高级生化-蛋白质综述
生化-蛋白质思维导图脑图
蛋白质4分子组成
组成元素
主要元素
其他元素
各种蛋白质含氮量接近，平均为16%
100克样品中蛋白质含量=每克样品含氮数*6.25*100
20种L-α-氨基酸【除甘氨酸—无手性】
非极性脂肪族氨基酸
极性中性氨基酸
芳环氨基酸
酸性氨基酸
碱性氨基酸
特殊氨基酸脯氨酸
亚氨基酸
半胱氨酸
胱氨酸两分子半胱氨酸脱氢形成二硫键氨基酸的理化性质
两性解离等电点PI
阳离子PH<PI
兼性离子PH=PI
含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收的性质
色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在280nm附近
蛋白质定量分析
茚三酮
蓝紫色，570nm
氨基酸定量分析
肽键连接
氨基酸→肽
二肽
寡肽2-20
多肽>20多肽链有两端
N末端
C末端
蛋白质>50蛋白质是由许多氨基酸残基组成、折叠成特定的空间结构、并具有特定生物学功
能的多肽
氨基酸残基1生物活性肽
谷胱甘肽GSH
多肽类激素及神经肽体内许多激素属于寡肽或多肽
分子结构
一级
氨基酸排列顺序N-C
肽键，二硫键
空间构象和特异生物学功能的基础，决定蛋白质空间结构的因素之一
氨基酸序列异常—分子病
镰刀型红细胞贫血
蛋白酶水解破坏一级二级
某段肽链的局部空间结构，即主链骨架原子的相对空间位置2
氢键
肽单元
α-螺旋
右手螺旋顺时针
每圈3.6个氨基酸残基，螺距=0.54nm半口（0.54nm）吃掉三个半麻花(3.6)
氢键与长轴平行
氨基酸侧链在外侧，肽链在内侧
β-转角
肽链内形成180°回折
含四个氨基酸残基，第一个与第四个形成氢键
第二个氨基酸残基通常为脯氨酸Pro20种氨基酸的小弟（亚氨基酸），容易弯腰
I型
II型第三个甘AA即Gly
王艳萍版生化名词解释 第一章蛋白质
生化名词解释-王艳萍版
第一章蛋白质
1.蛋白质:由L型α-氨基酸(20种编码氨基酸)通过肽键构成并具有稳定的构象和生物学功能的一类复杂高分子含氮化合物。
2.α-氨基酸:是在α-碳原子上含有一个碱性氨基(—NH2)和一个酸性羧基(—COOH)的有机化合物(脯氨酸为α-亚氨基酸)。氨基酸是蛋白质的构件分子。
3.构型:一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。在立体化学中，因分子中存在不对称中心而产生的异构体中的原子或取代基团的空间排列关系。有D 型和L型两种。构型的改变要有共价键的断裂和重新组成,从而导致光学活性的变化。
4.构象:分子中由于共价单键的旋转所表现出的原子或基团的不同空间排列。指一组结构而不是指单个可分离的立体化学形式。构象的改变不涉及共价键的断裂和重新组成，也无光学活性的变化。
5.必需氨基酸:指人(或其他脊椎动物)生长发育所必需的，但自身不能合成或者合成的量不足,必需由食物中供给的氨基酸。人体必需氨基酸有苯丙氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸)、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等8种。
6.非必需氨基酸:指人(或其他脊椎动物)生长发育所必需的，自身能合成,不需要依赖食物中供给的氨基酸。
7.半必需氨基酸:人体合成精氨酸、组氨酸的能力不足以满足自身的需要,需要从食物中摄取一部分。
8.非蛋白质氨基酸:除组成蛋白质的氨基酸外,迄今发现150余种非蛋白质氨基酸,例如鸟氨酸、瓜氨酸、γ-氨基丁酸，这些非蛋白质氨基酸有些是代谢中间产物，有些是结构成分等。
9.两性(酸碱性)离子:两性离子是指在同一分子中,既有能放出质子的基团，又有能接受质子的基团。
高级生化实验报告三
实验三蛋白质分子量的测定凝胶层析法
一、原理
凝胶层析法(即凝胶过滤法，gel filtration)是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析(molecular sieve chromatography)、排阻层析法(exclusion chromate- -graphy)。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大
小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，他们的内部都有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶(商品
名Bio-gel-P)和葡聚糖凝胶(Sephadex G)，后者的商品名为Sephadex型的各种交
联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高，空隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的空隙大，适于分离大分子物质。利用这种物质可分离不同分子量的物质。
生物化学-生化知识点_蛋白质结构与功能的关系(6章)
1.9 蛋白质结构与功能的关系： P252，第六章
从厌氧生物转化为好氧生物是生物进化中的一大进步。脊椎动物中血红蛋白在血液中起到载氧和输氧的作用，肌红蛋白在肌肉中起贮氧和氧在肌肉中分配的作用。
