抗氧化酶活性等测定方法
抗氧化酶测定实验方法
抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类酶系统，它能够抵御氧自由基的伤害，维持细胞内环境的稳定。
常见的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。
测定抗氧化酶活性能够评估抗氧化能力，进而为疾病的诊断和治疗提供参考。
以下是抗氧化酶测定的实验方法。
实验材料：1.磷酸盐缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7-8)。
2.高速冰箱和离心机。
3. 0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液：将L-酪氨酸溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液中，并加入0.5% (w/v) 卵白饼干碎片。
4.超氧化物解毒酶(SOD)标准品：如肝脏SOD标准品。
5.乙醇、乙醚、碘仿、硝酸等有机试剂。
6.2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-（二苯嘧啶)-2H-四唑(INT)。
实验步骤：1.组织预处理：取所需组织样品，酶解和离心得到提取液(组织块破碎并添加合适的缓冲液)，离心清除杂质得到上清液。
2. 蛋白质含量检测：根据Bradford法或Lowry法，测定上清液中蛋白质的含量。
3. 测定SOD活性：将上清液加入0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液，再加入0.5%的乙醇溶液，保护酪氨酸被SOD氧化，使其在酶作用下发生自动降解。
离心，取上清液。
在为反应液中加入INT（2.5 mmol/L），使之在SOD作用下发生氧化还原，反应生成紫色的一价酮衍生物。
在滤紙上滴加提取液，通过比色计测定OD值。
4. 测定Cat活性：将提取液加入3%的过氧化氢溶液并充分混合。
加入乙醚和碘仿的混合物，并离心。
提取水相层和乙醚层。
用硝酸溶液判断乙醚层中是否存在过氧化氢。
通过测定乙醚层吸收光谱的变化来测定Cat 活性。
5. 测定Gpx活性：加入适量的提取液到预先调配的反应体系中。
反应开始后，每2分钟测定OD值，记录10分钟之间的OD变化。
绘制OD值和反应时间的曲线，计算反应速率。
6.数据处理：根据测得的OD值和各反应时间点得到的反应速率，计算出抗氧化酶系数和活性。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结引言：抗氧化物活性测定在食品、医药、化妆品以及生命科学等领域具有重要应用。
目前，常用的抗氧化物活性测定方法主要包括化学法、生物法和物理法。
本文将对这几种方法进行总结。
一、化学法1.1.DPPH自由基法该方法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、通过DPPH自由基与抗氧化物发生反应，使DPPH自由基得以还原为无色溶液，测定溶液的吸光度来评估抗氧化活性。
1.2.ABTS自由基法该方法通过生成具有特定吸光度的ABTS自由基，评估抗氧化物对自由基的清除能力。
与DPPH自由基法相比，ABTS自由基法具有更高的灵敏度和稳定性。
1.3.羟自由基清除法该方法利用特定的化学反应，测定样品对羟自由基的清除能力，评估其抗氧化活性。
该方法适用于抗氧化物活性测定和体外抗氧化活性评价。
1.4.过氧化物清除法该方法测定样品对过氧化物的清除能力，通过测定生成的不稳定的自由基产物的分解速率，评估抗氧化活性。
该方法适用于测定生物样品的抗氧化活性。
二、生物法2.1.脂质过氧化抑制能力测定法该方法通过测定样品对脂质过氧化的抑制能力，评估其抗氧化活性。
常用的指标包括丙二醛生成量、硫代巴比妥酸反应物（TBA）生成量等。
2.2.DNA损伤保护能力测定法该方法通过测定样品对DNA损伤的保护能力，评估其抗氧化活性。
常用的指标包括DNA链断裂率、碱基损伤率等。
2.3.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法该方法测定样品中SOD的活性，评估其清除超氧自由基的能力。
常用的指标包括抑制率、相对酶活等。
2.4.过氧化氢酶（CAT）活性测定法该方法测定样品中CAT的活性，评估其清除过氧化氢的能力。
常用的指标包括催化剂浓度、酶单位等。
三、物理法3.1.相对电子自旋共振法该方法通过测定样品中的自由基产物的电子自旋共振信号的强度，评估抗氧化物的活性。
常用的指标包括g值、线宽等。
3.2.高温氧化法该方法利用样品在高温条件下的氧化反应，评估其抗氧化活性。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。
其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。
测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。
以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。
1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。
（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。
（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。
（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。
（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。
1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。
