RTPCR和real time PCR 原理及步骤
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
RT-PCR和realtimePCR原理及步骤
装载
将样品和试剂装入PCR板或 realtimePCR板中。
进样
将PCR板或realtimePCR板放 入仪器中开始反应。
评价和解读结果
1
数据分析
利用专业软件对荧光信号和扩增曲线进
基因表达计算
2
行分析。
比较样品之间的基因表达水平。
3
标准曲线制备
用标准品建立浓度和荧光信号之间的关 系。
实验控制和误差处理
1 防止样品污染
2 合理设计实验
避免引入外源DNA或RNA。
提前考虑样品数、重复次 数和阴性对照。
3 数据验证
CR的优缺点比较
RT-PCR
灵敏度高，适用于低表达基因，但结果需要后续凝 胶电泳分析。
realtimePCR
结果即时可见，无需后续分析，但对样品纯度和荧 光信号分析要求较高。
RT-PCR和realtimePCR的应用领域
医学诊断
RT-PCR和realtimePCR用于病 原体检测、基因突变分析和 疾病诊断。
基因表达分析
这两种技术用于研究基因调 控、蛋白质表达和细胞信号 传导。
环境监测
RT-PCR和realtimePCR可用于 检测环境中的微生物和污染 物。
RT-PCR和realtimePCR的原理
应用案例
• 基因表达差异分析 • 疾病诊断 • 新药研发 • 环境污染监测
发展前景
随着技术的不断改进，RT-PCR和realtimePCR在医学、生物学和环境科学等领 域都会有更广泛的应用。
结论与展望
RT-PCR和realtimePCR是重要的分子生物学技术，为科学研究、医学诊断和环 境监测提供了强大的工具。
RT-PCR和realtimePCR原理 及步骤
realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点
real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
Real-time_PCR_原理介绍
Real-time PCR 原理介绍一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct 值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct 值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
如图3所示。
图3. TaqMan 荧光探针工作原理2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
Real-timePCR实验原理与技术
实时荧光定量PCR技术原理
01
在实时荧光定量PCR反应中， DNA模板被扩增时，与荧光探 针结合，产生荧光信号。
02
随着DNA的扩增，荧光信号逐 渐增强，通过对荧光信号的实 时监测和分析，可以计算出 DNA的起始浓度。
03
通过标准曲线或内参基因的校 准，可以将起始浓度转化为目 标基因的表达量或基因拷贝数 。
实时监测荧光信号
实时监测荧光信号，确保PCR产物在指数扩增阶段被检测到。
标准化实验流程
建立标准化实验流程，确保实验结果的可靠性和可重复性。
未来展望
新技术应用
01
随着新技术的不断发展，如数字PCR、微流控PCR等，Real-
time PCR技术将得到进一步优化。
高通量检测
02
通过多重PCR和高通量检测平台，实现大规模样本的快速检测。
03
Real-time PCR 实验数 据分析
数据收集与整理
数据收集
在实时PCR实验中，数据收集通常涉 及记录每个循环的荧光信号强度。这 些数据通常以图表形式表示，其中横 轴表示循环数，纵轴表示荧光信号强 度。
数据整理
收集到的原始数据需要经过整理，包 括去噪、去除异常值和标准化等步骤， 以确保数据分析的准确性。
自动化与智能化
03
实现Real-time PCR的自动化和智能化，提高实验效率，减少人
为误差。
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real-timepcr实验原 理与技术
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• Real-time PCR 实验原理 • Real-time PCR 实验技术 • Real-time PCR 实验数据分析 • Real-time PCR 实验应用 • Real-time PCR 实验注意事项与优化建
Realtime PCR实验原理与技术 ppt课件
qRT-PCR技术实验操作（优化）
标准品的选择： 理论上可以以目的基因的PCR扩增产物为标准品， 但是存在降解、污染等因素影响定量结果。
论坛网友给出了几种解决方法： ① 另设计一对引物用于荧光PCR； ② 将扩增序列插入T载体后作为标准品； ③ 设计一对外围引物扩增PCR,将产物连入T载体(①+②)
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术荧光标记方法的 分类
1. 非特异性的DNA结合染料法：荧光染料能非特异结合DNA
双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。
常用染料：Pico Green （灵敏度高,>=25pg/mL） SYBR I
缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。 措施：设计特异性引物，优化PCR反应条件。
定量分析？
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术原理
a) Ct值(Cycle Threshold;每个反应管中荧光强度达到阈 值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关 系。
b) 以不同稀释倍数的已知模板制备标准曲线。 c) 实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知
样本的初始拷贝数。（定量分析）
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术实验操作（优 化）
有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即 将温度提高后再检测反应体系中的荧光。该检测温度 大于引物二聚体的退火温度 Tm，而小于特异性扩增 产物的 Tm值。在此温度下，引物二聚体都变性成单 链，因此只检测到与特异性 PCR 产物结合的 SYBR Green I 所发出的荧光，消除了引物二聚体的干扰，降 低了非特异性荧光，有助于目标基因的准确定量。
RT-PCR原理和实验步骤
RT-PCR原理和实验步骤RT-PCR原理与实验步骤一、知识背景：1、基因表达：DNA。
RNA。
Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。
因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(Polymerase chain XXX)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，最少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的筹办：1.引物的设计及其原则：1)引物的特异性决定PCR回响反映特异性。
