最早也是沿用最 久的应用效果最明显的物理诱变剂。
DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上 百倍。 紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联； ②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成 嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。
(2) 紫外线的辐射剂量 绝对剂量：单位用erg / mm2 (1 erg = 10 –7 J )，需要用一种剂量仪来 测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。 相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示 剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照射微生物的距离及照射时 间。在灯的功率和灯管的距离固定的情况下，剂量大小则由照射 时间决定。 用紫外线的杀菌率表示时，一般认为90～99.9％效果较好。
0.006~1.4nm
非电离辐射 不产生离子
工业微生物育种诱变剂
紫外线
136~390nm
波长短于紫色 光的肉眼不可 见“光线”
1.2 物理诱变剂的生物学效应
1.辐射作用的时相阶段：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是 由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂 的连锁反应过程，通常可分为物理、物理－化学、化学和生物学 四个阶段。
第六章-工业微生物育种PPT课件
成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基
中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及
嘌原呤养、型嘧（啶pr的oto能tr力op）h）。营养缺陷型经回复突变或重组， 回[A到+B原-]来：野能生在型[+的]、营[B养]生要长求 [[AA+-BB++]]：, 可能在在[[-+]生]、长[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
②淘汰野生型 即浓缩缺陷型，以提高检出率
方法
抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌 和霉菌：制霉菌素）
菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）
饥饿培养（无N）MM 6~12 h 2N培养(2N)MM 1~2 h 加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
➢ 单链断裂：DNA双螺旋结构中一条链断 裂
➢ 双链断裂：DNA双螺旋结构中两条互补 链于同一对应处或相邻处同时断裂
单链断裂 双链断裂
1、DNA链断裂的分子机制
（1）脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏 （直接） （2）碱基损伤
2、不同条件下辐射所致的 DNA链断裂
• 1）充氧溶液中 DNA双链上引起SSB的概率均等，产生与
（五） 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用； ④紫外线光复活交替处理 ⑤诱变剂处理时间与诱变效应的关系
（六）影响突变率的因素 1、菌种遗传特性不同 2、菌体细胞壁结构不同 3、环境条件的影响 1）诱变前预培养 2）温度、pH、氧气等外界条件对诱变
中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及
嘌原呤养、型嘧（啶pr的oto能tr力op）h）。营养缺陷型经回复突变或重组， 回[A到+B原-]来：野能生在型[+的]、营[B养]生要长求 [[AA+-BB++]]：, 可能在在[[-+]生]、长[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
②淘汰野生型 即浓缩缺陷型，以提高检出率
方法
抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌 和霉菌：制霉菌素）
菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）
饥饿培养（无N）MM 6~12 h 2N培养(2N)MM 1~2 h 加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
➢ 单链断裂：DNA双螺旋结构中一条链断 裂
➢ 双链断裂：DNA双螺旋结构中两条互补 链于同一对应处或相邻处同时断裂
单链断裂 双链断裂
1、DNA链断裂的分子机制
（1）脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏 （直接） （2）碱基损伤
2、不同条件下辐射所致的 DNA链断裂
• 1）充氧溶液中 DNA双链上引起SSB的概率均等，产生与
（五） 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用； ④紫外线光复活交替处理 ⑤诱变剂处理时间与诱变效应的关系
（六）影响突变率的因素 1、菌种遗传特性不同 2、菌体细胞壁结构不同 3、环境条件的影响 1）诱变前预培养 2）温度、pH、氧气等外界条件对诱变
第五章工业微生物育种诱变剂
突变的主要位点：鸟嘌呤的N7，鸟嘌呤的O6、 胸腺嘧啶O4
突变的次要位点：鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、 腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3
（二）烷化剂的性质
① 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶 液中容易发生分解。
② 大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。 配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并
且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。
四、电离辐射
伦 琴 和
射 线
X
四川成都放60CO运输
河南杞县“杞人忧钴”
2. 电离辐射剂量
快中子：拉德（rad）；伦琴（R）
致死率达到50％～85％比较合适，诱变剂量大约在15～
1. UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，UPF值越大，表明防紫外线性能越好。
2. 只有当UPF＞30时，并且UVA的透过率小于5％时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30＋；
3. 而当UPF＞50时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为UPF50＋。
UPF范围 15－24 25－39
处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。
宇宙射线
五、近年来发展的新型诱变剂
1. 微波 微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素，即
热效应和非热效应。 ① 热效应是指物料吸收微波能量，使温度升高从而 达到灭菌的效果； ② 非热效应则是在电磁波的作用下，生物体内不产 生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。
