转基因动物制备方法
转基因动物方法简介
转基因动物方法简介动物转基因办法简介转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。
它是根据预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。
原核显微注射法（原核期细胞：受精卵的两个核未融合时期的细胞）目前最常用的转基因动物生产办法，又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。
其创始人是Jaenisch和Mintz 等。
Gordon等和Palmiter等先后通过此办法获得转基因动物。
此办法目前应用较普遍，现在的转基因动物讨论大都是在Palmiter等办法的基础上有所改进而举行的。
王敏华(1996)报道用显微注射法转移抗瘟病毒核酸酶基因，获得了转基因兔。
KrimPenfort运用体外培养胚胎再施用显微注射法获得了转基因牛这种办法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因。
它可以直接获得纯系（应当也不一定，如上述鱼的状况），所以试验周期短。
但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状转变，重则致死外源基因整合到受体基因组的时机，将打算转基因动物是否发育成嵌合体，如整合发生在第一次卵裂前，即发生在DNA合成的S期，外源基因将随染色体的分别匀称的分布到每一个细胞，得到的转基因动物是纯合体，反之，得到的将是嵌合体。
显微注射转基因的实践证实，受精卵DNA合成的S期是显微注射的相宜时机。
但因为整合需要一段时光，等目的基因整合至染色体后，受精卵早已分裂多次，故很难得到纯合体。
如鱼类在原肠胚早期才开头整合，而此时细胞已多值几千，此时转植基因在每个细胞内的整合状况不行能全都，所以第一代转基因鱼总是嵌合体。
哺乳动物受精卵的单细胞期阶段较长，还有可能得到纯合体的转基因动物。
利用基因编辑技术制备转基因动物的步骤详解
利用基因编辑技术制备转基因动物的步骤详解基因编辑技术是一种革命性的生物技术，可以针对动植物基因组进行精确的改造和编辑。
利用基因编辑技术制备转基因动物的过程可以分为以下几个步骤。
第一步：选择基因编辑工具基因编辑技术最常用的工具是CRISPR-Cas9系统。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的防御机制，通过引入Cas9蛋白和合适的RNA序列，可以将Cas9蛋白导向到特定的目标位点上，由Cas9蛋白的核酸切割活性引发基因组的突变。
第二步：设计目标位点在制备转基因动物之前，需要确定需要编辑的目标基因和位点。
目标基因是指需要进行改造的基因，而目标位点是指基因组中需要敲除、替换或插入外源DNA 的具体位置。
通过分析目标基因的功能和调控机制，可以确定最合适的目标位点。
第三步：合成或构建基因编辑工具一旦确定了目标位点，就需要合成或构建基因编辑工具。
对于CRISPR-Cas9系统来说，需要合成目标位点特异性的RNA序列（sgRNA）并制备Cas9蛋白。
sgRNA的设计应考虑到其与目标位点的特异性配对，以及Cas9蛋白与sgRNA形成稳定复合物的效率。
第四步：基因编辑载体构建将基因编辑工具导入目标细胞需要利用载体进行传递。
载体是一种能够稳定地携带和传递基因编辑工具的DNA分子。
可以利用分子克隆技术构建适合目标细胞和目标基因编辑的载体。
第五步：转染或注射基因编辑载体将构建好的基因编辑载体转染或注射至目标细胞或受精卵。
其中转染是将载体通过化学物质或物理手段导入目标细胞，而注射则是直接将载体注入受精卵的质量或染色体。
第六步：筛选和验证编辑结果将转染或注射后的细胞或胚胎进行培养或转植至合适的宿主动物体内，随后通过对细胞或胚胎的分析，筛选出已经发生基因编辑的个体。
常用的筛选方法包括PCR、测序、蛋白质分析等。
第七步：繁殖和鉴定转基因动物成功筛选出发生基因编辑的个体后，需要进行进一步繁殖和鉴定。
通过鉴定转基因动物是否将所需编辑传递给其后代，可以确定基因编辑是否遗传稳定。
转基因动物制备方法
收稿日期：2018-07-07基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08006002-006、2016ZX08006001-005），湖北省农业科技创新中心资助项目（2018-620-004-001）作者简介：华再东(1978-)，男，贵州省盘州市人，博士，从事动物繁殖生物技术研究*通讯作者：郑新民，E-mail：anbit20@转基因动物制备方法华再东任红艳郑新民*(1动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,湖北武汉430064;2湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉430064)摘要:动物转基因技术是通过将外源性目的基因整合到动物染色体上,使其在体内整合和表达,获得表达外源基因动物的技术。
该技术广泛应用于转基因动物育种、基因功能研究、药用蛋白生产和器官移植等方面。
其主要方法包括逆转录病毒感染法、显微注射法、体细胞核移植法、胚胎干细胞介导法、精子介导法等。
本文旨在对动物转基因的各种技术和方法进行综述,甄别各自的优缺点,为科研工作者提供一定的参考。
关键词:转基因;动物;技术中图分类号:S813.3文献标识码:A文章编号:1673-4645(2018)11-0022-04转基因技术是分子生物学技术的拓展，是现代探索生命科学奥秘的有效工具，是推动人类社会进步的伟大技术。
就目前形势来看，转基因技术已经渗透到我们生活的各个方面，如疾病治疗、疫苗生产、制药、环境卫生、农作物、食品加工等多个领域，具有很好的经济价值和社会意义。
