溶菌酶结晶的研究进展

第 20 卷第 3 期
陶凤云等 :溶菌酶结晶的研究进展
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次成核 ,普遍认为起决定作用的有两种机理 :流体 剪应力成核及接触成核 。到目前为止 ,还不能给出 二次成核的理论模型 ,因此通常用经验公式来描 述[22 ] 。
对于晶体生长 ,目前大多应用扩散 - 表面反应 晶体生长的二步过程理论 , 并结合二维成核 ( the two2dimensional nucleation) [23] 、螺 旋 断 层 ( the spiral dislocation) 和 岛 屿 生 长 过 程 ( the process of island growth) 等机理来描述[24] 。 21214 晶体的观测方法
1 溶菌酶的结构 、性质 、稳定性及应 用
溶菌酶又称胞壁质酶 ,味甜 、易溶于水 ,不溶于 有机溶剂[2] ,常与 Cl - 结合成氯化物 。溶菌酶分子 带 10 个正电荷 ,分子中精氨酸 、天冬氨酸和色氨酸 的含量高 ,酪氨酸的比例则低 。溶菌酶广泛地分布 于自然界中 ,以鸡蛋清中含量最多 。根据来源不 同 ,其性质及作用机制略有差异 ,可分为以下几种 : 1) 鸡蛋清溶菌酶 ;2) 人及哺乳动物溶菌酶 ;3) 植 物溶菌酶 ;4) 微生物产生的溶菌酶 。
结晶机理包括晶核形成和晶体生长机理 。 成核包括初级成核和二次成核 ,初级成核按照 经典成核理论给出了临界晶核形成速率[21] ;对于二
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溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织 中的非特异性免疫因素 ,具有多种药理作用 ,它具 有抗菌 、抗病毒 、抗肿瘤的功效 。目前日本已生产 出医用溶菌酶 ,其适应症为出血 、血尿 、血痰和鼻炎 等 。溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能 ,以此 酶处理 G+ 细菌得到原生质体 ,是基因工程 、细胞工 程中细胞融合操作必不可少的工具酶 。溶菌酶是 一种无毒 、无副作用的蛋白质 ,又具有一定的溶菌 作用 ,因此可用作食品防腐剂 。现已广泛应用于水 产品 、肉食品 、蛋糕 、清酒 、料酒及饮料中的防腐 ;还 可以添入乳粉中 ,使牛乳人乳化 ,以抑制肠道中腐 败微生物的生存 ,同时直接或间接地促进肠道中双 歧杆菌的增殖 。此外 ,还能利用溶菌酶生产酵母浸 膏和核酸类调味料等 。
许多学者对溶菌酶的结晶条件及影响因素进 行了研究 ,探讨了最优结晶条件 。Lu 等[14] 研究了 沉淀剂 、温度和添加剂对溶菌酶的溶解度 、暴露成
核的临界过饱和度和晶体形状的影响 。结果表明 , 对于溶菌酶的结晶 ,氯化钠作为沉淀剂是更有效 的 ,溶菌酶的结晶和温度有很大关系 ,逐渐变化的 温度 能 导 致 溶 菌 酶 更 好 的 晶 习 和 质 量 。Sauter 等[15] 研究了 50 多种化合物作为添加剂时对溶菌酶 结晶的影响 。结果表明 ,海藻糖能够明显提高母鸡 蛋白溶菌酶 ( HEWL) 的成核率 ,短链醇和多羟基化 合物对晶习和成核率有中等程度的影响 。糖 、乙 醇 、离子 、聚胺 、表面活性剂等能提高分子稳定性 、 成核和生长及质量 。阴离子是决定溶菌酶溶解性 和结晶空间簇的主要沉淀类型 。研究发现小鸡蛋 白溶菌酶 (CEWL) 浓度在 60～190 mgΠmL 范围内时 , 在酸性和碱性 pH 下能从铵 、钠 、钾 、铷 、镁和锰的硫 酸盐里结晶出来[16] 。Forsythe 等[16] 在不同条件下 制备了四种不同晶形 (四角形 、三角形 、正交 、单斜 晶系) 的小鸡蛋白溶菌酶晶体 ,发现在酸性 pH 下 , CEWL 仅能从硫酸根阴离子溶液中结晶 ;在中性缓 冲溶液里 ,CEWL 能被各种无机硫酸盐结晶 。