转基因动物制备方法
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……
优点:
外源基因整合情况的可控性高。
可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、 定位、表达的水平及插入的稳定性。
外源基因导入ES细胞的方法多样,细胞鉴 定及筛选方便。
缺点:
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
2. 4 逆转录病毒感染法
•
逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载
• 利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动 物的受精卵中,注射的外源基因与胚胎基因组融 合,再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受 精卵移植到受体子宫内发育,这样分娩的动物体 内的每一个细胞都含有外源 DNA 片段。
以使用较多的小鼠为例,这一方法的实 验程序如下:
• ⑴ 准备假孕母鼠(养母) • ⑵ 受精卵的准备 • ⑶ 基因导入 • ⑷ 胚胎移植 • ⑸ 对幼鼠的鉴定
转基因动物的制备方法
小组成员:李道琪 李浩云 李 会娟 李佳宁
•
1 转基因动物的概念
转基因动物就是指用试验的方法将人 们所需要的外源基因导入到动物体内 ,使 这种外源基因与动物本身的染色体整合在 一起 ,这样外源基因就能随着细胞的分裂 而增殖 ,在动物体内得到表达 ,并且能够稳 定遗传给后代的动物。
• 转基因动物自产生以来 ,随着研究的不 断深入 ,近些年来得到了迅速的发展。由于 它打破了自然繁殖中的种间隔离 ,使基因能 在种系关系很远的机体间流动 ,实现了动物 种间遗传物质的交换与重组 ,这不仅为遗传 物质的研究提供了新的手段 ,丰富了物种的 基因库 ,而且扩大了生命科学的视野。
• 转基因动物是动物基因工程在医学生物 学研究中的突出成果。
到目前为止,人类已获得转基因鱼、 鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。
从转基因动物所获得的资料几乎涉及医 学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研 究,还涉及生物药物的研究,基因治疗的 开发研究等。
2 转基因动物的制备方法
2. 1 显微注射法
• 也称原核显微注射法 ,是发展最早、使用最为 广泛的转基因方法之一。
• 近十年来,为分子遗传学、发育生物学、 医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的 开发研究等多方面做出了很大的贡献。
Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和 SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导 入小鼠受精卵的雄原核内,得到了带有这种外源 DNA 顺序的TGM 。
1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
1984年,Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为 成体的各种组织,并整合入生殖系。 意义:里程碑,与同源重组技术的结合使得在整体水平 定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。 1995年,Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞; 1998年,Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞; 2000年,Bongso等建立了人的ES细胞株
缺点:
容纳大小有限; 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化,影响 外源基因的表达。
2. 5 体细胞核移植转基因法
• 近年来新出现的一种转基因技术。克隆绵羊 “多 莉(Dolly)” 的诞生是转基因动物史上的一个里程碑。
• 先把外源基因与供体细胞在培养基中培养 ,使外源 基因整合到供体细胞上 ,然后将供体细胞的细胞核 转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎 ,再把其移植 到假孕母体 ,待其妊娠、 分娩后便可得到转基因 的克隆动物。
有分化成3种胚层的发育潜能。
•
通过一定的方法将外源基因导入到 ES ,外源
基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到 ES
基因组中 ,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细
胞植入正常发育的囊胚中 ,然后将囊胚移植到受体
动物的子宫内 ,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系
的发育 ,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分
• 目前国际上极少成功模型,国内也很少 有相关报道,精子载体法很少被应用。
体外受精法 & 胞质内显微注射法
• 体外受精法是一种直接用精子作为外源 DNA 载体的转基因方法 ,其过程是将成熟的 精子与外源 DNA 进行预培养 ,因为在一定 条件下 ,精子核后帽区有自发结合 DNA 的 能力 ,因此 ,精子能够携带外源 DNA进入受 精卵 ,并使之受精 ,从而使外源 DNA 整合到 受体染色体中而得到转基因动物。
体。
•
将目的基因整合到逆转录病毒的 RNA 载体
上 ,制成高滴度的病毒颗粒 ,人为感染着床前或着
床后的胚胎 ,RNA 病毒感染宿主细胞后反转录成
相应的DNA ,并在整合酶和其末端特殊核酸序列的
作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗
传得ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ转基因动物。
与显微注射法的比较
优点:
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单,避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎,感染率及胚胎存 活率高。
细胞含有目的基因 ,将嵌合体连续与正常动物进行
交配 ,就会得到转基因动物。
ES细胞技术发展历史
1956年,Whitten培养成功小鼠的受精卵,在体外发育成囊胚; 1958年,McLaren经胚胎移植,体外培养的胚胎产生小鼠个体; 1965年,Brinster建立了胚胎的微滴培养技术; 1968年,Gardner将分离的细胞注入囊胚,获得嵌合鼠; 1970年,Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞; 1981年, Martin Evans 从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞;
优点:
外源DNA大小基本不受限制(1-50kb) 导入过程直观 整合率高
缺点:
设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率(尤其是大家畜) 对卵子伤害大,胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默
2. 2 精子载体介导法
• 将精子反复冷冻或经过化学物质处理后 与外源 DNA 共同孵育 ,从而使外源DNA 与 精子结合 ,然后通过人工授精得到转基因个 体
2. 3 胚胎干细胞介导法
•
干细胞(stem cells):是细胞谱系分化中最
原始的细胞,能终身自我更新,并具有多分化潜能,
能增殖分化为特定的组织细胞。
•
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES):
从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞,具有
