通用性配体亲和层析法

4 ．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。 具体要求须根据分离物的性质而定： • 当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可 提高结合容量； • 当分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基 质对改善分离效果有利。 一般亲和吸附剂采用的基质有：纤维素、聚丙烯酰胺 凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻 璃珠。
因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广泛使用的一种 基质。
二、配体的选择 可选择的配体有： 抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)蛋白质复合物抗体]、 其他物质 ( 如外源凝集素、 polyA、polyU、染料和金 属离子)等。
优良的配体须具备两个条件： 1）与纯化的物质有较强亲和力 一般来说， 配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数）或 Ka（解离常数） 较小 ) ，在亲和层析中应用的价值就 越大。 2）具有与基质共价结合的基团 该基团和基质结合后，对配体与互补蛋白的亲和力没 有影响或影响不明显。 就目前所知，可用作配体的种类很多，表7-2。
三、亲和吸附剂的制备 把配体偶联到基质上的方法有两类： 物理的（如包埋法和吸附法等） 化学的（如偶联法和交联法等）
交联法： 是用双功能试剂(如戊二醛、碳化二亚胺等)交联基质和配体。 偶联法： 常用的化学试剂有： 溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜和亚氨二 乙酸等， 用其活化的基质与配体偶联，或者用其把基质与配体螯合起来
第七章 亲和层析
一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的 主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。 缺点： 由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度稍高的物 质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终 收得率却甚低。
1967年Axen等 用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成 功地制备了固定化酶。 这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯 化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐 步得到了广泛的应用。 这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速 和高效(见表7-1)。
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
第二节 操 作
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响；
相比之下，实践中应用较多的基质是： 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、 多孔性玻璃珠、 琼脂糖珠(Sepharose 4B)。 三种基质中，目前应用最多的是： Sepharose 4B
• Sepharose • 由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；
• 它基本上能符合理想基质的五点要求； • 同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的 基团； • 在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大 分子物质，且吸附容量也较大； • 此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械 强度比Sepharose 2B好。
层析分离过程： • 样品过柱时， 样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、 范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载 体上; 无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出 来，并形成了第一个层析峰； • • 然后，恰当地改变起始缓冲液的 pH值、 或增加离子强度、 或加入抑制剂等因子， 即可把物质 S 从固相载体上解离下来，并形成了第二 个层析峰(见图7-2B)。
第一节 基本原理
M-L-S复合物 欲分离的大分子物质S 与相对应的专一物质 L( 配体 ) 以次级键结合（亲和 力）， 能生成一种可解离的络合物L-S， 其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合， 而形成M-L-S复合物。 亲和吸附剂 配体L以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M 上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。
亲和层析法 根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的 层析方法，称为亲和层析法(affinity chromatography)。
亲和层析的原理(见图7-1)：
• 每对反应物之 间都有一定的 亲和力。 正如在酶与底物 的反应中，特 异的底物(S’)才 能和一定的酶 (E) 结合，产生 复合物 (E-S’) 一 样。 • 在亲和层析中 是特异的配体 才能和一定的 生命大分子之 间具有亲和力， 并产生复合物。
溴化氰偶联法 主要包括： • 1.活化 • 2.偶联 • 3.除去未结合的配体 • 4.配体结合量的测定等步骤。
1．活化基质
• 在一定量的贮存基质Sepharose 4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加 入等量的蒸馏水Hale Waihona Puke Baidu2mol／L Na2C03溶液(pHll~12)，混匀。 • 另将称量的固体 CNBr(50~300mg／g 贮存胶 ) 溶于二甲基甲酰胺溶 液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其 pH值始终维持在11~12之间。 • 接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的预冷 水及0.07mol／L NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。