一一一肌红蛋白（Mb）的结构与功能
一1一三维结构：由一条多肽链和一个血红素辅基构成，相对分子量1670 0，含153个氨基酸残基。分子中多肽链由8段α-
螺旋组成，分子结构致密结实，带亲水基团侧链的氨基酸分布在分子外表面，疏水氨基酸侧链几乎全埋在分子内部，见P253 图6-1。
一2一辅基血红素：由二价铁和原卟啉Ⅸ组成，原卟啉Ⅸ由4个吡咯环组成，见P254 图6-2。
铁原子只有亚铁态的蛋白质才能结合氧。蛋白质提供疏水洞穴，固定血红素基，保护血红素铁免遭氧化，为氧提供一个结合部位。结合氧只发
生暂时电子重排。
一一一血红蛋白(Hb)的结构与功能
一1一血红蛋白由4个多肽链（亚基）组成，如α2β2（成人血红蛋白HbA），每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位，α-链有141个残基，β-
链有146个残基，且α链、β链和Mb的三级结构都非常相似（P259 图6-
9）。实际上对于人的这三种多肽链分析发现只有27个的残基是共有的，这表明蛋白质高级结构的保守性。只要功能相同（都与氧结合），高级结构就相似，有时甚至是唯一的。
血红蛋白与肌红蛋白结构上最大不同在于血红蛋白有四级结构，是四聚体，，而肌红蛋白只有三级结构。因此血红蛋白运载氧能力增强，还能
运载H+和CO2，在氧分压变化不大范围内完成载氧和卸氧工作。且Hb为变构蛋白，可受环境中其他分子，如H+，CO2和2，3-
高级生化-蛋白质综述
摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域
新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学
Abstract：Proteomics which is the new discipline in the time of the post-genomics develops rapidly in the life science．The present paper has documented the current situation and new development of the techniques of separation and identification in this area，including 2·dimensional gel- electro·phoresis，chromatography an d mass spectrometry．
Key words：Proteomics；2-Dimensional gel electrophoresis；Chromatography；Mass spectrometry；Bioinformatics
1、概念及相关内容
随着人类基因组测序计划的完成,生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究,并产生了一门新的学科———蛋白质组学(proteomics) 。“蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家Marc Wilkins 和Keith Wil2liams[ 1 ] 最早提出的,是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的
生化第3章_蛋白质_2
坏，引起天然构象解体。变性不涉及共价键（肽键和
二硫键），一级结构保持完好。
变性蛋白质通常
是固态，不溶于水和 其它溶剂，不可能恢
复其原有性质，蛋白
质的变性是不可逆沉 淀。引起变性的主要 因素是热、紫外光、 激烈的搅拌以及强酸
和强碱等。
蛋白质变性过程中出现的现象：
(1) 生物活性丧失：生物活性即蛋白质具有的酶 (enzyme)、 激素(hormone)、毒素(toxin)、抗原与抗体等活性。变性使
1.简单蛋白(simple protein) ：
单纯蛋白质只含 α- aa 组成的肽链，不含其它成分。
（1）清蛋白(albumin)和球蛋白(globulin)：广泛存在于动物组
织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 （2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不 溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70 ~ 80％乙醇中。 （3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 （4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分 为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。
• 蛋白质电泳的泳动速率 (electrophoretic mobility) 取决于荷质比 （净电荷、大小、形状） • 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图 • 测出待测样品的迁移率
