SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAG电泳标准操作规程（网上）
3. 程序:
端平齐。

放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

3.1.2分离胶的配置
3.122 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板
梳齿下缘约1cm）。

3.1 . 2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。

静置约30min观察胶面
变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸
吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置
混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内（分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。

约30分钟，聚合完全。

3.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。

两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹
形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。

将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与
贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。

倒入1X tris-gly 电泳缓冲液。

3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 pl的样品，依次加上20Q 5x buffer （加了B-巯基乙醇），混匀。

对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （加了B-巯基乙醇）煮沸10分钟。

3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10 p l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加
入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。

电压调至约150v保持恒压。

待溴酚蓝标记移
动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。

3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时,
完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

3.4. 脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间
约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

3.5. 拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到
扫描仪上，拍照。

4. 注意事项
4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。

一般为100KD-50KD选用10%交；50KD-30KD选用12%胶；
30KD-10KD选用15%交。

4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。

每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。

4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。

4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。

4.6 分离胶高度控制得当，确保
有大约1cm左右的浓缩胶空间。

过长或过短均不能得到理想的电泳结果。

4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，
一般可重复使用2-3次。

4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过
快，影响倒胶。

采用垂直式电泳槽装置
1、安装电泳槽
混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平。

（凝胶完全聚合需30-60min ）。

将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。

5、样品处理：将样品加入等量的2XSDS上样缓冲液，100C加热3-5min , 12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE
分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。

6、上样：取10』诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20山低分子量蛋白Marker作对照。

7、电泳：在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝行至电
泳槽下端停止（约需2-3h ）。

&染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。

9、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

10、凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

注意事项：
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。

室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

周师姐试剂配制：
30%丙烯酰胺(29:1)配制：称取Acrylamide 29 g 、Bisacrylamide 1 g ，加入约60 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。

加去离子水将溶液定容至100 mL ,用0.45um滤膜滤去杂质，于中4C避光保存。

5灯ris-Glycine 电泳缓冲液的配制：称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中，加入约800 mL 的去离子水，搅拌溶解；加去离子水将溶液定容至 1 L 后，室温保存。

10 %过硫酸胺(AP)的配制：称取过硫酸胺0.1 g溶于1.0 mL灭菌的去离子水中，充分混匀后于4 C避光保存，保存
时间不能超过 1 周。

10 % SDS的配制：称取SDS 10 g溶于100 mL灭菌的去离子水中并于50C水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存
中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

1.5mol/L Tris-HCI(pH8.8):称取Tris-base 45.43 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至
8.8, 最后用去离子水定容至250 mL,室温下保存。

0.5moI/L Tris-HCI(pH6.8):称取Tris-base 15.14 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至
6.8, 最后用去离子水定容至250 mL ,室温下保存。

12 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺4 mL、去离子水3.3 mL、1.5moI/L Tris-HCI(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100
pL、10 % SDS 100丄和TEMED 5山充分混匀后灌胶。

15 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺5 mL、去离子水2.3 mL、1.5moI/L Tris-HCI(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100
pL、10 % SDS 100丄和TEMED 5山充分混匀后灌胶。

5 % SDS-PAGE 浓胶：30%丙烯酰胺0.5 mL、去离子水2.1 mL、0.5moI/L Tris-HCI(pH6.8)0.375 mL、10 % AP 30
p L、10 % SDS 30 p L 和TEMED 5 p L 充分混匀后灌胶。

考马斯亮蓝染色液的配制：称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取250 mL异丙醇加入上述烧杯中,搅拌溶解；加入100 mL 的冰醋酸,搅拌均匀；加入650 mL 去离子水,搅拌均匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存备用。

脱色液的配制：量取冰醋酸100 mL、乙醇50 mL,加去离子水定溶至1L,搅拌均匀，室温保存备用。

转移缓冲液的配制：称取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7.2 g,加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；加入100 mL 甲醇，最后用去离子水定容至500 mL ,室温下保存备用。

洗膜缓冲液(TBST)的配制：称取NaCI 8.8 g、Tris-base 2.42 g,向烧杯中加入约800 mL去离子水，充分搅拌溶解；
用 1 M HCI 将溶液的pH 值调至7.5,加入0.5 mL Tween 20 后充分混匀；加去离子水将溶液定容至 1 L 后，于4 C 保存备用。

封闭缓冲液的配制：称取0.5 g脱脂奶粉溶于10 mL TBST缓冲液中，充分混匀后备用。

0.1 M甘氨酸缓冲液配制：称取0.75 g甘氨酸加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至2.5，用去离子水定容至100mL后用0.22 m微孔虑膜过滤除菌后，将其分装并于 4 °C保存备用。

1 M Tris-HCI缓冲液的配制：称取12.1g Tris-base,加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至7.5，用
去离子水定容至100mL 备用。

银染固定液：30 % 的乙醇，10%的乙酸。

银染氧化液：称取0.7 g高碘酸溶于100 mL去离子水，充分混匀备用。

银染显色液：浓度为0.005 g/L 的柠檬酸，0.02 %的甲醛。

银氨溶液：浓度为0.67 % 的硝酸银，0.33 %的氨水，0.8 g/L 的NaOH。