在体外不分化的增殖能力,经体外长期培养后仍具
优点:
外源基因整合情况的可控性高。
可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、 定位、表达的水平及插入的稳定性。
外源基因导入ES细胞的方法多样,细胞鉴 定及筛选方便。
缺点:
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
2. 4 逆转录病毒感染法
•
逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载
• 利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动 物的受精卵中,注射的外源基因与胚胎基因组融 合,再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受 精卵移植到受体子宫内发育,这样分娩的动物体 内的每一个细胞都含有外源 DNA 片段。
以使用较多的小鼠为例,这一方法的实 验程序如下:
• ⑴ 准备假孕母鼠(养母) • ⑵ 受精卵的准备 • ⑶ 基因导入 • ⑷ 胚胎移植 • ⑸ 对幼鼠的鉴定
转基因动物的制备方法
小组成员:李道琪 李浩云 李 会娟 李佳宁
•
1 转基因动物的概念
转基因动物就是指用试验的方法将人 们所需要的外源基因导入到动物体内 ,使 这种外源基因与动物本身的染色体整合在 一起 ,这样外源基因就能随着细胞的分裂 而增殖 ,在动物体内得到表达 ,并且能够稳 定遗传给后代的动物。
• 转基因动物自产生以来 ,随着研究的不 断深入 ,近些年来得到了迅速的发展。由于 它打破了自然繁殖中的种间隔离 ,使基因能 在种系关系很远的机体间流动 ,实现了动物 种间遗传物质的交换与重组 ,这不仅为遗传 物质的研究提供了新的手段 ,丰富了物种的 基因库 ,而且扩大了生命科学的视野。
• 转基因动物是动物基因工程在医学生物 学研究中的突出成果。
到目前为止,人类已获得转基因鱼、 鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。
从转基因动物所获得的资料几乎涉及医 学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研 究,还涉及生物药物的研究,基因治疗的 开发研究等。
2 转基因动物的制备方法
2. 1 显微注射法
• 也称原核显微注射法 ,是发展最早、使用最为 广泛的转基因方法之一。
• 近十年来,为分子遗传学、发育生物学、 医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的 开发研究等多方面做出了很大的贡献。
Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和 SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导 入小鼠受精卵的雄原核内,得到了带有这种外源 DNA 顺序的TGM 。
1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
1984年,Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为 成体的各种组织,并整合入生殖系。 意义:里程碑,与同源重组技术的结合使得在整体水平 定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。 1995年,Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞; 1998年,Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞; 2000年,Bongso等建立了人的ES细胞株
缺点:
容纳大小有限; 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化,影响 外源基因的表达。
2. 5 体细胞核移植转基因法
• 近年来新出现的一种转基因技术。克隆绵羊 “多 莉(Dolly)” 的诞生是转基因动物史上的一个里程碑。
• 先把外源基因与供体细胞在培养基中培养 ,使外源 基因整合到供体细胞上 ,然后将供体细胞的细胞核 转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎 ,再把其移植 到假孕母体 ,待其妊娠、 分娩后便可得到转基因 的克隆动物。
有分化成3种胚层的发育潜能。
•
通过一定的方法将外源基因导入到 ES ,外源
基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到 ES
基因组中 ,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细
胞植入正常发育的囊胚中 ,然后将囊胚移植到受体
动物的子宫内 ,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系
的发育 ,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分
• 目前国际上极少成功模型,国内也很少 有相关报道,精子载体法很少被应用。
体外受精法 & 胞质内显微注射法
• 体外受精法是一种直接用精子作为外源 DNA 载体的转基因方法 ,其过程是将成熟的 精子与外源 DNA 进行预培养 ,因为在一定 条件下 ,精子核后帽区有自发结合 DNA 的 能力 ,因此 ,精子能够携带外源 DNA进入受 精卵 ,并使之受精 ,从而使外源 DNA 整合到 受体染色体中而得到转基因动物。
体。
•
将目的基因整合到逆转录病毒的 RNA 载体
上 ,制成高滴度的病毒颗粒 ,人为感染着床前或着
床后的胚胎 ,RNA 病毒感染宿主细胞后反转录成
相应的DNA ,并在整合酶和其末端特殊核酸序列的
作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗
传得ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ转基因动物。
与显微注射法的比较
优点:
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单,避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎,感染率及胚胎存 活率高。
细胞含有目的基因 ,将嵌合体连续与正常动物进行
交配 ,就会得到转基因动物。
ES细胞技术发展历史
1956年,Whitten培养成功小鼠的受精卵,在体外发育成囊胚; 1958年,McLaren经胚胎移植,体外培养的胚胎产生小鼠个体; 1965年,Brinster建立了胚胎的微滴培养技术; 1968年,Gardner将分离的细胞注入囊胚,获得嵌合鼠; 1970年,Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞; 1981年, Martin Evans 从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞;
优点:
外源DNA大小基本不受限制(1-50kb) 导入过程直观 整合率高
缺点:
设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率(尤其是大家畜) 对卵子伤害大,胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默
2. 2 精子载体介导法
• 将精子反复冷冻或经过化学物质处理后 与外源 DNA 共同孵育 ,从而使外源DNA 与 精子结合 ,然后通过人工授精得到转基因个 体
2. 3 胚胎干细胞介导法
•
干细胞(stem cells):是细胞谱系分化中最
原始的细胞,能终身自我更新,并具有多分化潜能,
能增殖分化为特定的组织细胞。
•
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES):
从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞,具有
在体外不分化的增殖能力,经体外长期培养后仍具