细胞培养常见问题及其解决
细胞培养污染拯救及预防方法
细胞培养污染拯救及预防方法概论污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
(一)污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
丝状菌污染3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
阳性阴性支原体污染4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：问题1培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2培养液。
加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题4：培养细胞不贴壁可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
细胞培养中的细胞生长受阻原因分析
细胞培养中的细胞生长受阻原因分析细胞培养是一项重要的生物学实验技术，通过在体外模拟和控制细胞的生长环境，可以对细胞的生理和病理过程做出研究。
然而，经常会遇到细胞生长受阻的情况，这会给实验结果带来负面影响。
本文将对细胞培养中细胞生长受阻的原因进行分析。
1. 细胞因子不足细胞因子是细胞生长和分化所必需的信号分子，它们可以刺激细胞增殖、分化和迁移等生理过程。
当细胞培养中细胞因子的浓度不足时，就会导致细胞生长受阻。
细胞培养基中通常会添加生长因子和血清等成分来提供细胞所需的因子，如果这些成分的浓度不够，就会导致细胞无法正常生长。
此外，细胞因子的失活、降解和结合等因素也可能导致细胞因子不足，从而影响细胞的生长。
2. 细胞培养基成分不合适细胞培养基的成分对细胞的生长起着重要作用。
培养基中的营养物质、无机盐和氨基酸等对细胞提供生长所需的能量和原料。
如果细胞培养基中这些成分的浓度或比例不合适，就会影响细胞的生长。
例如，缺乏特定的氨基酸或无机盐，细胞无法正常合成蛋白质或维持正常的细胞电位，从而导致生长受阻。
3. 细胞环境不适宜细胞培养的环境包括温度、湿度、气体组成等因素，这些因素对细胞的生长有着重要影响。
细胞培养一般需要保持在37°C的温度下，过高或过低的温度都会对细胞生长产生不利影响。
湿度的控制也很重要，如果湿度不适宜，细胞会失去活力。
此外，气体组成也会影响细胞的生长，例如，细胞需要适当的氧气浓度来进行代谢，过高或过低的氧气浓度都会导致细胞生长受阻。
4. 细胞污染细胞培养过程中，可能会出现细菌、真菌和病毒等污染物的存在。
这些污染物会竞争细胞培养基中的营养物质和生长空间，导致细胞生长受阻。
此外，某些污染物也可能释放毒性物质，对细胞产生直接伤害。
因此，在细胞培养过程中，严格的无菌操作和培养基消毒是细胞生长顺利进行的关键。
5. 细胞凋亡和细胞周期调控失衡细胞生长受阻的另一个重要原因是细胞凋亡和细胞周期调控失衡。
细胞培养中的微生物污染预防与处理
细胞培养中的微生物污染预防与处理细胞培养作为一种重要的实验手段，在生物医学研究领域中得到广泛应用。
然而，在细胞培养的过程中，微生物污染往往成为一个严重的问题，可能对实验结果产生不良影响甚至导致实验结果的无效化。
因此，预防和处理细胞培养中的微生物污染是细胞培养实验中不可或缺的一环。
首先，预防细胞培养中的微生物污染至关重要。
以下是一些有效的预防措施：1. 严格执行无菌操作：细胞培养实验中，无菌操作是最基本也是最重要的环节。
在进行培养操作前，实验人员应该经过相关的培训和指导，了解无菌操作的正确步骤和技巧。
例如，在实验操作前经常更换手套、使用经过有效消毒的培养器具和培养基等。
2. 经常清洁和消毒实验环境：实验室环境和设备的清洁和消毒是预防微生物污染的另一个重要方面。
实验室的工作台面、实验室衣物、培养箱、孵化器等都需要经常进行清洁和消毒，以减少微生物的存在和传播。
3. 控制空气中的微生物：空气中的微生物往往是细胞培养中的污染源之一。
为了降低空气污染带来的风险，实验室应该配备高效过滤器的实验室通风设备，定期更换过滤器。
此外，实验室应该设置限制进出实验室的措施，例如，安装空气帘或者设置冲洗区域。
4. 识别和处理污染源：在细胞培养中排查和识别潜在的污染源是很重要的。
实验人员应经常检查培养器具、培养基和试剂等是否存在污染，一旦发现污染，应及时处理。
处理污染源的方法包括更换受污染的培养器具、重新配制新的培养基或试剂等。
其次，当细胞培养中发生微生物污染时，采取适当的处理方法也是至关重要的。
1. 立即停止受污染的实验：一旦发现细胞培养被污染，实验人员应立即停止受污染的实验，并将受污染的培养器具和培养基等隔离处理，以防止污染的进一步传播。
2. 进行污染源检查：在处理微生物污染的同时，必须找出污染源，并加以处理。
通过对培养器具、培养基和试剂等进行检查，可以找到导致污染的原因，进而采取相应的措施。
3. 清洁和消毒工作环境：在处理污染源的同时，必须对实验室的工作环境进行清洁和消毒。
细胞培养中的常见问题解决方法
细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。
然而，细胞培养过程中常常会遇到一些问题，例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。
本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。
污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。
为了解决这个问题，可以采取以下几种方法：- 严格按照无菌操作操作培养细胞。
使用无菌操作条件，包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。
- 经常检查细胞培养物的外观。
细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。
如果有任何可疑的异常，请及时进行检查和处理。
- 使用含有抗生素的培养基。
对于某些细胞株来说，添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段，但在细胞培养过程中，过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少，对实验结果造成不利影响。
以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法：- 减少细胞培养的过度处理。
频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。
适当延长传代周期，避免过多的细胞移植。
- 提供适当的细胞营养来源。
细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。