2-氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出 现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。
突变的次要位点：鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、 腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3
（二）烷化剂的性质
① 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶 液中容易发生分解。
② 大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。 配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并
且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。
四、电离辐射
伦 琴 和
射 线
X
四川成都放60CO运输
河南杞县“杞人忧钴”
2. 电离辐射剂量
快中子：拉德（rad）；伦琴（R）
致死率达到50％～85％比较合适，诱变剂量大约在15～
1. UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，UPF值越大，表明防紫外线性能越好。
2. 只有当UPF＞30时，并且UVA的透过率小于5％时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30＋；
3. 而当UPF＞50时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为UPF50＋。
UPF范围 15－24 25－39
处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。
宇宙射线
五、近年来发展的新型诱变剂
1. 微波 微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素，即
热效应和非热效应。 ① 热效应是指物料吸收微波能量，使温度升高从而 达到灭菌的效果； ② 非热效应则是在电磁波的作用下，生物体内不产 生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。
2-氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出 现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。
第五章 工业微生物育种诱变剂PPT课件
12
1313
A 2 A P 2 A P * G T TCC
14
14
（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）
5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下：
1.单独处理 新鲜斜面的细菌——转接到前培养的液体培养基中——培养 到对数期——离心除去培养液——加入生理盐水或缓冲液— —饥饿培养8—10小时——加入5-BU到培养液中，使最后的 处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液 加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
注：在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度， 否则会影响诱变效果。
22
23
23
羟胺的诱变机制
改变了结构的 胞嘧啶
24
根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使 A:T G:C转换，进行逆向突变。
由于羟胺是诱发G:C
A:T的专一性诱变剂，因
此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C
A:T转换。
15
真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）， 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离 于平皿——适温培养——挑取单菌落，进行筛选。
2.与辐射线复合处理
据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理， 使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变 效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一 种辐射诱变的增敏剂。
烷根 基据 的烷 数化 目剂
中 活 性
单功能烷化剂 亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、 重氮烷类、乙烯亚胺类化合物
双功能烷化剂 硫芥子、氮芥子类等
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A 2 A P 2 A P * G T TCC
14
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（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）
5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下：
1.单独处理 新鲜斜面的细菌——转接到前培养的液体培养基中——培养 到对数期——离心除去培养液——加入生理盐水或缓冲液— —饥饿培养8—10小时——加入5-BU到培养液中，使最后的 处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液 加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
注：在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度， 否则会影响诱变效果。
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羟胺的诱变机制
改变了结构的 胞嘧啶
24
根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使 A:T G:C转换，进行逆向突变。
由于羟胺是诱发G:C
A:T的专一性诱变剂，因
此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C
A:T转换。
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真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）， 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离 于平皿——适温培养——挑取单菌落，进行筛选。
2.与辐射线复合处理
据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理， 使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变 效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一 种辐射诱变的增敏剂。
烷根 基据 的烷 数化 目剂
中 活 性
单功能烷化剂 亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、 重氮烷类、乙烯亚胺类化合物
双功能烷化剂 硫芥子、氮芥子类等
第五章工业微生物育种诱变剂共62页文档
2-氨基嘌呤（2-AP） /A 诱发的突变：AT 的?