（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。
（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。
（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。
网上说定容到100ML我也不懂。
拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。
取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。
抗氧化活性研究方法
抗氧化活性研究方法引言：氧化反应是指分子或原子失去电子，而还原反应是指分子或原子获得电子。
由于氧化反应产生的自由基具有高度活性，能够对细胞结构和功能造成损害，导致多种疾病的发生。
因此，研究抗氧化活性及其机制对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化活性研究方法。
一、DPPH自由基清除能力测定法DPPH自由基清除能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色自由基，其颜色随着氧化程度的增加而减弱。
在该方法中，将待测样品与DPPH溶液混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够清除DPPH自由基，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。
二、还原能力测定法还原能力测定法是通过测定待测样品对还原剂的还原能力来评估其抗氧化活性。
常用的还原剂包括铁离子、铜离子等。
在该方法中，将待测样品与还原剂混合，通过测定混合液的吸光度变化或还原剂浓度的变化来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够还原还原剂，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降或还原剂浓度的降低。
三、氧化脂质抑制能力测定法氧化脂质抑制能力测定法是通过测定待测样品对氧化脂质的抑制能力来评估其抗氧化活性。
常用的氧化脂质包括脂肪酸、脂肪油等。
在该方法中，将待测样品与氧化脂质混合，通过测定混合液中脂质的氧化程度来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够有效抑制氧化脂质的形成。
四、超氧阴离子清除能力测定法超氧阴离子是一种常见的自由基，具有较高的活性。
超氧阴离子清除能力测定法是通过测定待测样品对超氧阴离子的清除能力来评估其抗氧化活性。
常用的超氧阴离子产生体系包括NBT（硝基蓝盐）-NADH（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）体系、XTT（二苯基四唑盐）体系等。
在该方法中，将待测样品与超氧阴离子产生体系混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够有效清除超氧阴离子，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。
抗氧化酶测定实验方法
抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。
抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。
因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。
以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取一、试剂配置1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195、2×0、05=9、76g)、山梨糖醇(0、33×182、2=60、126g)、NaCl(0、010×58、5=0、585g)、MgCl(0、002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0、002=0、5845g)、KH2PO4(200×0、0005=0、1g);使用时加入ASA-Na(198、1×0、002=0、3962g);2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238、3×0、05=11、915g得HEPES(238、3×0、05=11、915g);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml水;实际配制:PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml);80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml、(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7、6,含0、33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。
抗氧化酶活性等测定方法
抗氧化酶活性等测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，能够将超氧自由基（O2.-）转化为过氧化氢（H2O2），进而被谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或过氧化物酶（CAT）降解。
测定SOD活性的方法有多种，其中最常用的方法包括：1.基于阻断亚硝酸胆红素还原的方法：该方法通过加氨基钠阻断细胞色素c还原作用，使亚硝酸胆红素还原成胆红素，从而测定SOD活性。