不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。
确保培养基中的营养物质符合细胞的需求，并根据细胞株的特点进行相应的调整。
- 坚持细胞培养的无菌操作。
如前所述，细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。
通过无菌操作避免细胞污染，继而减少细胞凋亡。
3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。
pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。
以下是一些解决pH值失调的建议：- 定期检测和调整培养基的pH值。
使用pH计或试纸进行测定，及时调整pH值，保持在适宜的范围内。
- 确保培养基的配制正确。
细胞培养基的配制过程中，需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。
细胞培养常见问题及其解决
细胞培养常见问题及其解决1、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。
原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。
细胞培养中常见的问题
细胞培养中常见的问题2006-11-23 15:53细胞中的颗粒到底是怎么回事？我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。
好像是细胞碎片一样。
是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么是黑色的小碎片。
我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。
我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。
但是，是什么东西不清楚。
的确很常见在以前帖子见到说是“黑焦虫”。
长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。
而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。
不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。
以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。
那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。
我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。
国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长我培养的细胞也有出现这中情况。
但是并不影响细胞生长。
应该不是支原体污染最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了细胞培养的细菌污染我们新建的细胞室。
每周都会做清洁，用0。
2%新洁尔灭消毒，照紫外。
实验前也会照至少30分钟。
培养基中加青霉素，链霉素。
可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。
用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。
细胞培养中的常见问题及解决方法
细胞培养中的常见问题及解决方法细胞培养是现代生命科学研究中常用的实验技术之一，可以用于细胞增殖、分化、转染等研究。
然而，细胞培养过程中常常会出现一些问题，如细胞污染、细胞凋亡和细胞失活等。
本文将讨论细胞培养中的这些常见问题，并提出相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中的一大难题。
它可以由细菌、真菌或其他细胞类型的污染引起。
细胞污染会影响实验结果的准确性，并可能导致细胞系的丢失。
为了解决这个问题，我们可以采取以下措施：（1）经常检查细胞培养器具和培养基，确保其无菌；（2）使用抗生素或抗黴剂对培养基进行预处理，以减少污染的风险；（3）定期进行污染检测，例如细胞培养液和工作区的表面。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一部分，但在细胞培养中，过多的细胞凋亡会导致实验结果的误差。
为了减少细胞凋亡的发生，我们可以考虑以下措施：（1）优化培养条件，包括温度、CO2浓度和培养基配方等；（2）定期检查细胞形态和健康状况，及时处理出现凋亡现象的细胞；（3）使用细胞凋亡检测工具，如Annexin V-FITC/PI染色法，来评估细胞凋亡水平。
3. 细胞失活细胞失活现象在细胞培养中常常发生，可能是由于细胞老化、无营养补充或培养条件不佳等原因引起。
为了避免细胞失活的发生，我们可以尝试以下方法：（1）及时更换培养基，确保细胞获得充足的营养物质；（2）避免过度培养，及时传代细胞；（3）定期鉴定细胞的纯度和活力，并确保培养条件适当；（4）尝试使用细胞增殖激素或生长因子来促进细胞的增殖和存活。
细胞培养中的常见问题并不局限于上述三个，还有其他一些问题，例如细胞出现突变、细胞凝固等。
针对这些问题，我们可以进一步深入研究并寻找解决方法。
同时，注意维持实验室的清洁和规范操作也是解决这些问题的关键。
细胞培养在生命科学研究中发挥着重要作用。
了解并解决细胞培养中的常见问题，有助于提高实验结果的准确性和可重复性。
通过合理的实验设计、严谨的操作和科学的方法选择，我们可以克服这些问题，为细胞培养研究的进展做出贡献。
细胞培养的常见问题
关于液体培养基保存温度
●液体培养基可以放-20℃保持吗？
答：不可以！因为在-20℃下，培养基中的盐容易析出， 培养基融化后，有的盐可能无法重新溶解，从而导致 培养基渗透压降低，培养细胞时，细胞容易破裂而死 亡。
●我自己新配制的液体培养基可以存放多久？
答：我们建议将新配制的培养基放置于4℃，避光保存 尽量在一周内使用完毕。培养基越新鲜越好。
经典培养基介绍
● BME（Basal Medium Eagle) 由Eagle发明，只有11种氨基酸和盐及一些维生素的最简单培养 基。最先用于培养小鼠的L细胞和人类的HeLa细胞，现在广泛应用 于各种细胞的培养。
● EMEM or MEM（Eagle’s Minimum Essential Medium) BME的升级版，氨基酸浓度是BME的两倍，适用于更多的细胞。
●培养用液渗透压是怎样影响细胞生长的？