• 从标准曲线上查出样品的相对分子质量
生物化学与分子生物学-生化综述
生物化学综述
题目：院系：专业：蛋白质泛素化修饰及其
生命科学技术学院
生物化学与分子生物
应用
姓名：学号：
蛋白质泛素化修饰及其应用
纲要：泛素 - 蛋白酶系统统 (Ubiquitin-proteasome system, UPS)介导了真核生物 80%~85%的蛋白质降解 , 该蛋白质降解门路拥有依靠ATP、高效、高度选择性的特色。除参加蛋白质降解以外, 泛素化修饰还可以够直接影响蛋白质的活性和定位。因为泛素化修饰底物蛋白在细胞中的宽泛存在, 泛素化修饰能够调控包含细胞周期、细胞凋亡、转录调控、 DNA 损害修复以及免疫应答等在内的多种细胞
活动。 p53、 NF－κ B 和 GADD45α是在细胞应激损害反响中拥有宽泛调控作用的信号蛋白，发生在这些分子上的泛素化修饰反响是它们发挥有关分子体制的重
要基础。
重点词：泛素化； p53；NF－κ B；GADD45α；细胞应激
1蛋白质的泛素化修饰反响
1.1 泛素及泛素化
泛素 (Ubiquitin)是一种由76个氨基酸构成、在真核生物中宽泛存在并具
有高度守旧性的多肽[1]。一个或多个泛素分子在一系列酶的作用下与底物蛋白质分子共价结合的翻译后修饰过程称为泛素化修饰(Ubiquitination/Ubiquitylation)。泛素化修饰最早被发现的功能是标志靶蛋
白 , 使之被蛋白酶体辨别并降解 , 整个过程波及泛素分子、底物蛋白、多种酶系统( 如泛素激活酶 (Ubiquitin-activating enzyme,E1) 、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、泛素连结酶 (Ubiquitin-protein ligase, E3)、去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme, DUB)), 以及蛋白酶体, 它们共同构成了泛素- 蛋白酶系统统(Ubiquitin-pro-easome system, UPS)。泛素 - 蛋白酶系统统介导了真核生物体内 80%~85%的蛋白质降解 , 该蛋白质降解门路拥有依靠ATP、高效、高度选择性的特色。
生化蛋白质
22
7.受体蛋白 8.支架蛋白 9.结构蛋白 10异常蛋白
上午5时52分
23
蛋白质具有重要的生物学功能
1）酶的生物催化作用
上午5时52分
24
2）调控作用
参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等 参与代谢调控：如激素或生长因子等
上午5时52分
25
3）运动与支持
机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等
上午5时52分
糖核蛋白等。
（5）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋
白、上午角5时蛋52分白、弹性蛋白、丝心蛋白等。
21
2.1.3 根据功能分类
1.酶 如蛋白酶 2.调节蛋白 如激素 3.贮存蛋白质 如卵清蛋白 4.转运蛋白 如血红蛋白 5.运动蛋白 如肌球蛋白、肌动蛋白 6.防御蛋白和毒蛋白
上午5时52分
上午5时52分
32
2.2.1 L-氨基酸的通式
COO-
R
C +NH3
H
上午5时52分
33
既有氨基，又有羧基的小分子有 机物称为氨基酸。
α－氨基酸就是氨基连接在羧酸 的α－碳原子上。
上午5时52分
34
基本氨基酸中，除脯氨酸和 甘氨酸外其余均属于L-α-氨基酸。
例外：
COOH │
H2N — C — H │
上午5时52分
生化第一章蛋白质的结构和功能
第一章，蛋白质的结构与功能
本章要点
一、蛋白质的元素组成：主要含有碳、氢、氧、氮、硫。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％，蛋白质是体内的主要含氮物质。
1.蛋白质的动态功能：化学催化反应、免疫反应、血液凝固、物质代谢调控、基因表达调控和肌收缩等。
2.蛋白质的结构功能：提供结缔组织和骨的基质、形成组织形态等。
二、氨基酸
1.人体内所有蛋白质都是以20种氨基酸为原料合成的多聚体，氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
2.存在于自然界中的氨基酸有300余种，但被生物体直接用于合成蛋白质的仅有20种，且均属L-α-氨基酸（除甘氨酸外）。
3.体内也存在若干不参与蛋白质合成但具有重要作用的L-α-氨基酸，如参与合成尿素的鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸代琥珀酸。
4.20种氨基酸根据其侧链的结构和理化性质可分为5类：
⑴非极性脂肪族氨基酸：侧链只有C、H原子。
⑶含芳香环的氨基酸：侧链中有了芳香环。
⑷酸性氨基酸：侧链中有了羧基。
芳香族氨基酸中苯基的疏水性较强，酚基和吲哚基在一定条件下可解离；酸性氨基酸的侧链都含有羧基；而碱性氨基酸的侧链分别含有氨基、胍基或咪唑基。
5.20种氨基酸具有共同或特异的理化性质：
⑴氨基酸具有两性解离的性质。
①所有氨基酸都含有碱性的α-氨基和酸性的α-羧基，可在酸性溶液中与质子（H＋）结
