免疫酶组织化学技术讲解
《疫酶组织化学技术》课件
酶活性检测
酶活性标准品制备
实验操作
制备一定浓度的酶活性标准品，用于校准 实验。
按照实验方案进行酶活性检测的具体操作 。
数据记录
结果判断
详细记录实验数据，包括反应时间、温度 、pH值等。
根据实验数据，判断酶的活性是否符合要 求。
结果分析与解读
数据分析
对实验数据进行整理、统计和分析，找出规 律和趋势。
在环境监测中的应用
污染物检测
通过免疫酶组织化学技术检测环境样 品中污染物的抗原或抗体，评估环境 污染程度和生态风险。
生态毒理学研究
利用该技术对生物体暴露于污染物后 的生理变化进行监测，为生态毒理学 研究提供有力手段。
CHAPTER 05
疫酶组织化学技术的挑战与 展望
技术挑战与解决方案
技术挑战
疫酶组织化学技术在实际应用中面临许多挑战，如组织样本的保存、试剂的选择 和配制、实验条件的控制等。
实验方案制定
根据实验目的和要求，制定详细的实验方案 和步骤。
酶的提取与纯化
酶源选择
根据实验需要选择合适的酶源，如动 物、植物或微生物。
酶提取
采用适当的提取方法，将酶从原料中 分离出来。
酶纯化
通过一系列纯化技术，去除杂质，提 高酶的纯度。
酶活性检测
在提取和纯化过程中，需实时监测酶 的活性，确保其质量和活性。
CHAPTER 06
参考文献
参考文献
疫酶组织化学技术是一种常用的免疫组织化学技术，用于检测细胞和组织 中的抗原物质。
该技术利用抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过酶标记的抗体来检测 抗原，具有高灵敏度和高特异性。
疫酶组织化学技术在医学、生物学等领域广泛应用，可用于研究疾病的发 生、发展机制以及诊断和治疗。
第三章免疫酶组织化学技术
2 间接法
1) 石蜡切片脱蜡至水； 冰冻切片 室温干燥--丙酮固定----缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂
2) 甲醇双氧水室温处理切片15～30min,封闭内源性过氧化物酶活性。 3) PBS漂洗 4) 0.1％～1％牛血清白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育15～25’,然后吸去孵育
液,不冲洗. 5%～10％正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育15～20’然后吸去。 5)滴加PBS适当稀释的第一抗体,湿盒内孵育,或4℃过夜,或室温2～4h。
红 色，GOD法阳性者呈蓝色。
二、非酶标抗体免疫组织化学染色法
酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法 PAP
(一) 酶桥法 1 原理：三种抗体 一抗 二抗---桥抗体 三抗----抗酶(HRP)抗体, 酶(HRP)与抗酶抗体结合,经底物的显色反应将抗原显示出来。
优点：任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合, 避免因 共价结合对抗体和酶活性的影响,敏感性高, 可节约一抗。 需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。
酶标抗体法-直接法
原理：将酶直接标记在一抗上， 然后直接与相应抗原特异地结合。 形成抗原-抗体-酶复合物，最后 用底物显色剂显色。
优点：简便、快速、特异性强， 非特异性背景反应低。
缺点：浪费抗体、敏感性极低。
依靠化学连接（共价键）对酶及 抗体活性有影响。
每种抗原必须分别用其抗体的酶 标记物。
酶标抗体法-间接法
③ GOD标记抗体
（β-D-葡萄糖67mg + 硝基蓝四唑6.7mg+吩嗪甲硫酸酯 0.107mg， 37℃孵育1h。
10) 流水中终止呈色反应； 11) 复染细胞核（甲绿、苏木精）；10s 12) DAB显色标本-----树胶封固。
免疫组织化学技术(immunohistochemistry)
免疫组织化学技术（immunohistochemistry）由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起的显著特点，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景。
此方法经不断改进和发展已日趋成熟，应用范围逐渐扩大。
目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。
一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围（一） 免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫组织化学技术课件
非标记抗体免疫酶组化染色法
• 酶桥法 • PAP法 • 双桥PAP法 • APAAP法
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酶桥法原理
利用抗原和特异性抗体（第一抗体）形 成免疫反应系统，用抗抗体（第二抗体， 又称桥抗体）将抗酶抗体结合在与组织 抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在 抗酶抗体上，经显色对抗原定位、定性 和定量 。
6
酶免疫组织化学技术的概念
• 用酶标记已知抗体（抗原）与组织或细 胞标本在一定条件下反应，如果组织或 细胞中含有相应抗原（抗体），抗原抗 体结合形成复合物，复合物中的酶催化 底物显色，对抗原（抗体）进行定性、 定位和定量。
7
酶免疫组化技术的类型
1.酶标记抗体免疫组化染色法 2.非标记抗体免疫酶组化染色法
版社，2019. • 孙汶生 王福庆.医学免疫学.北京：科学出版社，2019. • 吴健民.免疫学检验-理论与临床.北京：人民卫生出版
社，2019.