磷酸 盐 、醋酸盐 、碳酸盐 、氯化物 、溴化物 、柠檬酸盐 、硝 酸盐 、碘化物 、硫氰酸根盐等的阴离子 ,也能结晶小 鸡蛋白溶菌酶 。Fermani 等[17] 以包括可电离基团的 聚合体膜 、吸附了聚 L - 赖氨酸或聚 L - 天冬氨酸 盐的交联凝胶膜和吸附了聚 L - 赖氨酸或聚 L - 天 冬氨酸盐的蚕丝蛋白等作为蛋白质非均相成核的 表面 ,进行了小鸡蛋白溶菌酶的结晶实验 。戴等[18] 用动态光散射法研究了 NaCl 为沉淀剂时 ,不同浓 度的 NaCl 对液 - 液扩散法生长溶菌酶晶体的影 响 ,并测量了晶体生长前后体系的 Zeta 电势 。结果 表明 ,NaCl 浓度较高时 ,溶液中一直存在较大的聚 集体 ,生长出的晶体质量较差 。在合适的 NaCl 浓 度下 ,溶液中溶菌酶的大的聚集体发生解聚集 ,生 长出的晶体质量较高 。2005 年 ,Curcio 等[19] 又研究 了不同洗脱液流速下溶菌酶的动态膜结晶 ,并进行 了结晶动力学分析 。结果表 明 , 温 度 为 5 ℃、3 % NaCl ( WΠV ) 、10 %MgCl2 ( WΠV) 时 ,在 1 100 μmΠs 的 洗脱液流速下 ,晶体生长速率达到最大值 。由于蛋 白质溶液的成核及结晶过程被不断变化的浓度控 制 ,因此 , Pullara 等[20] 尝试通过控制液 - 液分层区 的不规则波动来控制溶菌酶的结晶速率 ,取得了很 好的效果 。 21213 结晶机理的研究
溶菌酶是一种在食品 、医学、生物工程等多种领 域中用途非常广泛的蛋白质 ,目前实际应用的、业已 商品化的是鸡蛋清溶菌酶 。鸡蛋清溶菌酶容易生长 出单晶 ,自 1946 年 Alderton 报道生长出四方晶系的 溶菌酶晶体后 ,溶菌酶作为一种重要的模型蛋白已 被广泛应用于蛋白质结晶机理和方法的研究 。
鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的 314 %～315 % , 作为溶菌酶类的典型代表 ,是目前重点研究的对 象 ,也是了解最清楚的溶菌酶之一 。它是由 18 种
129 个氨基酸残基组成的一条单肽链 ,分子形状呈 扁长 椭 圆 体 , 具 有 4 对 S —S 键 , 其 分 子 量 为 14 307 Da[3] ,最 适 pH 为 6 ～ 7 , 等 电 点 PI 1015 ～ 1112 。在 pH 4～7 、100 ℃处理 1 min 不失活性 ,是一 种比较稳定的碱性球蛋白 。溶菌酶产品活力 ≥118 万 UΠmg ,溶于稀盐水 ,在丙酮和乙醇作用下生成沉 淀 。在酸性溶液中比较稳定 ,加热至 55 ℃也不会受 到影响 ,可以耐热至 100 ℃。在碱性溶液中则随浓 度 、温度的升高而丧失其酶活力 。溶菌酶的水溶液 在 6215 ℃、30 min 会完全失活 。
2 溶菌酶结晶的研究进展情况
211 溶菌酶的早期研究 1946 年 Alderton 报道生长出四方晶系的溶菌
[ 收稿日期 ] 2006 - 02 - 23 [ 作者简介 ] 陶凤云 (1970 —) ,女 ,北京市人 ,北京联合大学生物化学工程学院讲师 ,主要研究方向为生物化工 、天然产 物生物活性 。
(1. 北京联合大学 生物化学工程学院 ,北京 100023 ; 2. 北京化工大学 生命科学与技术学院 ,北京 100029)
[ 摘 要 ] 溶菌酶作为一种重要的模型蛋白被广泛应用于蛋白质结晶机理和方法的研究 。概括 了溶菌酶的结构 、性质及应用 ,总结了溶菌酶的常用结晶方法 ,探讨了近年出现的新的结晶方法 , 介绍了结晶条件 、结晶机理及主要的观测方法 ,展望了溶菌酶结晶过程的发展前景 。 [ 关键词 ] 溶菌酶 ;结晶 ;蒸发扩散 ;膜结晶 [ 中图分类号 ] Q 814 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 100520310 (2006) 0320037204
目前 ,对溶菌酶结晶的研究主要集中在结晶方 法的创新 、结晶条件的优化 、结晶机理的研究和观 测方法等方面 。 21211 结晶方法的创新