因此引物设想是不是公道对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设想时要充裕斟酌到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达进程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2)引物设计原则的把握引物设想准绳包括:a、引物长度:一般为15～30bp，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
RNA提取RTPCR
三、实验步骤：
RNase free dH2O 10µl 70℃、10min 冰上急冷、2min
Oligo(dt15) primer(50µM) 2 µl Total RNA 2 µl
5×M-MLV buffer 离心数秒
4 µl 1 µl
20 µl体系 0.5 µl
dNTP Mixture (10 mM each) RNase Inhibitor(40U/µl)
RTase M-MLV(RNase H-)(200U/µl) 0.5µl 42 ℃、60min 70 ℃、15min 冰上冷却即得到总cDNA
PCR
一、实验原理：
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反 应）。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复 性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进 行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵 敏度高、操作简便、省时等优点。 标准反应中一般采用三温度点法，双链DNA在90-95℃ 变性，再迅速冷却至40-60℃，引物退火并结合到靶 序列上，然后快速升温至70-75℃，在TaqDNA聚合酶 的作用下，使引物链沿模板延伸。
PCR反应程序
94℃ 94℃ 57.0℃ 72℃ 72℃ 4min 40s 40s 1.5mim 10min
35个循环
反应结束后，取反应液10μ l进行琼脂糖凝胶电泳， 确认μ l Eppendorf管（PCR管）中依次加入： ddH2O 15μ l 10×PCR Buffer 2.5μ l Mg2+ 2 μ l dNTP （10 mM） 1μ l primer 1 1μ l primer 2 1μ l 模板 2μ l Taq酶 0.5μ l Total 25μ l
RTPCR和realtimePCR原理及步骤
绝对定量与相对定量的定义
绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究
相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
绝对定量通过标准品定量
绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域 值时所经历的循环数被称为 CT 值 （ threshold value ）。
定量PCR的数学原理
斜率与扩增效率
标准品
标准品梯度稀释方法
1、SYBR Green 法
SYBR Green 熔解曲线分析
SYBR Green法优缺点
优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA������ 使用方便--不必设计复杂探针������ 非常灵敏������ 便宜
其他荧光标记方法
Taqman 的优点 对目标序列有很高的特异性 特别适合于SNP检测 与Molecular Beacons 相比设 计相 对简单 Taqman 的缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析
分子信标的优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试 剂之一 荧光背景低 分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高
RT-PCR和real-time PCR 原理及步骤
PCR定义
聚 合 酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时 间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子 生物学技术。
多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有 活性，因此反应体系自动往复多次地进 行对所需的DNA的片段的酶促合成，使 反应产物按指数增长，所以命名为聚合 酶链式反应。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
RT-PCR与realtime pcr
Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。
Real-time PCR 所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。
RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
Real time RT-PCR是将Real time-PCR的方法用于RT-PCR中，目的也是为了对样品浓度进行精确控制。
RT-PCR和Real time-PCR是没有必然联系的，两种技术可以一起使用，就是Real time RT-PCR；也可以单独使用。
就是名称有点绕，逆转录PCR先出现，所以占用了RT-PCR这个简写，等Real time-PCR技术出现后，本来按照惯例，简写也是RT-PCR，但为了与逆转录PCR相区别，还是写成Real time-PCR。
realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点
real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
实时定量RTPCR的原理及方法
实时定量RTPCR的原理及方法一、本文概述实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的实验技术，用于检测和分析RNA样本中特定基因的表达水平。
该技术结合了反转录和聚合酶链式反应（PCR）的基本原理，通过实时监测PCR过程中产生的荧光信号，实现对基因表达量的高精度定量。
本文将对实时定量RT-PCR 的原理、实验方法以及应用进行详细的阐述，旨在为读者提供全面且深入的了解，从而能够在实际研究中灵活应用该技术，提高实验效率和准确性。
二、实时定量RT-PCR的基本原理实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测反应产物量的变化，从而得到起始模板量的分析方法。
这种技术结合了反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个过程，使得RNA模板也能进行定量分析。
实时定量RT-PCR的基本原理可以分为三个步骤：反转录，PCR 扩增，以及实时荧光信号检测。
反转录步骤中，RNA模板在反转录酶的作用下，被转换成互补的DNA（cDNA）。
这个过程中，RNA的特异性序列被保留下来，为后续的PCR扩增提供了模板。
然后，PCR扩增步骤中，特定的DNA片段在DNA聚合酶的作用下，通过引物的引导，进行指数级的扩增。
在这个过程中，DNA的数量以2的n次方（n为循环次数）增长，从而大大提高了检测的灵敏度。
实时荧光信号检测步骤中，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使得在DNA扩增的每一个循环中，都能实时监测到荧光信号的变化。
这种荧光信号的变化与DNA产物的量成正比，因此可以通过实时监测荧光信号，来推算出起始模板的量。