合呈带正电荷的阳离子（），也可在碱性溶液中与（OH-）结合，失去质子变成带负电荷的阴离子（）。
②氨基酸是一种两性电解质，具有两性解离的特性。
③在某一PH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，
生化 第二章 蛋白质化学
PrPsc β-折叠
正常
疯牛病
第四节 蛋白质的理化性质
牛奶
一、两性电离和等电点
蛋白质两端有—NH2、—COOH，因此有两性。
pr—COOH pr—COO—+ H+ 释放出H+ [H+] pH 酸式电离成负离子
pr—NH2+H2O pr—NH3 ++OH— 接受H+ [H+] pH 碱式电离成正离子
c.将B链第28～30位氨基酸残基切去，其活性仍能维持100%。
例：疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神 经退行性病变。 正常PrP富含α-螺旋，称为PrPc。在某种未知蛋白质作用下转变成 为β-折叠的PrPsc，从而致病。
PrPc α-螺旋
50
牛核糖核酸酶
HO H NH2—C—C—N—C—COOH
CH3 H H 丙甘肽
N—末端 C—末端
C N 键长 ＜ C—N键长 ＜ N—Cα 键长
0.127nm
0.132nm 0.147nm
（具部分双键性质，不能自由旋转）
（二）肽键平面：
肽键的C-N键在一定程度上具有双键性质，所以不
能自由旋转。因此它们所相连的四个原子基本处在同
此样品约含蛋白质多少克？ 三聚氰胺 含氮量：66.7%
生化11.2.2-蛋白质降解的反应机制——ATP-依赖性的泛素标记的蛋白质降解机制
发现过程
• 无氧条件下蛋白质分解受到阻断，发现了 存在着ATP-依赖的蛋白质水解体系。
• 热力学上未曾料到的现象，多肽水解一般 都是一个放能过程。
（2）依赖ATP的泛素途径
• 在胞质中进行，主要降解异常蛋白和短寿 命蛋白（调节蛋白）
• 此途径在不含溶酶体的红细胞中尤为重要 。（选择性降解）
• 也有研究表明两个泛素单体形成的泛素链 更能有效地被蛋白酶体降解。
E1、E2和E3
• E3使这一系统具有了底物特异性 • E2或者E2-E3决定底物上泛素链的类型 • E1、E2和E3蛋白的数量依赖于生物体和细
胞类型，人体中存在大量不同E3蛋白，说 明泛素-蛋白酶体系统可作用于数量巨大的 靶蛋白。
垃圾处理厂
泛素化信号通路
• E1，泛素活化酶 – 激活泛素，运送到E2
• E2，泛素载体蛋白质 – 把泛素以共价键的形式绑在需要降解的 蛋白质上 – E2不认识哪一个蛋白质需要被降解
• E3，泛素蛋白质连接酶 – 辨认指定蛋白质
泛素化信号通路
• 第一步反应，ATP水解，泛素羧基端Gly残 基通过硫酯键与泛素活化酶Cys-SH偶联。
泛素
O
HS-E2
C S E1
HS-E1 泛素
O C S E2
泛素化信号通路
高级生化_蛋白质的基本知识
COOH
COOH O2N NO2 HN CH R
O2N NO2
F
+ H2N CH
在弱碱中
+
F-
R
﹡氨基酸的α-氨基与其他的伯胺一样，在常温下 与亚硝酸作用生成氮气，通过测定标准下生成 的氮气的体积，可计算出氨基酸的量。
Gly Ala Val Leu Ile Phe Pro
G A V L I F P
5.97 6.00 5.96 5.98 6.02 5.48 6.30
CH3 CHCOONH3+ H3C CH CHCOOCH3 NH3+
CH3
H2C CH3
HC CH2 CHCOO亮氨酸 NH3+ CH3
CH CHCOO- 异亮氨酸 isoleucine CH3 NH3+
2. 极性中性氨基酸 色氨酸 丝氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 蛋氨酸 天冬酰胺 tryptophan serine tyrosine cysteine methionine asparagine Try Ser Try Cys Met Asn W S Y C M N
5.89 5.68 5.66 5.07 5.74 5.41
• 定义
蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列
生物化学 蛋白质
3 氨基酸的应用 补充营养、调味、药物
第三节 肽的结构、命名、及性质
（一）肽的概念、命名
——肽的概念、命名
定义：肽是由两个或两个以上的α-氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。
量：
原生质的各种成分比例
１、无机盐 1—1.5%
２、糖类和核酸 1—1.5%
３、脂类 无机盐 糖类和核酸
1—2%
脂类
４蛋、白质蛋白质 7—10%
水
５、水 80—90%
——蛋白质的元素组成
C
H
O
N
S
（ 50%） （7%） （23%） （16%） （0～3%）
Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I
福林反应
试剂：磷钼酸 和磷钨酸； 作用对象：酪氨酸及含酪氨酸的蛋白质 ；蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）
——特殊氨基酸的反应 -S-S-和-SH的氧化还原反应