答：当细胞内、外环境的分子浓度不同时就会产生渗透压。这种情 况下，水分通过渗透流入或流出细胞，从而改变细胞的内环 境。高渗透压迫使水分从细胞中扩散出来导致细胞收缩，这种 情况会使DNA和蛋白遭到破坏，细胞周期停滞以及最终使细胞 死亡；反之，低渗透压使水分流入细胞内，使细胞肿胀破裂。
● RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute #1640) McCoy’s 5A的改进版，含有高浓度的肌醇。广泛用于悬浮细胞的培 养。如人类白细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞等血液来源的细胞。
● Ham’s F10（Ham’s Nutrient Mixture F10) 由Ham发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠细胞的培养。
◆不含血清，蛋白，水解物，酯类等 ◆无血清/无蛋白培养基也可能不含
细胞培养失败常见原因及对策
表：细胞培养失败常见原因及对策
出现问题可能原因解决办法
培养基中pH 错误的CO2浓度调节C02浓度
快速改变[NaHC02]2-3.7g/L,[C02]5-10%
培养瓶盖子过紧稍放松盖子
缓冲液量不足加HEPES至最终浓度为10-20mM
细菌、酵母和丢弃培养物、避免污染
真菌污染
细胞不贴壁过量的胰酶消化减少胰酶浓度或消化时间
培养基中无粘附因子加大血清浓度或增加粘附因子
细菌、霉菌、支原体污染检查并去除污染或丢弃
物理、化学污染去除相关污染
细胞生长速度降低改变培养基或血清比较培养基中成分,新旧血清比较
缺乏促进生长成分传代培养,加新鲜培养基和
如谷氨酰胺或生长因子生长促进成分
培养基储存不当保存在2-8℃，
血清培养基应尽量避光
初次细胞接种量少增加细胞接种数量
细胞衰老取得新细胞株
低度细菌和真菌污染无抗生素的培养基,如被污染，
则丢弃
支原体污染隔离培养,如污染,丢弃
细胞死亡无C02 检测C02
温度波动检验温度
抗生素浓度超量有毒性少量使用抗生素
细胞复苏受损重新复苏
渗透压错误检测培养基渗透压
产生毒性代谢物去除并更换培养基
细胞成团悬浮Ca，Mg离子存在用无Ca2+，Mg2离子的平衡
盐溶液清洗细胞
支原体污染隔离培养,检验支原体污
染,
如已经污染,则丢弃
胰酶过量,细胞DNA释放用DNase处理细胞
细胞形态、生长
状况改变细胞间污染更换细胞。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞培养常见问题的原因及对策
细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。
7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
细胞培养中常见污染
最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞培养失败常见原因及对策
表：细胞培养失败常见原因及对策
出现问题可能原因解决办法
培养基中pH 错误的CO
2浓度调节C0
2
浓度
快速改变 [NaHC0
2]2-3.7g/L,[C0
2
]5-10%
培养瓶盖子过紧稍放松盖子
缓冲液量不足加HEPES至最终浓度为10-20mM
细菌、酵母和丢弃培养物、避免污染
真菌污染
细胞不贴壁过量的胰酶消化减少胰酶浓度或消化时间
培养基中无粘附因子加大血清浓度或增加粘附因子
细菌、霉菌、支原体污染检查并去除污染或丢弃
物理、化学污染去除相关污染
细胞生长速度降低改变培养基或血清比较培养基中成分,新旧血清比较
缺乏促进生长成分传代培养,加新鲜培养基和
如谷氨酰胺或生长因子生长促进成分
培养基储存不当保存在2-8℃，
血清培养基应尽量避光
初次细胞接种量少增加细胞接种数量
细胞衰老取得新细胞株
低度细菌和真菌污染无抗生素的培养基,如被污染，
则丢弃
支原体污染隔离培养,如污染,丢弃
细胞死亡无C02 检测C02
温度波动检验温度
抗生素浓度超量有毒性少量使用抗生素
细胞复苏受损重新复苏
渗透压错误检测培养基渗透压
产生毒性代谢物去除并更换培养基
细胞成团悬浮 Ca，Mg离子存在用无Ca2+，Mg2离子的平衡盐溶
液清洗细胞
支原体污染隔离培养,检验支原体污
染,
如已经污染,则丢弃
胰酶过量,细胞DNA释放用DNase处理细胞
细胞形态、生长
状况改变细胞间污染更换细胞。
常用的细胞培养方法、污染及污染处理
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
细胞培养常见问题及解答
细胞培养常见问题及解答1.如何选用培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。
2.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。
激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。
在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。
脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。
L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。
一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。
5.为什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。
为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。
由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
6.如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。
轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。
细胞培养技术及常见问题
六、细胞的冻存和复苏 1、冻存 • 冻存液 7份培养液、2份FBS、1份DMSO或甘 油。 • 细胞密度 （1~10）×106个/ml • 步骤 4℃30分钟→-80 ℃24小时→液氮 • 冻存细胞应选取处于对数生长期的细胞。 2、复苏 • 液氮中取出的细胞应马上放入37 ℃水浴中，快 速摇晃融化。 • 0.4%台盼蓝染色，检测细胞存活率。
次 ↓ 加0.8ml无血清培液至Lipofectin-DNA混合物中，混 匀，滴加在细胞上，轻轻混匀。 ↓
37℃，5%CO2培养箱内培养5~24小时 ↓ 弃去转染液，加入2ml完全培养基，继续培养 ↓ 转染48~72小时，测定细胞瞬时表达情况，或于 转染48小时后更换选择培养基，进行筛选，获得 稳转细胞