2.基于X射线辐照条件下还原亚硝酸胆红素的方法：这种方法利用X射线辐照生成O2.-，进而被SOD转化为H2O2、H2O2与亚硝酸胆红素反应生成亚硝酸盐，其紫红色可被光度计测定。
3.基于化学发光的方法：这种方法通过硝酸亚铁与亚硝酸盐反应生成亚铁络合物，发出化学发光信号。
该方法简单、灵敏度高，并可以自动化操作。
二、过氧化物酶（CAT）活性测定方法过氧化物酶是参与H2O2代谢的重要抗氧化酶。
常用的测定CAT活性的方法有：1.重铬酸钾（K2Cr2O7）比色法：该方法利用过氧化氢氧化重铬酸钾，从橙色转变为无色，通过比色计测定过量K2Cr2O7的消耗量计算CAT活性。
2.亚甲蓝法：这种方法利用过氧化氢氧化亚甲蓝生成显色产物，通过光度计测定产物的吸光度来评估CAT活性。
3.氨蓝法：这种方法是通过氨蓝还原过氧化氢产生的游离基离子，再与其他物质（如溴酚蓝）反应生成显色产物，通过比色计测定产物的吸光度来测定CAT活性。
三、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定方法谷胱甘肽过氧化物酶是参与氧化还原反应的重要酶。
目前常用的测定GSH-Px活性的方法有几种，包括：1.基于还原硒酸铁的方法：该方法利用GSH-Px催化还原硒酸铁成为亚硒酸铁，反应产物与硫代巴比妥酸钠反应生成巴比特酸，通过光度计测定巴比特酸的吸光度来评估GSH-Px活性。
2.比色法：这种方法通过巴比妥酸与反应产物反应生成巴比妥酸-丙二醛复合物，通过光度计测定复合物的吸光度来评估GSH-Px活性。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法-(2154)
抗氧化酶（ SOD、 POD、 CAT ）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS ， pH7.8) ：A母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14） 71.7g；B母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01） 31.2g。
分别用蒸馏水定容到 1000ml 。
0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至1000ml 。
加入 10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000： 267～ 268。
（2） 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：取 1.399g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 100ml 。
网上说定容到 100ML 我也不懂。
拜托（ 3）100μ mol/L EDTA-Na 2溶液：取 0.03721g EDTA - Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；（4） 100μM核黄素溶液：取 0.0075g 核黄素用蒸馏水定容至 100ml ，避光保存，随用随配，并稀释 10 倍（ 5）750μ mol/L 氮蓝四唑（ NBT ）溶液：称取 0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml 。
取 5ml 于 10000r/min 下离心10min ，上清液即为SOD 粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。
因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。
直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。
下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。
1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。
（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。
实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。
b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。
c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。
d.使上述反应在37℃下进行10分钟。
e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。
f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。
（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。
实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。
b.分别加入适量的SOD样品。
c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。
d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。
2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。
（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。