H2N CH COOH
6HCOOOH
CH 2
S
2 H2N CH COOH + 6HCOOH CH 2
S
SO3H
CH 2
2R－SH
H2N CH COOH
O2N
F + H2N
生化第一章
第一章蛋白质的结构与功能
——L.D.G
一、蛋白质的基本组成单位和平均含氮量
基本组成为氨基酸。组成蛋白质的元素：主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质还含有少量的P、Fe、Cu、Mu、Zn、Se、I等。
各种蛋白质的含氮量很接近，平均16%
二、氨基酸的理化性质。
①氨基酸具有两性解离的性质：等电点：在某一PH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的PH值称为该氨基酸的等电点。
②含共轭双键的氨基酸具有紫外线吸收性质，测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。
③氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm处。
三、蛋白质的分子结构。
①蛋白质一级结构：在蛋白质分子中，从N-端至C-端的氨基酸排列顺序称为蛋白质的一级结构。一级结构主要的化学键：肽键。此外还有二硫键也属于一级结构的范畴。
②蛋白质的二级结构：是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构像。维持力：氢键肽单元：参与肽键的6个原子Ca1、C、O、N、H、Ca2位于同一平面，Ca1和Ca2在平面上所处的位置为反式构建，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元。
a-螺旋：1、右手螺旋（顺时针），氨基酸侧链向外。
2、每3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距0.54nm
3、每个肽键的N-H和N端方向第四个肽键的羰基氧形成氢键（隔三个氨基
酸残基）
4、氢键方向与螺旋长轴平行。
B-折叠的片层结构：肽键平面成近似平行但略呈锯齿状的空间结构。两段以上肽链或一条肽链的两肽段平行或反向平行排布，以链间氢键相连所形成的结构称为B-片层或B-折叠层。B-片层可分为顺向平行（肽键的走向相同，即N、C端的方向一致）和逆向平行（两肽段走向相反）结构。
第二章 蛋白质化学-生化
短杆菌肽S 短杆菌肽S经由短杆菌所产生的一种由五种氨 基酸组成的环状10 肽抗菌素，它能抗革兰氏阳性 细菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变形杆菌也有效 。临床上局部用于治疗和预防化脓性病症பைடு நூலகம்分子 中含有D－型氨基酸。
鹅膏蕈素 伞菌科鹅膏菌属的某些种产生的八肽毒素。 它高度专一地抑制真核细胞中RNA聚合酶 Ⅱ 和 Ⅲ 的活性，使转录不能进行，强烈阻碍 mRNA 的合 成。因此，在分子生物字中常用于 RNA 合成和 RNA聚合酶活性的研究。 鹅膏蕈素的毒性主要由于分子中含有7，8— 二羟基异亮氨酸所致，如将它换成异亮氨酸，则 毒性消失或大大减弱。
肽和氨基酸一样，在晶体或溶液中都以两性离子 存在。在pH 0－14范围内，肽链中的亚氨基不能解 离，因此肽的酸碱性质主要决定于肽链的游离 N 末 端的α－氨基和游离C末端的α－羧基以及侧链R上可 解离的功能基团。例如四肽甘氨酸谷氨酰赖氨酰丙 氨酸，它的结构式见下页。
肽的化学反应
肽N末端的氨基酸残基能与茚三酮反应，生成呈色
B
5
S
S
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala 10 15 20 25 30
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摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域
新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学
Abstract：Proteomics which is the new discipline in the time of the post-genomics develops rapidly in the life science．The present paper has documented the current situation and new development of the techniques of separation and identification in this area，including 2·dimensional gel- electro·phoresis，chromatography an d mass spectrometry．
Key words：Proteomics；2-Dimensional gel electrophoresis；Chromatography；Mass spectrometry；Bioinformatics
1、概念及相关内容
