冰冻切片技术原理 ppt课件
实验五-冰冻切片法ppt课件
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四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
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五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在 标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
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三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。
切取的组织不能过大，组织过大
快速，用时短。
不容易冻结或者组织冻结不均，
影响切片及染色效果。
组织变化不大。
能很好保存脂肪，类脂等成分。
不容易制作较薄的切片。
能够比较完好地保存各种抗原活性及 组织块在冻结过程中容易产生水
酶类，特别是对于那些对有机溶剂或
的结晶而影响细胞的形态结构及
热的温度耐受能力较差的细胞膜表面
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半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
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一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
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二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
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抗原物质的定位，并且组织结构
抗原和水解酶保存较好。
也不如石蜡切片清晰。.Fra bibliotek3冰冻切片的适用范围
冰冻切片详细说明解读
冰冻切⽚详细说明解读冰冻切⽚详细说明切⽚技术最早期是从冰冻切⽚开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切⽚弥补了⽯蜡切⽚和⽕棉胶切⽚之不⾜，⽯蜡切⽚和⽕棉胶切⽚需时太久，且在制⽚中要使⽤许多化学试剂，⽯蜡切⽚还需要加温过程，因⽽某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切⽚过程较简单，⽆须经过上述步骤，组织中的⽔分起着包埋剂的作⽤，组织经固定或不固定即可进⾏冰冻切⽚，切⽚厚度⼀般可在6-8微⽶，组织没有收缩，易保持⽣活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染⾊⽅法和组织化学⽅法，特别是酶的活性⼗分理想的切⽚⽅法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切⽚也很重要。
其缺点是组织过⼤不易冰冻，连续切⽚困难。
5微⽶以下切⽚不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微⽶的切⽚⼀、直接冰冻切⽚法冰冻切⽚多⽤于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂⽽直接放在制冷台上冷却后再进⾏切⽚。
1．恒冷箱切⽚就是将组织在恒冷箱的切⽚机切⽚。
⽬前恒冷箱切⽚机的品种较多。
此种切⽚适⽤于科研和教学上的连续切⽚。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷⼑的甲醇循环装制，其冷却速度⽐较快，属于开放式，作⼀般常规冰冻切⽚⽤。
3．⼆氧化碳冰冻法将组织⽤蒸馏⽔洗后，放在冰冻切⽚机的冷冻台上，加蒸馏⽔少许。
打开冷冻台的⼆氧化碳开关，⼆氧化碳⽓体喷出，待组织出现冷霜时，将⼆氧化碳关闭，即可切⽚。
若组织冷冻过硬则切⽚易碎；组织冷冻硬度不⾜，则切⽚呈粥糜状，需⽤间歇⽅法继续冷却。
硬度⼀般在刚开始解冻时最合适，应迅速切⽚。
4．半导体致冷冰冻切⽚法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏⽔，调好切⽚机的厚度。
先接通热器的循环流⽔，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，⽤整流电源控制温度。
⼆、明胶冰冻切⽚法明胶包埋法⼀般多⽤于冰冻切⽚易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切⽚后投⼊⽔中时，常常引起分散，甚⾄发⽣丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发⽣散乱⽽失去相互间的联系，可形成移位现象。
冷冻切片技术课件ppt
现代的冷冻切片技术已经实现了自 动化、数字化和标准化，为医学研 究和诊断提供了强有力的支持。
应用领域
临床病理诊断
冷冻切片技术可用于手术中的快 速病理诊断，帮助医生确定病变 的性质和范围，为手术方案提供
重要依据。
教学
冷冻切片技术可用于制作教学标 本，为医学生和病理医生提供直
观的学习材料。
科学研究
二氧化碳冷冻喷射固定设备。
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冷冻固定设备的特点
冷冻固定设备具有操作简便、冷冻速度快、温度低等特点，能够有效地
保持组织或细胞的结构和成分不变。
切片机与刀片
切片机
切片机是用于将冷冻固定的组织或细胞样品进行切片的仪器。其工作原理是通过将组织或 细胞样品放置在切片机的工作台上，利用机械或激光等方式将样品切成薄片。
生物科学研究
利用冷冻切片技术进行细胞结构和功能的深入研 究。
药物研发
利用冷冻切片技术评估药物对细胞的作用机制。
发展前景展望
自动化与智能化
01
通过自动化与智能化技术的引入，降低冷冻切片制备的难度和
操作成本。
高分辨成像
02
发展高分辨成像技术，以获得更清晰、更深入的细胞结构和功
能信息。
跨学科，如生物工程、神经科学
将切片贴在载玻片上
将切好的切片贴在预处理的载玻片上，使其平整、无气泡。
干燥与固定
使切片在室温下干燥，并进行必要的固定处理，如用醛类化合物 进行醛化处理，以增强切片的稳定性。
染色与观察
染色
根据研究或诊断需求，选择适当 的染色方法对切片进行染色，如 H&E染色、免疫染色等。
观察
用显微镜观察染色后的切片，根 据需要调整焦距和光源强度，观 察并记录组织结构和细胞成分等 细节信息。
《切片技术》PPT课件
•micrometer (µm )= 10-6 meter
•nanometer (nm) = 10-9 meter
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组织学的研究技术
• 显微镜技术: 光镜：light microscopic, LM 电镜：electronic microscopic, EM