➢ 在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 ➢ 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的 概率也高
5
（一）碱基类似物的诱变机制
——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸 腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取 代，就构成了5-BU的结构式。
C
U
A
次黄嘌呤H
16
亚 硝 酸 的 脱 氨 基 作 用 及 其 诱 发 的 突 变
17
亚硝酸诱发的突变
H N O 2 A H GG A A T C CC U T
H N O 2
A:T G┆C
18
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液 （2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液
由于羟胺是诱发G:C
A:T的专一性诱变剂，因
此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C
A:T转换。
羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接 在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般 都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或 细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度 比直接处理时低些。
（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
• 取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶 液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10— 20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使 pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。
3．烷化剂
——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂， 这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA 分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反 应，从而改变DNA分子结构，引起突变。
➢ 在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 ➢ 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的 概率也高
5
（一）碱基类似物的诱变机制
——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸 腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取 代，就构成了5-BU的结构式。
C
U
A
次黄嘌呤H
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亚 硝 酸 的 脱 氨 基 作 用 及 其 诱 发 的 突 变
17
亚硝酸诱发的突变
H N O 2 A H GG A A T C CC U T
H N O 2
A:T G┆C
18
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液 （2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液
由于羟胺是诱发G:C
A:T的专一性诱变剂，因
此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C
A:T转换。
羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接 在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般 都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或 细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度 比直接处理时低些。
（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
• 取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶 液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10— 20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使 pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。
3．烷化剂
——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂， 这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA 分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反 应，从而改变DNA分子结构，引起突变。
诱变育种(n)ppt课件
诱变育种(n)
二）选择最适诱变剂量
亚热带链霉菌（白霉素）与X射线剂量之间的变异关系
五、影响突变率的因素
1 菌种遗传特性
（有的诱变剂只作用于DNA复制期，有的可作用于各期细胞）
2 菌体细胞壁结构
（有的菌种孢子壁厚、有保护层、均减弱诱变剂的作用效果）
3 培养条件和环境条件 ⑴前培养（诱变前预培养）
第七章 突变株的分离筛选
常见分离筛选方法 1.随机挑选
随机挑选上 百个菌落， 发酵测试。
诱变处理
平板分离
常见分离筛选方法 2.平板菌落预筛
1）根据菌落形态变异筛选。 高产菌株的形态往往处在常态的正常型范围内，又有微 小变异。 2）利用平板生化反应筛选。（见前章）
常见分离筛选方法
前培养一般加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黄、b-重氮尿嘧 啶、嘌呤等物质，能显著提高突变率。若加入氯霉素、胱氨酸等还 原性物质，会使突变率下降。
⑵后培养
后培养一般加入酪素水解物、酵母膏等富含氨基酸、生长因子、 ATP等，有利于突变体重新调节代谢。
⑶温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响
第三，可大幅度地提高参选量，比常规的筛选提高15~20倍。
三、筛选（初筛）后的工作
1、摇瓶液体培养 2、产物活性的测定 3、摇瓶数据的确认 4、培养基和培养产物耐受性好 的菌株，常用于抗 生素产生菌的筛选。
4）琼脂块法
琼脂块法的优点
琼脂块法比一般直接分离在平皿上判断活性的反应圈要准确。
首先，限制了所有菌落都在同一面积的琼脂块上生长，避免 了相互间的干扰； 其次，每个菌落的产物都在同一体积的琼脂块中，从环境中 摄取的营养是一致的，避免由于扩散不同造成的误差，这样 能较准确地反映每个菌落的生产能力。
二）选择最适诱变剂量
亚热带链霉菌（白霉素）与X射线剂量之间的变异关系
五、影响突变率的因素
1 菌种遗传特性
（有的诱变剂只作用于DNA复制期，有的可作用于各期细胞）
2 菌体细胞壁结构
（有的菌种孢子壁厚、有保护层、均减弱诱变剂的作用效果）
3 培养条件和环境条件 ⑴前培养（诱变前预培养）
第七章 突变株的分离筛选
常见分离筛选方法 1.随机挑选
随机挑选上 百个菌落， 发酵测试。
诱变处理
平板分离
常见分离筛选方法 2.平板菌落预筛
1）根据菌落形态变异筛选。 高产菌株的形态往往处在常态的正常型范围内，又有微 小变异。 2）利用平板生化反应筛选。（见前章）
常见分离筛选方法