随着人类基因组测序计划的完成,生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究,并产生了一门新的学科———蛋白质组学(proteomics) 。“蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家Marc Wilkins 和Keith Wil2liams[ 1 ] 最早提出的,是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的所有蛋白质产物”。蛋白质组研究与以往的蛋白质化学研究不同,它着重于全面性和整体性,研究的对象不是单一或少数的蛋白质,而是从细胞整体水平上对蛋白质的结构和功能进行研究,包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因、核酸层次深入到生命的直接执行者———蛋白质水平。蛋白
质组研究已成为后基因组时代的主要任务[ 2,3 ]。
2、蛋白质组研究的主要技术
相对于基因组的研究,蛋白质组的研究相对滞后,主要原因是缺乏像基因组研究那样成熟的技术。当前蛋白质组研究的主要技术可分为两大类,一类是蛋白质组的分离技术,包括双向电泳、双向高效柱层析等;另一类是蛋白质组的鉴定技术,包括质谱技术、生物信息技术等。
2.1 蛋白质组的分离技术
2.11 双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方
法之一。这项技术是O′far2rell 、Klose 和Scheele 等[4 ,5 ]于1975发明的。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯
酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质
谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量
蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
2.12 双向高效柱层析
其基本原理是先进行一次分子筛柱层析,按蛋白质分子量大小进行第一次分离,从柱上流出的蛋白峰自动进入第二向层析进一步分离,第二向层析通常是利用蛋白质表面疏水性质进行的反相柱层析。和双向电泳相比,双向高效柱层析的优点是可以适当放大,分离得到较多
的蛋白质以供鉴定;可以和质谱技术联用实现蛋白质分析技术的自动化,同时流出的蛋白峰直接进入质谱进行鉴定,可减少印迹的步骤和
因此引起的缺点。
2．13 色谱分离技术
近年来，色谱技术的发展为蛋白质和多肽或亚基的分离分析提供了新的手段。色谱技术是利用各种物质在固定相和流动相之间不同的分配系数，使其在相对运动着的两相间经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。按两相状态来分类，有气相色谱法(gas chrom- atography，GC)和液相色谱法(1iquid chromatography，LC)
两种，而其中的LC是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。单一的液相分离技术常不能满足复杂蛋白质复合物分离的需要，多维液相分离系统则在技术上弥补了单一的液相分离技术的不足。多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特性的液相分
离方法的优化和组合，它有效地提高了系统对样本的分辨率和峰容量。此外，多维液相分离系统还具有快速、高通量、自动化、重复性好等优点[6]。常见的多维液相分离系统有二维液相(two．Dimensio- nal liquid chromatography，2D—LC)、二维毛细管(two·dimensional capillary eleetrophoresis．2D—CE)、液相色谱一毛细管电泳(LC —CE)等。色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。如Opiteck等[7]。首次报道多维色谱整合质谱技术(MS)分析蛋白质混合物，Washurn等[8]在多维LC—MS／MS的基础上，提出
MudPIT(multidimensional protein identification technology)
方法，成功分离和鉴定了酵母中1484种蛋白质，这其中还包括一些低丰度的调控性蛋白激酶。Nielsen等[9]应用LC—MS／MS技术成功分离鉴定了海马组织中的1 685种蛋白质。
毛细管电泳(CE)作为一种最新的色谱分离技术，将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合，目前已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。与经典电泳相比，CE由于其侧面截面积大，散热快，能克服由于焦耳热引起的谱带展宽，且可承受高电压，因此分离效率提高，柱效可达几百万乃至几千万理论塔板数／m以上[10]。CE在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质