实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD)活性测定（氮蓝四唑光化还原法)1、试剂的配制（1)0。
05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7。
8）:A母液:0。
2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358。
14)71。
7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31。
2g.分别用蒸馏水定容到1000ml。
0。
05mol/L PBS（pH7。
8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4） 228。
75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。
加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000：267～268.(2)130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1。
399g Met用磷酸缓冲液（pH7。
8）定容至100ml.网上说定容到100ML 我也不懂。
拜托（3)100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；(4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存,随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑(NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0。
5g于预冷的研钵中，加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。
取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管,1支为对照管，另外1支作为空白，按表39—1加入各溶液。
抗氧化酶活力测定方法sun20200516
抗氧化酶活⼒测定⽅法sun20200516植物组织抗氧化酶活的测定⽅法（修订版2020年5⽉7⽇）⼀、待测样品预处理称取鲜样0.5g于预冷的研钵（提前放冰箱）中，加1mL预冷的磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8），冰浴研磨后再加1mL缓冲液，倒⼊离⼼管中，再⽤2mL缓冲液清洗研钵，倒⼊离⼼管中，平衡，低温（0-4℃）离⼼20min（10500rpm），收集上清液，冷藏保存。
磷酸缓冲液配制：A液（0.2mol/L磷酸氢⼆钠溶液）的配制：称取Na2HPO4·2H2O 35.61g 或Na2HPO4·7H2O 53.65g 或Na2HPO4·12H2O 71.64g ⽤蒸馏⽔定容⾄1000mL。
B液（0.2mol/L磷酸⼆氢钠溶液）的配制：称取NaH2PO4·H2O 27.6g 或NaH2PO4·2H2O 31.21g ⽤蒸馏⽔定容⾄1000mL。
磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8）配制：45.75mL A+ 4.25mL B定容⾄200mL。
磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0）配制：61mL A+39mL B定容⾄200mL。
磷酸缓冲液（100 mmol/L、pH 7.5）配制：84mL A+16mL B定容⾄200mL。
磷酸缓冲液（50 mmol/L、pH7.5 ）配制：42mL A+8mL B定容⾄200mL。
⼆、SOD（超氧化物歧化酶）活⼒测定——氮蓝四唑（NBT）法1.1原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动?植物体内，是⼀种清除超氧阴离⼦⾃由基的酶，它催化下列反应：。
本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进⼀步分解或被过氧化物酶利⽤。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作⽤来确定酶活性⼤⼩。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化⽽产⽣超氧阴离⼦⾃由基，超氧阴离⼦⾃由基可将氮蓝四唑还原为蓝⾊的甲腙，后者在560nm处有最⼤吸收。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取一、试剂配宜1、PBS 提取液:每L 水依次加入MES（ 1 9 5 .2x0, 05=9、7 6g）、山梨糖醇（0。
33x182。
2=60. 1 26g）. NaC 1（ 0 . 0 10x58.5=0. 5 85g）. MgC 1 （0.002x95=0. 19g）、EDTA（292> 25x 0.0 0 2 = 0、5 84 5 g）. KH2PO4（ 2 00x0.0005= 0 . 1 g）；使用时加入ASA—Na（198o 1x0、00 2=0、3 962g）;2、悬浮液:将PBS 提取液中得MES 换为238。
3x0.05= 1 1、9 15g 得HEP ES（23J 3x 0。
05=11。
915 g）;3、80%Percol :8 0 ml 原液 + 2 Oinl 水;40%Pcr c ol: 4 0ml 原液+60ml 水;实际配制：PBS提取液2000m 1（3个处理*2个品种* 3个重复* 20ml * 3次=1 0 80m I ）,悬浮液lOOmK 3个处理*2个品种*3个重复*lm I *3次二5 4 ml）;8 0 %Percol 2 0 0ml; 40%Perc o 1 200ml。