前培养一般加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黄、b-重氮尿嘧 啶、嘌呤等物质，能显著提高突变率。若加入氯霉素、胱氨酸等还 原性物质，会使突变率下降。
⑵后培养
后培养一般加入酪素水解物、酵母膏等富含氨基酸、生长因子、 ATP等，有利于突变体重新调节代谢。
⑶温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响
第三，可大幅度地提高参选量，比常规的筛选提高15~20倍。
三、筛选（初筛）后的工作
1、摇瓶液体培养 2、产物活性的测定 3、摇瓶数据的确认 4、培养基和培养产物耐受性好 的菌株，常用于抗 生素产生菌的筛选。
4）琼脂块法
琼脂块法的优点
琼脂块法比一般直接分离在平皿上判断活性的反应圈要准确。
首先，限制了所有菌落都在同一面积的琼脂块上生长，避免 了相互间的干扰； 其次，每个菌落的产物都在同一体积的琼脂块中，从环境中 摄取的营养是一致的，避免由于扩散不同造成的误差，这样 能较准确地反映每个菌落的生产能力。
工业微生物诱变育种幻灯片
5. 1.3 营养缺陷型的检出 方法2：影印法〔见图7.13)
5. 1.3 营养缺陷型的检出 方法3：夹层法〔见图7.14)
5. 1.3 营养缺陷型的检出 方法3：限量补充法 P178
在根本培养基中补充微量营养缺陷型菌株所 不能合成的营养物质，野生型菌株生长快、菌落 大，而营养缺陷型菌株生长慢、菌落小。
补充培养基〔supplemental medium, SM〕：只能满 足相应营养缺陷型菌株生长需要，是在根本培养基中参 加了相应营养缺陷型菌株所不能合成的营养因子。
5.1 营养缺陷型菌株的选育
营养缺陷性突变为〔单一〕基因突变，是 产生某种营养因子的代谢途径中某个关键酶 合成基因突变造成相应酶不能产生或不能发 挥作用，从而造成相应营养因子不能产生 诱发突变 筛选1步：淘汰野生型菌株 筛选2步：检出缺陷类型 筛选3步：鉴别缺陷种类
缺陷型营养因子类别确定后，再用该类营养 因子的各种代表物质纯洁物做试验，以确定其缺 陷哪一种或几种营养因子。可以先把该类物质分 成几组进展测定，逐步缩小范围，最后菌体测定 到种类 (P180) 常用浓度：氨基酸1~10mg/mL;维生素类 0.01~0.1mg/mL 氨基酸和维生素分组分别见P182表7.14和表7.15
方法2：菌丝过滤法
真菌和放线菌等丝状菌的野生型菌株在根本 培养基中产生菌丝体，而营养缺陷型菌株以孢子 形式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液 用液体根本培养基培养，适温振荡培养，使野生 型孢子萌发形成菌丝体，用灭菌脱脂棉、滤纸等 除去菌丝体，再培养，再过滤。重复3～4次，最 大限度地除去野生型菌株，然后再别离
5. 1.4.2 缺陷型鉴定步骤
营养因子类别测定→ 营养因子种类测定→复证试验 步骤1：缺陷型营养因子类别测定：用各类营养因子
工业微生物育种诱变剂
第一章工业微生物育种诱变剂1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。
包括紫外线、X射线、r射线。
快中子。
微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。
（X 射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射）2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。
3辐射作用的时相阶段：物理阶段——直接作用DNA或作用于水物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子化学阶段——产生生物自由基生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:C A:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。
6紫外线的诱变机理及原因？机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体原因：形成嘧啶二聚体7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。
暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。
然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。
8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm9紫外线的剂量以什么计算？绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算）步骤：（1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。
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2、紫外光的剂量
单位:尔格能量/mm2 (灯具发射强度随使用时间延长而下降。) 实际应用-相对剂量：照射时间、杀菌率来表示 杀菌率：90.0%-99.9% 时间：芽孢菌10min；
小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min； 一般营养体3-5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min。
3、诱变机理
照射 ❖ 设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等; ❖ 紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W; ❖处理时的照射距离：20cm — 30cm; ❖ 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过
3mm,照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面， 最好在黄色或红色灯光下操作。
后培养：1.5-2小时；
稀释涂皿
（四）、电离辐射
（五）新型诱变剂
❖ 微波:电磁波 ❖ 红外线：0.75～1000μm ❖ 激光：光量子流 ❖ 高能电子流：强电离辐射 ❖ 航天育种：利用返回式卫星进行农作
物新品种的选育的一种方法。
航椒1号
航茄2号
航 天 葫 芦
6、低能离子注入
过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换
染色体方面的表现: 断裂，形成染色体断片、环、桥等。 染色体畸变率与辐射剂量成正比 染色体畸变率是评价遗传损伤的指标
DNA方面的表现: DNA断裂、分解，形成单链结构 DNA非按时合成 存在自我损伤修复机制，提前进行DNA合成， 进行DNA损伤修复 生长素类物质促进DNA损伤修复 咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复
结合的复合诱变效应
二、化学诱变剂
化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变 其结构，并引起遗传变异的化学物质。
碱基类似物 烷化剂 种类 移码突变剂 其他类
（一）碱基类似物
1、种类
胸
常
腺
用
嘧
啶
的
结
构
类
似
物
腺嘌呤的结构类似物
常 用
鸟嘌呤的结构类似物
2、碱基类似物作用机制
5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶的结构类似物也 是一种强诱变剂。它渗入到DNA中，会发生酮 式和烯醇式互变，不仅和原来的碱基配对而且和 其它碱基配对。
（二）影响辐射效应的因子
①菌种的遗传背景和生理状态； ②可见光； ③水分； ④电离辐射诱变剂在氧气或空气中使用时，其辐
射效应一般要比在真空中或在惰性气体中时要 高； ⑤温度对电离辐射效应也有影响，主要是能改变 氧与自由基，或自由基相互间的作用程度。
（三）非电离辐射——紫外线
1、性质和来源 波长在40一390nm之间。由于DNA分子的紫外 光吸收值为260nm，因而波长在200-300nm的 紫外光才有诱变作用。紫外光源一般要求为发 射光谱集中在260nm附近的紫外光灯，灯管内 装有氖气的低压放电灯是较理想的光源，国内 一般采用30瓦的紫外光灯，光谱分范围广， 诱变效率差。 特点：能量较低；对组织穿透力强.