就制备历程来看，动物转基因技术发展主要经历了采用显微注射法及病毒载体法制备转基因动物和基于体细胞克隆为核心技术制备转基因家畜。
关于动物的转基因方法，最早是利用胚胎感染反转录病毒进行基因的转移，获得了世界首例转基因动物。
之后通过显微操作将外源基因注射到小鼠胚胎，获得了转基因小鼠。
1982The Transgenic Preparation Methods of AnimalHUA ZaidongREN Hongyan ZHENG Xinmin（1Hubei Key Laboratory of Animal Em-bryo Engineering and Molecular Breeding,Wuhan 430064,China;2Institute of Animal Husbandryand Veterinary Research,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)Abstract:Animal transgenic technology is the technology to obtain transgenic animal which expresses exogenous genes through inte-grating exogenous genes into chromosome genome of animals.The technology has been widely applied in the transgenic animals breeding,gene function analysis,pharmaceutical protein production,organ transplantation,and so on.Animal transgenic technologies include retrovirus infection,microinjection,somatic cell nuclear transfer,sperm vector,et al.This review aimed to introduce these tech-nologies and compare their advantages and disadvantages.These technologies are the references for scientific researchers.Key words:transgenic;animal;technology图1显微注射制备转基因小鼠示意图年，Palmiter 等[1]将含有大鼠生长激素的结构基因与小鼠的金属硫-Ⅰ基因启动子相连，再利用显微注射技术将融合后的DNA 片段注射到小鼠卵的原核中，最后成功制备了著名的“超级小鼠”，加速了动物生长方式的研究，为人类研究遗传疾病和巨人症建立了动物模型。
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。
将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。
转基因动物的技术方法
转基因动物的技术方法根据外源基因导入的方法和对象的不同，转基因动物的技术方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）法、电脉冲法、精子载体导入法等。
1、显微注射是最常用且成功率较高的方法。
基因显微注射法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达lOOkb（10万个碱基对）。
它可直接获得纯系，所以实验周期短。
但需要贵重精密仪器，技术操作难度大，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。
2、反转录病毒感染法该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。
由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响活性和稳定。
此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达。
3、胚胎干细胞法胚胎干细胞（ES细胞）指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育全能性，能进行体外培养；扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。
本法外源基因整合率高，植入囊胚前筛选合适的转化的ES细胞，克服了以前只能在子代选择的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是很有前途的技术。
缺点是不易建立ES细胞系。
并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。
4、电脉冲法电脉冲法（electroporation）又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜进入细胞，运送到细胞核。
5、精子导入法利用精子作为外源基因载体，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中，称之为精子载体导入法，是构建转基因动物的一种新尝试。
该法简单、方便，依靠生理受带过程，免去了对原核的损伤。
但在实践中成功率较低，对于精子是否可作为外源DNA 载体也存在争论。
转基因动物的制备原理,应用领域及存在的问题