4、灌流法→血管内皮细胞、成年动物心肌细胞 培养 • 胰酶、胶原酶可以单独或混合使用 5、密度梯度离心法→淋巴细胞、单核细胞培养 • Ficoll • Percoll 可以得到较纯的单核细胞 • 分离液成分为多糖复合物，可能与细胞表面受 体结合，影响后续实验结果。
※如何收集细胞进行实验检测
1、应该选用处于对数生长期，状态良好的细胞 用于实验。 2、细胞应处于70%左右融合，形态饱满，折光性 好。提前24小时换无血清培养基，避免血清 干扰，控制细胞生长速度。 3、选择适当的分离液，避免所分离的细胞表面 受体和其他标记分子被遮盖。 4、酚红有类似雌激素作用，为避免类固醇反应， 某些检测使用的细胞要用不加酚红的培养基。
2、污染的排除 • 及时高压灭菌污染的细胞，然后丢弃。（首选） • 对于污染较轻，且来源困难的高价值细胞
（1）用无抗培养基传代细胞，接种于多孔板中 （2）将浓度梯度稀释后的抗生素加入孔内，例如，两性 霉素B推荐下列浓度：0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、 8.0mg/ml。 （3）每天观察细胞毒性指标，如脱落、空泡、变圆等。 （4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2~3倍 浓度的抗生素培养液培养细胞2~3代。 （5）在无抗培养基中传代一次。 （6）重复步骤4 （7）在无抗培养基中培养4~6代，确定污染已被消除。
细胞培养过程中可能出现的问题及其解决方法
细胞培养过程中的常见问题及其解决方法一、培养液pH 值变化太快可能原因：1、CO2 张力不对；2、培养瓶盖拧得太紧；3、NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足；4、培养液中盐浓度不正确；5、细菌、酵母或真菌污染。
解决方法：1、（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％到10％。
（2）改用不依赖CO2 培养液。
2、松开瓶盖1/4 圈。
3、加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。
4、在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
5、丢弃培养物或用抗生素除菌。
二、培养液出现沉淀，但pH值不变解决方法：1、用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。
冰冻保存培养液。
2、用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。
3、将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
三、培养液出现沉淀，同时pH 发生变化原因：细菌或真菌污染解决方法：丢弃培养物。
或用抗生素除菌。
四、培养细胞不贴壁原因：1、胰蛋白酶消化过度；2、支原体污染；3、培养液中无贴壁因子。
解决方法：1、缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
2、分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培物。
五、悬浮细胞成簇原因：1、培养液中含钙、镁离子；2、支原体污染；3、蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放DNA。
解决方法：1、用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
2、分离培养物，检测支原体。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
3、用DNase I 处理细胞。
六、培养细胞死亡原因：1、培养箱内无CO2；2、培养箱内温度波动太大；3、细胞冻存或复苏过程中损伤；4、培养液渗透压不正确；5、培养液种有毒代谢产物堆积。
解决方法：1、检测培养箱内CO2；2、检查培养箱内温度；3、取新的保存细胞种；4、检测培养液渗透压，注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350 mOsm/kg；5、加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压；6、换入新鲜培养液。
细胞培养-Protocol
细胞培养是一项常用的生物技术，其原理是基于细胞在适当的培养条件下能够维持存活和增殖的能力。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞样本，用于研究、药物筛选、疾病治疗等应用。
以下是细胞培养的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、原理细胞培养的基本原理是模拟细胞在生物体内的生长环境，提供细胞生存和增殖所需的基本条件。
这些条件包括适当的温度、湿度、营养物质（如氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等）和气体环境（如氧气、二氧化碳等）。
通过提供这些适宜的条件，细胞可以在体外环境中维持生存和增殖。
细胞培养中涉及的关键生物学过程包括细胞的贴壁、增殖和传代。
细胞的贴壁是指细胞在培养瓶内附着于瓶壁上的过程，这通常发生在细胞悬液加入培养液之后。
细胞贴壁后，会开始进行有丝分裂，进行增殖生长。
当细胞数量增加到一定程度时，需要将培养瓶中的细胞传代到新的培养瓶中，以维持细胞的适宜生长密度。
二、所需试剂和耗材细胞培养所需的主要试剂和耗材包括：1.培养基：为细胞提供基本的营养物质，如胎牛血清、氨基酸、葡萄糖等。
2.添加剂：包括抗生素、抗真菌药物等，用于防止培养过程中的污染。
3.培养瓶：用于细胞的培养，有不同的规格和形状。
4.移液器：用于吸取和转移细胞悬液和培养液。
5.离心管：用于离心收集细胞。
6.过滤器：用于过滤培养液中的杂质和颗粒。
7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
8.无菌操作台：用于进行无菌操作，防止污染。
三、实验仪器细胞培养常用的实验仪器包括：1.细胞计数器：用于细胞计数和细胞密度测量。
2.显微镜：观察细胞的生长情况和形态变化。
3.CO2培养箱：为细胞提供适宜的生长温度和气体环境。
4.高压灭菌器：用于消毒处理实验器材和试剂。
5.超净工作台：用于进行无菌操作。
6.分光光度计：用于测量细胞生长的生化指标，如蛋白质含量等。
四、准备工作在进行细胞培养前，需要进行以下准备工作：1.选择适当的细胞：根据实验需求选择适合的细胞，了解其特性、来源和培养条件。
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细胞培养常见问题及其解决1. 如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2. 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。
7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。
原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。
碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。
Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。
如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。
如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
8. 细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。
细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
9. 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。
分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
10.冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
11. 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。
第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。
13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
14. 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。
注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。
若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
16.冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。
*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
17. 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
18.培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
19.应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？原则上：直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。
首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA 过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。
这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。
下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。
在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。
例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。
5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6.重复步骤4。
7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。
21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。
除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
22.支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。
故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
23. 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 °C 冰箱中，培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。
而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。
若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。
26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。
建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。
血清使用错误或血清的品质不佳。
解冻过程错误。
冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。
悬浮细胞误认为死细胞。
培养温度使用错误。
细胞置于–80 °C 太久。
30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。
脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。
L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
31.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。
一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
32.什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。
为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。
由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。