–透射电镜（transmission electron microscope, TEM）：观察细胞内部结构
– 勿挤压组织块
– 保持组织原有形态、保持组织清洁
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• 固定
为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组 织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液， 常用的固定方法有：
– 小块组织固定法：标本：固定液为1：4～20；最常用的方法，但组织 块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延 长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。
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Embedding 包埋
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切片机
石蜡切片机
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冰冻切片机
How does a microtome work?
Microtome Arm
Tissue Block
Tissue
Section
Knife
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Microscope Slide
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切片
…on Cryostat (frozen)
Organisms
Organs
Cells (20u) Nucleus (2 u) Bacteria (0.5 u) Organelles Viruses Macromolecules A... toms
切片ppt课件
B、石蜡切片
• 其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究 中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清 晰，抗原定位准确。 • 用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有 不同：
• ①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽 量减少组织抗原的损失;或常温条件下缩短时 间。
组织学技术及免疫组化课程
山东农业大学
• ②液氮法：
• 将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直 径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋 剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛 有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开 始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液 氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
• 取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用， 或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
• 其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭 室内，故切片时不受外界温度和环境影响， 可连续切薄片至2-4μ m，完全能满足免疫组 织化学标记要求。一般以10-30μ m为佳。
• 切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜， 温度过低组织易破碎 • 抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组 织切片，切勿上下移动。
• 其方法有二：
①.干冰-丙酮（酒精）法： ②.液氮法
山东农业大学
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①干冰-丙酮（酒精）法：
• 将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，
逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干 冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯 （50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧 杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内， 至异戊烷温度达-70℃时即可使用。 • 将组织（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）投入 异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内 以备切片， • 或置-80℃低温冰箱内贮存。
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
每台冰冻切片机都有 一个速冻台，好的冰 冻切片机可以在几分 钟内将速冻台的温度 下 降 至 -50℃ ～ -60℃ 度之间。
冷冻锤从上面压在组 织上，可以使组织上 下两面同时冷冻
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一台冰冻切片机有多个冷冻锤
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6、液氮和急冻剂
使用液氮和急冻 剂来快速冷冻组织
7、专用冷冻机
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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一、冰冻切片制片中冰晶的问题
冰晶的产生：当组织缓慢冷冻时，组织间隙的 水份凝固形成的，这时由于电解质析出，渗透压 升高，细胞内的水分子渗透到细胞外，使组织间 隙的冰晶变得更大，挤压周围组织，使组织细胞 的形态发生明显的改变，严重影响病理诊断。
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液：
苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水 730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml.