1、转基因动物的制备原理，应用领域及存在的问题制备原理：是将改建后的目的基因用显微注射等方法注入实验动物的生殖细胞(或者床前胚胎细胞),然后将此受精卵(或者床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中,使其发育成携有外源基因的转基因动物。
应用领域：1、生产药用如：蛋白国际上首批转基因动物乳腺表达产品是抗凝血酶，葡萄糖苷酶以及第八凝血因子（1H）等。
我国科学家把乙肝病毒表面抗原基因注入家兔的受精卵中，获得了表达。
将能够控制产卵率的促卵素（+99B99@D）基因导入动物体内，有可能培育出具有高产卵率特性的转基因家畜。
2、动物抗病育种利用转基因技术有可能在较短时间内培育出常规方法不能或需长期培育才能育成的品种或种群。
如R9A786DBE等（(55S）将人的补体抑制因子——衰退加速因子，转移至猪胚中，有PQ头转基因猪表达。
3、改良动物生产性能Pursel等曾把牛的生长激素基因转入猪，其生长速度提高11%~14%；美国科学家培育的转基因鲁鱼可增产20%~40%4、作为人类器官移植的供体猪在解剖、组织及生理等方面与人类最为相近，其器官与人的器官大小相仿，并且容易饲养。
Ro sengard(1995)将人的补体抑制因子——衰退加速因子(hDA F)转移至猪胚中，有27头转基因猪表达hDA F。
存在的问题：转基因动物技术存在的主要问题是转基因动物成活率低，外源基因在宿主细胞组中的整合率很低，且外源基因的整合位点不可控制，已整合的外源基因很容易从宿主基因中消失，遗传给后代的概率也较低，外源基因有时不能表达或表达混乱，得不到预期的表型效应，且容易引起动物异常。
另外，转基因动物产品安全性问题及法规制定尚处于探索阶段。
2、《实验动物学与动物实验技术》在生物医学研究领域的地位与发展前景。
地位：1、实验动物学与动物实验技术是生物医学研究的重要基础实验动物和动物实验是医学研究的重要基础和手段。
在生物医学研究领域内，目前公认“AEIR”是进行生物医学突验研究所必需的四个基本条件。
转基因动物的制作方法
转基因动物的制作方法转基因动物啊，这可是个挺神奇的领域呢！要制作转基因动物，就好像是在给动物的生命之书进行改写。
咱先来说说最常见的一种方法吧，那就是显微注射法。
这就好比是一个超级精细的手术，科学家们要把含有特定基因的DNA片段，小心翼翼地注射到动物的受精卵里。
想象一下，那小小的受精卵就像是一个等待被雕琢的艺术品，而科学家就是那个技艺高超的雕刻师，要精准地把新的基因放进去，这可不是一般人能做到的呀！这过程得多小心，多细致啊，稍微有点偏差，可能就前功尽弃啦。
还有一种方法叫体细胞核移植法。
这就好像是给动物来了一次“换核大变身”。
把含有目的基因的细胞核取出来，放到另一个去掉细胞核的卵细胞里，然后让这个新的组合发育成一个完整的个体。
这多神奇啊，就像是给动物来了一次彻底的改造，让它拥有了原本没有的特性。
另外呢，还有基因编辑技术。
这就像是有一把神奇的剪刀，可以在动物的基因上精准地进行剪切和粘贴。
把不好的基因剪掉，把好的基因放进去，让动物变得更符合我们的期望。
不过啊，制作转基因动物可不是随随便便就能成功的。
这需要大量的实验和研究，需要科学家们花费无数的时间和精力。
而且，这中间还可能会遇到各种各样的问题和挑战呢。
就说那注射的过程吧，稍有不慎可能就会损伤到受精卵，那可就全白费啦。
还有啊，转基因动物也会引发一些争议呢。
有人会担心它们会不会对环境造成影响，会不会带来一些意想不到的后果。
这就像是打开了一个潘多拉的盒子，谁也不知道里面到底会跑出什么东西来。
但是呢，咱也不能因为有争议就不研究啦。
转基因动物在很多方面还是有很大用处的呀。
比如说在医学研究上，可以用它们来模拟人类的疾病，帮助我们找到更好的治疗方法。
在农业上，也可以让动物长得更快、更健康，为我们提供更多的食物。
总之呢，转基因动物的制作方法是一门高深的学问，需要科学家们不断地探索和创新。
虽然有挑战和争议，但也有着无限的可能。
我们要以一种开放和谨慎的态度来看待这个领域，让它为我们的生活带来更多的好处。
制备转基因动物的方法
制备转基因动物的方法制备转基因动物的方法有很多，以下是一些常见的方法：1. 显微注射法：这是最早的动物转基因技术，通过显微镜将目的基因注射到受精卵细胞的原核内，使目的基因与胚胎基因组融合。
该方法的优点是可靠性高、重复性好、整合效率高，导入基因片段的大小和类型不受限制，转基因可以稳定遗传。
但缺点是导入基因整合的随机性和不可见性可能导致基因表达不稳定和插入突变。
成功应用该方法的例子包括美国科学家Hammer等在1985年获得的转基因兔、绵羊和猪，以及我国朱作言院士等在1985年成功获得的世界上首例转基因鱼。
2. 精子载体法：将精子与目的DNA进行预培养，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，再让精子与卵子结合，该基因被整合到受精卵的DNA中。
该方法的优点是不需要显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。
但成功率不高、效果不稳定，有待科研人员进一步探索和改进。
成功应用该方法的例子包括1989年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠，以及1996年意大利Sperandio科研小组报道的采用该方法生产转基因牛和猪。
3. 逆转录病毒感染法：利用逆转录病毒作为载体，将目的基因整合到受体细胞的DNA中。
该方法的优点是效率高、操作简单、成本低，在转基因动物生产中应用广泛。
但缺点是插入突变的可能性大、外源基因表达量不稳定。
4. 胚胎干细胞介导法：将目的基因导入胚胎干细胞，通过将胚胎干细胞注入受体胚胎以生产转基因动物。
该方法的优点是整合效率高、可遗传给后代、可进行种间转基因操作等。
但缺点是技术难度高、操作复杂、胚胎干细胞建系不易等。