结晶方法很多 ,可分为批量结晶 、蒸发扩散结 晶 (悬滴法Π座滴法) 、液Π液扩散结晶和透析结晶[7] 。 另外 ,还有凝胶扩散结晶 、水热法及溶剂热法结晶 、 升华结晶[829] 和膜结晶[10] 等 。溶菌酶结晶的常用方 法主要是批量结晶和蒸发扩散结晶 。近几年 ,人们 尝试用膜结晶法结晶溶菌酶 ,结果制得了质量较好 的适合于衍射分析的溶菌酶晶体 。
2006 年 9 月 第 20 卷第 3 期总 65 期
北京联合大学学报 (自然科学版) Journal of Beijing Union University(Natural Sciences)
Sep . 2006 Vol. 20 No. 3 Sum No. 65
溶菌酶结晶的研究进展
陶凤云1 ,张新妙2 ,马润宇2
对于生物大分子的具体结构的了解可以揭示 它们的功能 ,这在新药设计以及改变分子结构使之 具有更高的工业应用潜力方面是非常有用的 。X 射线 衍 射 是 确 定 蛋 白 质 三 维 空 间 结 构 的 有 效 方 法[1] ,但是只有当得到合适的晶体时才可以用这样 的方法 。结构测定常常由于得不到高质量的晶体 而受到阻碍 。质量较好的蛋白质晶体的获得是蛋 白质进行结构分Leabharlann Baidu的重要前提 。
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北京联合大学学报 (自然科学版)
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酶晶体 。后来 ,Pusey[4] 用接种法测量了溶菌酶溶解 度随温度的变化 , Rosenberger[5] 用配液法测量了溶 菌酶 溶 解 度 和 pH 值 的 关 系。在 此 基 础 上 , Howard[6] 测定了不同 NaCl 浓度下溶菌酶的溶解度 。 20 世纪 80 年代初 ,人们已经得到溶菌酶溶解度随 温度 、pH 值变化的三维曲面图 。 212 近来对溶菌酶结晶的研究
1) 显微镜观测法 。显微镜是最直接的观测方 法 ,通过显微镜可以观测晶体形貌 ,确定结晶诱导 时间 、成核及生长速率和晶体尺寸分布等 。原子显 微镜可以观测物体表面的形貌 ,其分辨率达到纳米 级 ,是研究生物样品形貌极为有用的工具 。显微镜 观测方法简单易行 ,但是存在一定的人为和系统误 差[25 ] 。
意大利的 Curcio 等对膜结晶法结晶溶菌酶作 了一系列研究 。2002 年 ,Curcio 等[11] 将渗透膜结晶 的方法用于溶菌酶溶液的结晶 ,制得了溶菌酶晶 体 。实验中以 NaCl 为沉淀剂 ,MgCl2 溶液为洗脱 液 ,以醋酸钠缓冲溶液调节溶菌酶溶液的 pH 值 。 用静态膜结晶 , 温度为 4 ℃,MgCl2 浓度为 16 %～ 22 % ( WΠV ) ,NaCl 浓度高于 115 %时 ,一天后可见 溶菌酶晶体生成 ;而连续式膜结晶中 ,数小时后就 得到了大量溶菌酶晶体 。2003 年 ,Curcio 等[12] 在上 述基础上 ,考察了沉淀剂浓度 、洗脱液浓度 、蛋白质 溶液温度对溶菌酶膜结晶过程中通量的影响 。实 验主要研究了静态膜结晶 ,得到了适合于衍射分析 的四角形溶菌酶晶体 。当 NaCl 和 MgCl2 浓度分别 在 2 %～415 % 和 16 %～22 % 范围内时 ,24 h 内得 到了尺寸在 013～015 mm 范围内的晶体 。然而 ,将 静态膜结晶得到的结晶条件用于连续式膜结晶 ,仅 得到了大量尺寸较小 ( < 011 mm) 的溶菌酶晶体 。 同年 ,Profio 等[13] 用混浊度评价了微孔疏水膜的溶 菌酶结晶动力学 ,探讨了 NaCl 和 MgCl2 浓度对晶体 成 核 和 生 长 速 率 的 影 响 。在 20 ℃, 20 mgΠmL HEWL ,2 %和 215 % NaCl ,24 %MgCl2 条件下 , 得到 了适合于衍射分析的溶菌酶晶体 。 21212 结晶条件的优化