•
28
免疫网站
• Immunology /imm/
• Medweb:Immunology
/medweb/medweb.immumology.h tml • National Jewish Medical and Research Center
njc.ory • All about Transplantation and Donation
/
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21
PAP法的原理
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复Байду номын сангаас物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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酶免疫组化技术的原理
酶免疫组化技术的原理
酶免疫组化技术是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定位特定的蛋白质分子在组织或细胞中的分布情况。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 抗原-抗体反应：将待检测的组织切片或细胞固定在载玻片上，并用抗原与其结合。
抗原可以是特定蛋白质、多肽或小分子化合物。
然后，在组织或细胞中加入适当浓度的抗体，与特定的抗原结合形成抗原-抗体复合物。
2. 二抗结合：在抗原-抗体复合物形成后，加入与抗体来源物种不同的第二抗体，称为二抗。
二抗通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔等，可以与抗原-抗体复合物中的抗体结合形成二抗-一抗-抗原三者的复合物。
3. 酶标记：二抗中一般会标记某种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
这些酶可以与特定底物发生反应，产生可见的颜色变化或荧光信号。
4. 底物反应：将特定酶标记的二抗加入待检测的组织或细胞中，并加入适当的底物。
酶与底物反应后，会产生染色或荧光信号。
这些信号可以在显微镜下直接观察或在酶标仪等设备中测量。
信号的强度可用来反映待检测的蛋白质分子在组织或细胞中的含量或分布情况。
通过以上步骤，酶免疫组化技术可以对待检测的蛋白质分子进行高灵敏度的定位和定量分析，广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。
免疫组织化学常用技术方法大全
ABC法特点： 法特点： 法特点 敏感性强， ■ 敏感性强，具有放大作用 特异性强， ■ 特异性强，背景染色淡 ■ 方法简便，节约时间 方法简便， ■ 由于生物素与抗生物素具有与多种 示 踪物结合的能力， 踪物结合的能力，可用于双重或多重染色
注意事项 内源性生物素活性及其消除： ● 内源性生物素活性及其消除：肝、肾、 白细胞、乳腺预先以 白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和 抗生物素和 0.01%生物素溶液分别作用 min，以消除 生物素溶液分别作用20 生物素溶液分别作用 ， 内源性生物素。 内源性生物素。 试剂的差异，应进行预实验。 ● 试剂的差异，应进行预实验。 试剂盒保存以4℃为佳。 ● ABC试剂盒保存以 ℃为佳。 试剂盒保存以
一、基本原理 抗生物素（卵白素） 抗生物素（卵白素） avidin
分子量68 分子量68 000 糖蛋白 维生素H） 生 物 素 （维生素 ） biotin 分子量 244
biotin
biotin
avidin
biotin
biotin
生物素-过氧化酶复合物技术 二、抗生物素-生物素 过氧化酶复合物技术 抗生物素 生物素
免疫组织化学常用方法大全
基本原理与操作步骤
第一节
免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中 最常用的方法， 最常用方法，它是在抗原抗体特异反 应存在的前提条件下， 应存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 在组织细胞内的存在部位。 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 ）， 织内特异性抗原反应， 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。 在光镜或电镜下观察分析。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫酶组化法