5. 细胞核移植法：通过将已转染的外源基因的体细胞核移植到受体细胞的卵母细胞中，以生产转基因动物。
该方法的优点是可获得转基因动物的高纯合子、可进行种间转基因操作等。
但缺点是技术难度高、操作复杂、成功率低等。
这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备显微注射法这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管，使胚胎在养母体发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。
也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。
表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。
亦可取胚胎进行分析。
显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。
我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。
基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的胚团（inner cell mass）中分离出来的。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。
这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。
正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。
Cre转基因小鼠制备技术方法
Cre转基因小鼠制备技术方法
Cre酶是在噬菌体内发现的一种酶，它能特异性的识别LoxP序列，并把同方向排列的两个LoxP序列之间的DNA切掉。
前面说了，我们把LoxP序列放到了打算敲除基因的两侧，那么我们如果把Cre酶放到细胞核里，目的基因就被Cre酶切掉，从而实现目的基因敲除了。
于是人们制作了能够表达Cre酶的转基因小鼠。
把Cre转基因小鼠和插入了LoxP序列的小鼠交配，就可以得到同时携带Cre和LoxP序列的小鼠了。
当Cre在细胞核内遇见LoxP序列，目的基因就被敲除了。
想控制在哪个细胞或者什么时间敲除目的基因，只要控制Cre酶就可以了。
制作Cre转基因小鼠时在Cre酶前面放上特异性的启动子，那么Cre酶就在该启动子表达的细胞或组织内表达，这样就只有这个组织或细胞内的目的基因被敲除。
时间上控制基因敲除的方法更为巧妙。
人们修饰了Cre酶基因，修饰后的Cre基因可以转录为mRNA，也可以在核糖体上翻译为蛋白质。
但是这种蛋白没有穿过细胞核膜的能力，也就无法进入细胞核发挥切割DNA序列的功能。
当人们外源性给予药物他莫昔芬（tamoxifen，缩写TM，是雌激素类似物）后，修饰的Cre酶就会获得穿过细胞核膜的能力。
于是Cre进入细胞核，与基因组相遇，切割掉LoxP之间的序列。
于是人们实现了什么时候给药，什么时间敲除基因（当然得给Cre 一点时间穿过细胞核膜）。
需要注意的是，Cre是一种酶，那么和所有酶一样，它的作用效果不会是百分之百的。
也许100个细胞里表达了Cre，大约70个细胞内的基因被敲除。
精子介导法制备转基因兔
精子介导法制备转基因兔摘要：转基因动物已成为生物学界科学家们研究的热点，转基因成果也在社会的各个领域有着不同程度的应用，然而传统的转基因技术有着步骤繁琐、技术要求高、转导率低和成本高等特点；本实验采用精子介导法制备转基因动物，具有高效、简便、成本低、易于筛选等特点。
本实验首先采用分子克隆法制备含有绿色荧光基因的转基因高效载体，然后用睾丸注射法将转基因载体导入成年雄性兔睾丸，最后让公兔和母兔进行交配，待母兔分娩后检测兔仔中是否含有绿色荧光蛋白。
实验结果：由于季节和饲养条件等方面的原因，母兔还未受孕分娩所以还未进行检测。
关键词：转基因动物精子介导法分子克隆睾丸注射Research of Sperm Mediated Method for GeneticallyModified RabbitAbstract：Genetically modified animal has become a focus of research scientists in biology community ,genetically modified achievements have different degrees of application in the various sectors of society. However, the traditional transgenic technology has steps trival, high technical requirements, low transduction rate, high cost ,ect; This experiment used sperm mediated method to cultivate genetically modified animal, which is simple and effective, low cost, easy to screening ,etc. First, this experiment used molecular cloning method to create genetically modified efficient carrier with green fluorescent genes, then took the testicular injection method to inject transgenic carrier to adult male