（3 个处理*2 个品种*3 个重复左3m I * 3 次=162ml）二、提取步骤k 10g 鲜样加20ml 提取P B S（50mM MESPH6、1,含0、3 3M 山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgC I 2, 2 mM EDTA.O .5 mMKH2PO 4,2mM ASA—Na,AS A—Na 使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液200 Og 3 min.小心倒出上淸液，将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值（水平转头•加速度调到9）,约经30s后很快使英下降停止，整个离心持续大约2-3m i n左右完成；4、沉淀用1 ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用lml 悬浮液（5 OmMHEPESpH 7.6,含0、33 mM 山梨糖醇,1 0 mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA.O。
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叶绿体得提取一、试剂配置１、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。
05=９、7６g)、山梨糖醇(0。
33×182。
2＝60。
1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。
1×0、00２=0、３962g);2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。
３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。
05=11。
915ｇ);３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水;实际配制:PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ),悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml);8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。
(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl)二、提取步骤1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成;4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。
6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。
5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。
叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。
6、２000g 1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做)8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用水平离心头得离心机,离心机加速要缓慢上升,加速度调到１),下降也要缓慢下降,否则会破碎Perｃoｌ得浓度梯度层得形成,取出会瞧到３层绿色带,最上层为破碎得叶绿体,沉在地层得为粗颗粒,40－80％得Peｒcol 之间得界面有一层绿色层为完整得叶绿体;9、小心吸出,转移到悬浮介质中,使叶绿体浓度达到1mg.mｌ—1;(计算:取叶绿体悬浮液0.1mｌ,加4.9 ml８０%得丙酮,摇匀后于１0０0g离心2ｍin,上清液置于１ｃm得比色杯,在６25nｍ上比色,按照公式计算:OＤ6×５０/34.５＝叶绿素ｍg/mｌ)２5ｎm10、测定叶绿体得完整性,完整率达到８５-95%;参考:TakedａK,Otaubo T,Kｏnda N. Ｐarticipaｔion of hydｒogen ｐeroｘｉde iｎthe inactiｖationｏf Cａｌｖin—cycle SH ｅnzyme inｓo2—furmugaｔｅd ｓｐｉnacｈleaves。
Plant and cell Phｙsioｌogy,１982,２3:1009—1018。
取上述制备得完整叶绿体进行如下测定:1、用５0mM PBS(保护酶或其她测定项目得缓冲液)稀释2－5倍,用于测定SOD、POＤ、CAT、ＡPX;2、用冷丙酮稀释2倍,取0。
5MＬ提取液用于测定H２Ｏ2;(本试验中用０。
2mｏl/L ＨClＯ４稀释)3、用5％得TCA稀释2-5倍,取1。
5ml用于测定MDA;4、用乙醇:丙酮:水=4。
5:4。
5:1稀释,用于测定叶绿素;抗氧化酶(SＯＤ、ＰＯD、CＡT、APX)活性测定方法一、超氧化物歧化酶(ＳOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂得配制(1)0.０5mｏl/Ｌ磷酸缓冲液(ＰBS,pＨ7。
8):A母液:0。
2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12Ｈ2O(分子量358.14)71．7g;Ｂ母液:0.2ｍol／Ｌ磷酸二氢钠溶液:取NaＨ2PO4·２H2O(分子量156.01)31.２g。
分别用蒸馏水定容到10０0ml。
0、05moｌ/L ＰBS(pH7、8)得配制:分别取A母液(Nａ２HＰO４) 228。