免疫酶组化法？
答：免疫酶组化法是一种通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位的技术。
根据酶标记的部位不同，免疫酶组化法可以分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等。
这种技术可以用于检测组织细胞内的特定抗原物质，通常选用免疫酶组化间接染色法。
免疫酶组化法在医学研究中具有广泛的应用，可以用于研究细胞的结构和功能，检测细胞中的蛋白质、糖类、脂类等生物大分子，以及研究细胞信号转导、细胞凋亡等生物学过程。
同时，这种技术也可以用于诊断和病原体鉴定等领域。
总之，免疫酶组化法是一种重要的生物技术，具有广泛的应用前景。
酶免疫组化技术的原理
酶免疫组化技术的原理酶免疫组化技术是一种常用于研究细胞和组织中蛋白质表达和定位的方法。
它基于酶-抗体反应的原理，利用特异性抗体与待检测蛋白质结合，再通过酶标标记的二抗或直接与待检测蛋白质结合的酶标标记的抗体，使该抗原蛋白质的位置可见并产生可检测的信号。
酶免疫组化技术主要有两大类：间接法和直接法。
间接法是最常用的免疫组化技术。
它将第一抗体与待检测的抗原蛋白结合，第一抗体作为特异性抗体，与抗原发生免疫反应。
接着，在未结合的抗体被洗去后，再加入与第一抗体相应动物种类的二抗，该二抗被标记有酶的特异性抗体与第一抗体结合，进一步放大免疫信号。
最后，通过酶的底物掺入颜色发生反应，形成染色物质，并用显微镜观察。
直接法使用直接带有酶标记的第一抗体，或者是直接以酶为标记的第一抗体与待检测的抗原免疫反应。
直接法避免了二次抗体的结合步骤，缩短了实验时间。
直接法成像的后处理步骤也相对简单。
酶免疫组化技术原理的关键是酶标记和信号放大。
酶通常被选择为标记因为它们在催化底物的转化中具有高效性和特异性，产生的产物可以形成显著的颜色染色或荧光信号。
酶標最常使用的是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），它们都能够提供高度灵敏的信号放大。
酶标记的抗体具有高度的特异性，通常是通过多克隆抗体制备，以保证其对目标抗原的高度亲和力。
当特异性抗体与待检测的抗原发生免疫反应后，酶标记的抗体可以结合到第一抗体上形成免疫复合物。
酶免疫组化技术利用这种免疫复合物的特异性结合，可以在细胞或组织中精确定位待检测的蛋白质。
信号放大是酶免疫组化技术的另一个重要原理。
通过底物的反应转化，酶催化底物的转化反应可以放大信号，形成可见的染色或荧光信号。
常用的底物通常是染色底物，如3,3'-二氨基联苯（DAB）等，在酶催化下会产生棕色的产物。
一旦形成了可见的染色信号，可以使用显微镜或图像分析系统对待检测的蛋白质进行可视化和定量分析。
总之，酶免疫组化技术是一种常用的蛋白质表达和定位研究方法。
免疫组织化学酶标法
免疫组织化学酶标法
免疫组织化学酶标法是一种常用的免疫组织化学技术，用于检测
组织或细胞中的特定蛋白质或抗原。
该方法利用酶标记的抗体与组织
或细胞中的抗原结合，然后通过酶促反应产生可检测的信号。
免疫组织化学酶标法的基本步骤包括：
1. 组织或细胞的制备：将组织或细胞固定在载玻片上，并进行切
片或细胞涂片。
2. 抗原的暴露：通过抗原修复或抗原暴露技术，使抗原在组织或
细胞中暴露出来。
3. 抗体孵育：将酶标记的特异性抗体与组织或细胞孵育，使抗体
与抗原结合。
4. 信号检测：通过酶促反应产生可检测的信号，例如颜色变化或
荧光信号。
5. 结果分析：通过显微镜观察组织或细胞中的信号分布和强度，
进行结果分析。
免疫组织化学酶标法具有高灵敏度、高特异性和高重复性等优点，广泛应用于生物医学研究、诊断和治疗等领域。
免疫酶组化法
免疫酶组化法
免疫酶组化法（Immunohistochemistry, IHC）是一种在组织切
片中使用抗体和酶的方法，用于检测特定抗原的存在和分布。
免疫酶组化法可用于研究细胞和组织中的蛋白质表达、定位和定量分析。
免疫酶组化法基本步骤包括：
1. 常规染色处理：包括组织固定、脱水、脱脂、石蜡包埋和切片。
2. 抗原修复：使用不同方法（如热处理或酶处理）来恢复被固定的组织中的抗原的结构，以提高抗原的可见性。
3. 抗体染色：将特定抗体与抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
4. 辅助抗体处理：在抗体与抗原结合后，使用与辅助抗体标记的酶来增强抗原的可见性。