（2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
5、购置专用冷冻机、急冻剂、专用液氮灌
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二、常规与冰冻制片中常见问题
切片染色的问题
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理精品PPT课件
– 未经固定的脑组织、肝组织：-10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织：-15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
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保持切片的完整性
• 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
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防止切片卷缩
• 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
• 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
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Con. TNBS
LY
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2014.4.20 TRPV1+CGRP
同一载玻片上 • 包括各个所有组 • 染色齐性
TNBS
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Con. LY
L1 DRG
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Con. TNBS
LY
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2014.4.20 TRPV1+CGRP
TNBS
ZD7288
Con. LY
为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间? 判定？）
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冰冻切片详细说明
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。
⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。
⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。
切片可保存于10%甲醛液中。
⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。
《冰冻切片法》PPT课件
• 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要 细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第 一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便 可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
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保持切片的完整性
• 破碎的组织切片必然丢失实验信息，切片的完整性对研究结果的分析 无疑十分重要。切片破碎不全、有缺损的常见原因有： 1组织固定不 完全； 2温度设置不当。组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎。组 织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎；3组织 块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多；4 切片刀钝或较脏，切片出现 刮痕，使切片不完整；5操作手法不当，如速度不适宜，切片也可能 不完整。遇到上述情况，应有针对性的采取相应的措施。如注意组织 固定充分、尽量减少冰晶的形成，保持刀片的清洁与锋利，冷冻温度 要适宜，不同的组织应设置不同的温度，如较大组织块或含有较多脂 肪的组织应设置温度相对较低 ，冷冻时间稍长些。而脑、脊髓等温度 设置相对高些有作者采用“边冻边切”法制作切片，同样也取得较好 的效果。若组织带有不必要的皮肤或包膜，应尽量去除干净；如必须 保留皮肤或包膜，应注意采取相应的切片技术，如最好将皮肤或包膜 的平面与刀面垂直。此外，在切片时，应注意速度均匀。当然，要做 好这些，必须有一定的实践经验。
双重固定液法在冰冻切片中应用良好, 明显优于Clarke 氏单液固定法, 值得推
广应用。
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合成胶水的影响
• 临床病理工作中经常遇到一些微小组织做冰冻切片,我们 体会到,异体脏器组织包埋法中的异体脏器组织存留在载 玻片上,不易擦除干净,留有背景对切片外观有影响,时有微 小组织与异体脏器组织间包埋时易产生间隙,给切片带来 不便。石蜡包埋托法往往因包埋托有一定厚度影响冷冻时 间,而且仍然需要OCT 包埋剂。合成胶水水溶性好,与组织 结合紧密,二者形成完整整体,而且冷冻后硬度相当,利于切 片,切片上的胶膜水洗后完全溶解,不会造成污染和遗留背 景色。合成胶水用量少,冷冻时间短,组织不会形成冰晶 , 因此镜检时细胞形态完整,染色清晰。合成胶水来源简便 、经济、冷冻快速。实为一种实用的替代方法。
常温超薄切片和冷冻超薄切片操作方法课件
切片操作步骤及注意事项
注意事项
2. 调整刀架位置和切片厚度时要谨慎，避免切片出现裂 痕或厚度不均。
1. 在操作过程中要保持刀片锋利，并及时更换刀片。 3. 在保存切片时要避免污染和氧化，最好在低温下保存。