工业微生物诱变育 种诱变剂(ppt)
优选第五章工业微生物诱变 育种诱变剂
第一节 微生物育种诱变剂
诱变剂是指那些能诱发基因突变、并使 突变率提高到超过自发突变水平的物理或 化学因子。
物理诱变剂
种类
化学诱变剂
生物诱变剂
诱变育种的特点
（1）提高突变率、扩大突变谱。 （2）改良单一性状比较有效，同时改良多
例5-BU诱发A-T变为G-C过程
非电离辐射：电子级能提高，但不产生离子。 电离辐射:能击中电子并产生正离子
（一）物理诱变剂的生物学效应
直接作用
间接作用
击中DNA或其它生物结构引起的能量吸收
物 激发和电离分子 理 物理-化学 重排
原初损伤
化学
分子的变化
环境中其它分子 激发和电离分子
重排 扩散自由基
生 物 突变 学
代谢 突变体
代谢 生物变化
4.2 生理方面的表现
生理方面的表现 ✓酶活性的变化 ✓POD（过氧化物酶）、 SOD 、CAT （过氧 化氢酶）、核酸酶 相关物质含量的变化 蛋白质、氨基酸、核苷酸 生长素、ABA（天然脱落酸）
4.3 遗传方面的表现
细胞核方面的表现: 细胞核扩大、松散（膨松 puffing） 微核细胞，微核细胞率与辐射剂量成正比 微核细胞率是评价遗传损伤的指标
个性状较困难. （3）性状稳定快，育种年限短。 （4）诱发突变的方向和性质尚难掌握。
一、物理诱变剂
物理诱变主要是由于高能辐射导致生物系统损伤， 继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 常可以分为物理、物理-化学、化学、生物学阶段 (p35)。
包括紫外光、x射线、γ射线、快中子、α射线、 β射线和超声波等。其中紫外光沿用最广，诱变 抗生素高产突变株有很优异的效果。
细胞死亡
1、物理阶段 持续时间极短（10-5~10-8秒）。电离辐射产生能 量转移，在体内形成电离效应。
2、化学阶段 持续时间极短（10-5~10-8秒） 。形成大量的自 由基。
3、生物化学阶段 持续时间短（10~10-2秒） 。 大量的自由基与生物大分子发生化学反应，形成大 量的烷化自由基(R.)，将辐射效应转移到生物大分 子中。 烷化自由基持续时间长，并可通过繁殖传递。
嘧啶二聚体 DNA链的断裂 胞嘧啶与尿嘧啶的水和作用 DNA与蛋白质交联
4、操作方法
出发菌株 前培养；培养基丰富营养、细菌培养到
对数期、真菌孢子刚成熟； 制备菌悬液：处理液均用生理盐水制
备。细菌调节菌液浓度到108个/ml，真 菌约为106—107 /ml，放线菌则为l07— 108/ml.
时间：10－19－10－13s中间时发生。 特征：具有Y射线能量沉积引起机体损伤的；
动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质 原子转移、重排或基因的缺失；慢化离子、 移位原子和本底元素复合反应造成的化学损 伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造 成的损伤。
常用离子：通常采用N+、H+、Ar＋。 生物学效应：相当于物理和化学诱变两者相
4、生物学阶段
持续时间长（甚至几个世代）,并可通过繁殖传递。 烷化自由基(R.)与生物大分子发生一系列反应，引 起生理和遗传损伤。 4.1 形态方面的表现 损伤：造成死亡，死亡率与辐射剂量成正比 生长：抑制生长等，与辐射剂量成正比 形态变异：菌落（体）、色泽大小变化。 生理变异：不能遗传，逐渐消失。 遗传变异：能遗传