5. 底物反应：将适当的底物添加到组织切片中，底物与标记的酶反应产生可见的染色。
常用的底物包括DAB（二氨基苯）、AP（碱性磷酸酶）和HRP（过氧化物酶）等。
6. 染色反应结束后，组织切片可进行显微镜观察和图像分析。
免疫酶组化法可用于研究各种疾病相关的蛋白质标记，如肿瘤标志物、细胞膜受体、细胞因子和细胞凋亡标记等。
通过检测特定抗原在组织中的表达和定位，可以提供关于疾病发展和治疗效果的重要信息。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
病理学中的免疫组织化学技术
病理学中的免疫组织化学技术免疫组织化学技术是病理学中常用的一种技术，它利用特异性抗体来检测并鉴定组织中的特定细胞或分子。
这种技术在肿瘤学、免疫学、神经科学等领域得到广泛应用，并且对于疾病的早期诊断、治疗有着重要的作用。
免疫组织化学技术是在组织学的基础上发展起来的一种技术，它利用特异性抗体识别组织中的不同成分，并将它们染色或标记。
目前常使用的免疫组织化学技术主要有免疫荧光、免疫酶标记、免疫金标记等。
免疫荧光是一种利用荧光染料标记抗体或标记物并将其显色的技术。
它可以快速、准确地鉴定出组织中的不同分子或细胞，并可以通过多重荧光染色技术同时检测出多种分子，从而实现复杂的研究目的。
免疫荧光技术在病理学中的应用十分广泛，包括免疫球蛋白的分布、肿瘤细胞的识别和定位、免疫细胞的分布和功能等。
免疫酶标记是一种将酶标记物（如过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记在抗体或其他分子上，然后通过酶促反应将其染色或显色的技术。
这种技术可以用于特定细胞或分子的定量分析，可以通过数字化显微镜来定量计算染色强度等参数。
在肿瘤学中，免疫酶标记技术常被用来鉴定肿瘤细胞的种类和分化程度，以及进行肿瘤的分子分型。
免疫金标记技术是一种将金标记物标记在抗体或标记物上，然后通过放大或显色等方式来进行检测的分析技术。
这种技术的优点在于其对细胞结构和分子的高分辨率显微镜观察，同时可通过计算机数字化技术实现图像分析和处理。
在神经科学领域中，免疫金标记技术常被用于观察神经元的形态和分布，以及神经递质的定位和释放。
总之，免疫组织化学技术在病理学中得到了广泛应用。
这种技术的出现和发展，为疾病的诊断、治疗和研究提供了有力的工具，同时也为未来疾病防治的研究和治疗提供了新的思路和可能性。
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呈色反应注意要点：
① 底物浓度： 应够高，保证最大反应速度; ② pH值： 满足酶活性的最适pH，常由缓冲液提供; ③ 温度： 室温即18℃-22℃，或37℃； ④ 时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制，
以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可 终止反应。
（二）染色程序
1 直接法（冰冻切片）
1）新鲜组织切片,冷丙酮固定10min,干燥后,入PBS。
2）0.3％H2O2 -甲醇液处理30’,封闭内源性过氧化物酶; 3）0.0l mol／LPBS洗3次。
4) 5％-10％正常羊血清室温处理30min。
5) 1:50-1:100 HRP-标记抗体, 37℃孵育60’或4℃过夜。 6) 0.0l mol／L PBS洗3次。 7) DAB／H2O2显色(新鲜配制)。 8) 0.01mol／LPBS洗3次。 9) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。
酶标抗体法-间接法
原理：将酶标记在二抗上，先将 一抗与相应的抗原结合，形成抗 原抗体复合物，再用二抗(酶标抗 体)与复合物中的特异抗体结合， 形成抗原-抗体-酶标抗体复合物， 最后用底物显色剂显色。 优点：只需一种酶标抗体即可 。 缺点：敏感性低，但优于直接法。 依靠化学连接对酶及抗体活性有 影响。
2 间接法
1) 石蜡切片脱蜡至水；
冰冻切片
3) PBS漂洗
室温干燥--丙酮固定----缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂
2) 甲醇双氧水室温处理切片15～30min,封闭内源性过氧化物酶活性。
4) 0.1％～1％牛血清白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育15～25’,然后吸去孵育 液,不冲洗.