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冷冻超薄切片技术
冷冻超薄切片机及其工作原理
冷冻超薄切片机
一种常用于生物医学样品的超薄切片仪器，可实现快速、准确地切割生物组织。
了解这两种技术的操作方法对于相关领域的研究人员至关重要。
目的和意 义
通过学习常温超薄切片和冷冻超薄切片技术，使科研人员 能够更好地观察细胞或组织的内部结构，为科研提供更为 准确、可靠的数据支持。
掌握这两种技术能够提高研究工作的效率和质量，推动相 关领域的发展。
切片技术的发展
随着科研技术的不断发展，超薄 切片技术也在不断改进和完善。
共聚焦显微镜观察
共聚焦显微镜可以观察细 胞内不同层次的荧光信号， 用于研究细胞内分子相互 作用。
图像分析系统及应用
图像采集
使用图像分析系统可以快 速、准确地采集常温超薄 切片和冷冻超薄切片的图 像数据。
定量分析
通过对图像数据的定量分 析，可以研究细胞形态、 大小、密度等参数的变化。
分子相互作用研究
切片操作步骤及注意事项
操作步骤 1. 将处理好的组织样本放置在载玻片上，并固定好。
2. 打开常温超薄切片机，调整刀架位置和切片厚度。
切片操作步骤及注意事项
3. 启动真空系统和水循环系统， 使刀架做往返运动，同时用水 流将切下的切片冲走。
4. 观察切片质量，如需调整可 调整刀架位置或切片厚度。
5. 关闭真空系统和水循环系统， 取出切片并保存。
要点二
《冰冻切片法》课件
近年来，冰冻切片技术不断改进，如冷冻保护剂的选择、制冷剂的种类和切片刀 的材质等方面都有所突破，提高了制片质量和效率。同时，冰冻切片法与其他技 术如免疫荧光、原位杂交等结合使用，为科学研究提供了更多手段。
02
冰冻切片法的技术原理
冰冻切片的制作过程
01
02
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样本准备
将待检测组织固定在冷冻 台上，用冷丙酮或包埋剂 进行冷冻。
细胞结构和超微结构。
冰冻切片法的缺点
技术要求高
冰冻切片技术要求高，需要熟练的操 作技巧和经验，才能获得高质量的切 片。
设备昂贵
冰冻切片机等设备较为昂贵，增加了 制片成本。
容易产生冰晶
在冷冻过程中，组织内部容易形成冰 晶，影响切片的清晰度。
制片质量不稳定
由于制片过程中涉及多个步骤，且每 个步骤都可能影响制片质量，因此制 片质量有时不太稳定。
切片制作
使用冷冻切片机将冷冻的 组织切成5-10微米厚的切 片。
贴片与固定
将切片贴在载玻片上，并 用丙酮固定。
冰冻切片的质量控制
切片厚度
确保切片厚度均匀，一般 在5-10微米之间。
组织完整性
确保组织结构完整，无破 碎或裂痕。
染色效果
染色效果应均匀，无沉淀 或悬浮物。
冰冻切片的染色方法
苏木精-伊红染色法
基因表达研究
03
通过冰冻切片技术，可以对组织中的基因表达进行快速检测和
分析，有助于研究基因功能和疾病机制。
在其他领域的应用
食品安全检测
冰冻切片技术可用于快速检测食品中的有害物质和微生物， 保障食品安全。
环
05
冰冻切片法的优缺点及展望
冰冻切片法的优点
冰冻切片技术原理 ppt课件
冰冻切片技术原理
• 冷冻切片的重要环节是温度。
• 1.冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻头温度和箱内温度调整 到适宜的切片温度，一般情况下为-25~-18℃。
• 2.在标本托上涂一层冷冻包埋剂OCT，然后将取材后的新 鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT包埋剂覆盖标本。
• 3.组织较小或较薄，可先将OCT滴加在标本托上，冻成一 个小冷台，将组织放小冷台上，再覆盖OCT冷冻，并用 冷冻锤轻轻压平。
• LEICA CM1850
冰冻切片技术原理
• 1.标本必须新鲜无固定，无液体浸泡； • 2.组织块大小厚薄适宜； • 3.组织块未受挤压； • 4.尽量保持组织的原有形态； • 5.选择好组织切面； • 6.保持组织的清洁； • 7.切除不需要的部分，遇有脂肪组织要剔除； • 8.组织内有异物一定要清除。
冰冻切片技术原理
• 二、冷冻切片染色
• 1.冷冻切片应立即放入固定液中。 • 2.固定1min左右，水洗。
• 3.入苏木精染色2min，水洗。 • 4.1%盐酸酒精分化数秒，水洗。（0.5%氢氧化铵水溶液
返蓝数秒，水洗）
• 5.伊红染液20s-1min，水洗。 • 6.70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇逐级脱水。 • 7.无水乙醇脱水2次。 • 8.二甲苯透明两次。 • 9.中性树胶封固。
防造成污染。 • 5.切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片粗削后必
须用毛笔清洁碎屑，以防其他组织碎屑沾染到正在进行切 片的标本上。
• 2.室温过低时，影响着色，可适当加温促进染色。 • 3.盐酸酒精分化应适度，显微镜下控制，否则易造成核着色
不佳，染色质不清晰，影响诊断。
冰冻切片技术原理
• 1.切片前，厚度应预先调制好，刀具提前安放好。 • 2.刀的角度调好位置，并多备几个冷冻托，以供速冻组织
冷冻切片操作指南
冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。
本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。
一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。
冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。
冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。
二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。
样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。
2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。
冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。