75mｌ,B母液(ＮaＨ2PO4) 2１.25ml,用蒸馏水定容至１0０0ｍl、参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术。
高等教育出版社,2０00:26７～26８。
(2)14。
5mM甲硫氨酸溶液:取2、１637g Meｔ用磷酸缓冲液(pＨ7。
８)定容至１0０0ml。
(３)3０μM EDＴA－Ｎa2溶液:取０。
001gＥDTＡ-Na２用磷酸缓冲液定容至100ml、(4)60μＭ核黄素溶液:取０、0０２3ｇ核黄素用磷酸缓冲液定容至100ｍl,避光保存。
(5)２。
25ｍM 氮蓝四唑(ＮBT)溶液:取0。
1840g NBT用ＰＢS定容至100ml,避光保存。
(上述试剂先配好,放到４度冰箱,用之前临时按下面得方法配,然后放在4度冰箱中,不要在最上层,避免见光,第一组样品加好后拿出来加,加完后放回冰箱,第二组得样品加好后再拿出来加)酶液制备:取0。
２g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷得研钵中,加入1。
6mｌ50ｍmｏｌ/Ｌ预冷得磷酸缓冲液(pH7、8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、1２000g下离心20min,上清液即为酶液。
2、酶活性测定(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Mｅt溶液１６2ml,ＥDＴA－Ｎａ2溶液0.６mｌ(加得量与前面得浓度要核对),磷酸缓冲液5、4ml,NBT溶液６mｌ,核黄素溶液6ｍl,混合后摇匀;SＯD反应混合液:3个处理*２个品种＊3次重复*3mｌ＊３次测定=162ml(实际配置２0０ml)(2)分别取3ｍｌ反应混合液与30μl(可视情况调整,最好先做一个浓度梯度,瞧加多少合适,如果量太少,最好稀释后再加,这样精确)酶液于试管中(尽可能加到试管得底部,要靠着试管壁打下去先加酶液,后加反应液,加好后摇一摇,瞧瞧试管上就是不就是有雾气,最好拿纱布把试管下边擦一下,免得雾气挡住光线照过去);(3)将试管置于光照培养箱中在4０0０lux光照下反应2０min;(照光很重要,试管要选择相同规格得,因为不同得试管透光率就是不一样得,试管架不要选择遮光得,这个最好分组做,同时几组做相互之间会遮光,每一组一个重复,就就是每一组中都要有所有得处理,且都要有一个最大管,处理多得话,把根与叶分开做,最大管放在中间)同时做两支对照管,其中１支试管取3mｌ反应混合液加入３0μl PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
(4)以不照光得对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后,避光测OＤ5６０(出现颜色即可测定)。
(5)酶活性计算:ＳOD活性单位以抑制NＢＴ光化还原50％所需酶量(测得样品值要在最大管得一半左右才合适,否则要调整酶量)为1个酶活单位(u)。
SOＤ总活性＝［( A ck－A E )×V］／(１/２Aｃk×W×Vt)ＳＯＤ比活力=SOD总活性/蛋白质含量SOＤ总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g ＦW);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;A ck为照光对照管得吸光度;ＡE为样品管得吸光度;Ｖ为样品液总体积(ml,1、6ml,加入PBS得体积);Vt为测定时得酶液用量(ml,30ul);W为样品鲜重(g,测定时应换算为叶绿体得质量mg);蛋白质含量单位为mg／ｇ。
二、PＯＤ、CAT酶活性得测定粗酶液制备同SOD。
1、过氧化物酶(ＰOD)活性测定(愈创木酚法)(1)试剂配制:0、２moｌ/L磷酸缓冲液(pH6、0):分别取A母液(Na２HＰＯ4 ) 12３ｍl与B母液(NaH2PＯ4)877m ｌ混匀即为1000ml ＰBS(0。
２Ｍ,pH6、0);(２)反应混合液配制(以60个样为准):取2０0ｍl PBS(0。
2M,pH６、0),加入0.076ml液体(原液)愈创木酚(２－甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入0。
1１2ml30％得H２O2,混匀后保存于冰箱中备用。
PＯD反应混合液:3个处理＊2个品种＊3次重复＊3ｍｌ＊3次测定=1６2ml(实际配置200ｍl, 0.076ml, 0、112ml)(3)样品测定:取3ml反应液并加入30μｌ酶液,以PBS为对照调零,而后测定OD470值(测定４0秒)。
(边加样边测定,测定前等待5秒,动作要快,如果慢得话,要保证每个样品从加好样到开始记时得时间相差不大)(4)酶活性计算:以每ｍｉn OＤ值变化(升高)0、０1为1个酶活性单位(u)、POＤ=(ΔA４70×Vt)/(Ｗ×Vs×0、01×t)(u/g miｎ)ΔA4７0:为反应时间内吸光度得变化;Ｗ为样品鲜重(ｇ);ｔ为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,(1.６ml);Ｖs为测定时取用酶液体积(ml,30ul)。
2、过氧化氢酶(CAT)活性测定(1)试剂配制:0、１5mｏｌ／L磷酸缓冲液(pH7。
０):取A母液(Nａ2HPO4) 457、5 ml 与B母液(NaH2PO４) 29２。
５ｍl混合后用蒸馏水定容至1000ml、(２)反应液配制:取20０ml ＰＢS(０、1５M,pＨ7.0),加入0、３092ｍl 30%得H2O２(原液)摇匀即可。
ＣAT反应液:3个处理*２个品种＊3次重复*3ｍｌ*3次测定=162ｍｌ(实际配置200 ml, 0、３０92ml)(３)样品测定:取3ml反应液加入0.1ｍｌ(可视情况调整)酶液,以PBS为对照调零,测定OＤ２40(紫外)(测定40s)。
(４)酶活性计算:以每min ＯＤ值减少0。
０1为1个酶活性单位(u)、ＣＡT=［ΔA240×Ｖt]/(W×Vｓ×0。