5%～10％正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育15～20’然后吸去。
酶标抗体法-直接法
原理：将酶直接标记在一抗上， 然后直接与相应抗原特异地结合。 形成抗原-抗体-酶复合物，最后 用底物显色剂显色。
优点：简便、快速、特异性强， 非特异性背景反应低。 缺点：浪费抗体、敏感性极低。 依靠化学连接（共价键）对酶及 抗体活性有影响。 每种抗原必须分别用其抗体的酶 标记物。
3 GOD(葡萄糖氧化酶)：
以β-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为
HRP的催化底物，最后仍可用DAB显色。 适用于两种酶的放大技术： 即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是 小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗
体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又 含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。
5)滴加PBS适当稀释的第一抗体,湿盒内孵育,或4℃过夜,或室温2～4h。
6) PBS充分冲洗 7) 滴加适当稀释的酶标第二抗体,湿盒孵育45～60’(室温或37℃)。 8) PBS漂洗(3次,每次2-5’)。
9)显色： ① HRP标记抗体（0.01-0.1% H2O2 + 0.01-0.5％DAB液） ② ALP标记抗体 （2mg磷酸萘酚AS-MX+0.2ml二甲基甲酰胺，用前加坚牢红TR盐)。 切片入此液,室温10～15’。 ③ GOD标记抗体 （β-D-葡萄糖67mg + 硝基蓝四唑6.7mg+吩嗪甲硫酸酯0.107mg， 37℃孵育1h。 10) 流水中终止呈色反应； 11) 复染细胞核（甲绿、苏木精）；10s 12) DAB显色标本-----树胶封固。 其它------------水溶性介质(如甘油明胶)封固。 13) 镜检结果：按上法HRP阳性者呈棕色，ALP法阳性者呈红 色，GOD法阳性者呈蓝色。
一、酶标抗体免疫组织化学染色法
（一）原理 直接法和间接法。
直接法--是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。 间接法---两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体,并且已用酶标记。 (注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因 为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。)
第三章 免疫酶组织化学技术
免疫酶组织化学技术
酶------辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶…… 酶标记已知Ab(或Ag) + 组织细胞内相应的Ag(或Ab)
抗原抗体复合物(酶标) 底物
有色沉淀 定位； 图像分析仪半定量
免疫组化方法
酶标抗体免疫组织化学 直接法 间接法
非酶标抗体免疫组织化学
酶桥法 PAP法、APAAP法
免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记
的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶 性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确 定该抗原的性质、存在的部位和含量。
显色反应 :
酶 + 底物====不溶性的色素
标记酶: 辣根过氧化物酶 (HRP) 碱性磷酸酶(ALP) 葡萄糖氧化酶(GOD) β-D-半乳糖苷酶……
2
碱性磷酸酶
ALP：
显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚 AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等 偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被 抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高 特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明 确。
1 辣根过氧化物酶 HRP：
2
碱性磷酸酶
Байду номын сангаас
ALP：
显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚 AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等 偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被 抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高 特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明 确。
1 辣根过氧化物酶 HRP：
显色：产物棕褐色 HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。 DAB性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期 保存。可致癌，可将DAB制成10倍浓度储存液，分装后-20℃ 贮存。 注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着色 浓缩的DAB—按照说明书；注意校正蒸馏水的PH值； 粉剂DAB----溶解时滤去不溶性颗粒； 现用现配---保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加H2O2