rabbit testicular, finally let the male and female rabbit mating, wait for the mother rabbit’s delivery, check the rabbit sons to see whether they contain green fluorescent proteins. Result of the experiment: because of the season,raise conditions and other reasons, the mother rabbit is not pregnant so there is no childbirth for testing.Keywords:transgenic animals sperm mediated method molecular cloning testicular injection1 引言随着科技的发展，转基因动物已成为生物学界研究的热点，它的研究成果也被应用于我们生产生活的各个领域。
转基因动物的原理高中生物
转基因动物的原理高中生物
转基因动物是通过对动物的基因进行改造，使其表达出具有特定功能或特征的基因。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：根据需要，选择与特定功能或特征相关的基因作为目标基因。
2. 提取目标基因：从其他生物或同一物种中提取出目标基因的DNA序列。
3. 构建表达载体：将提取得到的目标基因与适当的表达载体进行重组。
表达载体通常包括启动子、终止子等元件，有助于使目标基因在转基因动物体内正常工作。
4. 转基因动物的制备：将构建好的表达载体经过一系列的生物学技术（如电穿孔、注射、胚胎移植等）导入到动物的体细胞或胚胎中。
5. 转基因动物的筛选：选取经过基因导入的动物体细胞或胚胎，通过PCR、酶切等分子生物学方法，检测是否成功导入目标基因。
6. 转基因动物的繁殖和进一步研究：经过筛选后，转基因动物可以进行繁殖并获得后代。
通过对转基因动物的繁殖后代进行观察和研究，可以了解目标基因对动物的功能或特征的影响。
总之，转基因动物的制备原理主要包括提取目标基因、构建表达载体、导入到动物体细胞或胚胎中、筛选成功导入基因的细胞或胚胎以及对转基因动物后代进行研究等步骤。
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缺点：
容纳大小有限； 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响 外源基因的表达。
2. 5 体细胞核移植转基因法
• 近年来新出现的一种转基因技术。克隆绵羊 “多 莉(Dolly)” 的诞生是转基因动物史上的一个里程碑。
• 先把外源基因与供体细胞在培养基中培养 ,使外源 基因整合到供体细胞上 ,然后将供体细胞的细胞核 转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎 ,再把其移植 到假孕母体 ,待其妊娠、 分娩后便可得到转基因 的克隆动物。
1984年，Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为 成体的各种组织，并整合入生殖系。 意义：里程碑，与同源重组技术的结合使得在整体水平 定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。 1995年，Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞； 1998年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞； 2000年，Bongso等建立了人的ES细胞株
体。
•
将目的基因整合到逆转录病毒的 RNA 载体
上 ,制成高滴度的病毒颗粒 ,人为感染着床前或着
床后的胚胎 ,RNA 病毒感染宿主细胞后反转录成
相应的DNA ,并在整合酶和其末端特殊核酸序列的
作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗
传得到转基因动物。
与显微注射法的比较
优点：
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存 活率高。
• 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、 医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的 开发研究等多方面做出了很大的贡献。
Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和 SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导 入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源 DNA 顺序的TGM 。
1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
……
优点：
外源基因整合情况的可控性高。
可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、 定位、表达的水平及插入的稳定性。
外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴 定及筛选方便。
缺点：
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
2. 4 逆转录病毒感染法
•
逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载
优点：
外源DNA大小基本不受限制(1-50kb) 导入过程直观 整合率高
缺点：
设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默
2. 2 精子载体介导法
• 将精子反复冷冻或经过化学物质处理后 与外源 DNA 共同孵育 ,从而使外源DNA 与 精子结合 ,然后通过人工授精得到转基因个 体
有分化成3种胚层的发育潜能。
•
通过一定的方法将外源基因导入到 ES ,外源
基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到 ES
基因组中 ,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细
胞植入正常发育的囊胚中 ,然后将囊胚移植到受体
动物的子宫内 ,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系
的发育 ,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分
2. 3 胚胎干细胞介导法
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干细胞（stem cells）：是细胞谱系分化中最
原始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能，
能增殖分化为特定的组织细胞。
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胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）：
从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞，具有
在体外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具
到目前为止，人类已获得转基因鱼、 鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。
从转基因动物所获得的资料几乎涉及医 学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研 究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的 开发研究等。来自2 转基因动物的制备方法
2. 1 显微注射法
• 也称原核显微注射法 ，是发展最早、使用最为 广泛的转基因方法之一。
• 目前国际上极少成功模型，国内也很少 有相关报道，精子载体法很少被应用。
体外受精法 & 胞质内显微注射法
• 体外受精法是一种直接用精子作为外源 DNA 载体的转基因方法 ,其过程是将成熟的 精子与外源 DNA 进行预培养 ,因为在一定 条件下 ,精子核后帽区有自发结合 DNA 的 能力 ,因此 ,精子能够携带外源 DNA进入受 精卵 ,并使之受精 ,从而使外源 DNA 整合到 受体染色体中而得到转基因动物。
细胞含有目的基因 ,将嵌合体连续与正常动物进行
交配 ,就会得到转基因动物。
ES细胞技术发展历史
1956年，Whitten培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚； 1958年，McLaren经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体； 1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培养技术； 1968年，Gardner将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠; 1970年，Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞； 1981年， Martin Evans 从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞；
• 转基因动物自产生以来 ,随着研究的不 断深入 ,近些年来得到了迅速的发展。由于 它打破了自然繁殖中的种间隔离 ,使基因能 在种系关系很远的机体间流动 ,实现了动物 种间遗传物质的交换与重组 ,这不仅为遗传 物质的研究提供了新的手段 ,丰富了物种的 基因库 ,而且扩大了生命科学的视野。
• 转基因动物是动物基因工程在医学生物 学研究中的突出成果。
• 利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动 物的受精卵中，注射的外源基因与胚胎基因组融 合，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受 精卵移植到受体子宫内发育，这样分娩的动物体 内的每一个细胞都含有外源 DNA 片段。
以使用较多的小鼠为例，这一方法的实 验程序如下：
• ⑴ 准备假孕母鼠（养母） • ⑵ 受精卵的准备 • ⑶ 基因导入 • ⑷ 胚胎移植 • ⑸ 对幼鼠的鉴定
转基因动物的制备方法
小组成员：李道琪 李浩云 李 会娟 李佳宁
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1 转基因动物的概念
转基因动物就是指用试验的方法将人 们所需要的外源基因导入到动物体内 ,使 这种外源基因与动物本身的染色体整合在 一起 ,这样外源基因就能随着细胞的分裂 而增殖 ,在动物体内得到表达 ,并且能够稳 定遗传给后代的动物。