3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。
4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。
通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。
5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。
使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。
6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。
注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。
7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。
三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。
在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。
2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。
过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。
3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。
手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。
冰冻切片
1.体式显微镜下，用显微剪刀沿角膜缘剪下角膜，将眼杯置于固定液内（0.2M NaH2PO410ml + 0.2M Na2HPO4 40ml + 8%多聚甲醛50ml），４℃固定过夜2.体式显微镜下，用显微剪剪除虹膜，并剪断晶体悬韧带，晶体自动游离出眼杯，尽量减少对眼杯扰动，将眼杯置于30%蔗糖（sucrose）溶液内（0.1M PB配置PH=7.4），４℃脱水过夜沉底3.将眼杯由30%蔗糖溶液取出，置于20%蔗糖溶液与OCT包埋剂（TFM™ Tissue FreezingMedium）2：1体积比例混合液中，室温浸泡摇动30min4.体式显微镜下，于平皿内用软纸采用虹吸方式吸干眼杯内外水份，尽量减少对眼杯扰动5.在模具（tissue-tek 4565）上标记样品情况，向模具内倒入20%蔗糖溶液与OCT包埋剂2：1体积比例混合液，将眼杯开口向上置于液体上，先用显微镊子按压一侧眼球（下方），使液体缓慢浸满眼杯，而后将眼杯在琼脂糖翻转，杯口朝下置底，上方眼球标记点朝向模具标记位置并置中，并使鼻侧或颞侧眼球靠近模具壁，将模具置于钢板上，移至-80℃冰箱（保证眼杯在内不动），静置10min6.将模具置于冰冻切片机恒冷箱内1h（冰冻切片参数切割头-17℃，恒冷箱-20℃），温度平衡至-20℃，样本块颜色至瓷白色，并在对应模具标记位置标记样本块（眼球上方），将样本块由模具内顶出，用刀片修整样本块7.在支撑器上涂抹OCT，待颜色稍变化，将样本块预切割侧向上（靠近模具壁侧），置于OCT内，将压制块置于标本块上8.待OCT液变色为瓷白色，将支撑器连同样本块固定于切割头上，样本块标记侧向上，将刀片保护套去除后，逐步调节样本块与刀片距离（后退钮为连续性，前进钮为间断性）9.当刀片开始切割组织块时，先将切片厚度调至30μm进行粗切，并放置下防卷板，以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，当切割至目标区，将切片厚度调至12μm10.在促黏合载玻片上标记样本情况，先在恒冷箱预冷片刻，掀开防卷板，用刷子将冰冻切片展开平整，将载玻片黏合剂侧向下，载玻片标记侧靠近切割头，将冰冻切片敷贴于载玻片上（眼球上方统一朝向载玻片标记侧）11.载玻片室温干燥过夜，置于-20℃或-80℃冰箱内，标本块置于模具内，包装严实后置于-20℃或-80℃冰箱内注：OCT冰冻切片包埋剂（opti-mum cutting temperature compound）：一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。
冰冻切片技术
冰冻切片技术1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。
因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。
2：实验步骤：①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。
放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。
④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。
⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。
⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。
⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。
4：结果分析及讨论：①切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。
②切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染④严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5：思考题：①什么时候做冰冻切片：1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤2：判断肿瘤的良恶性2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。
冷冻技术原理ppt课件
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二、低温与酶的活性控制
低温对酶活性并不起完全的抑制作用，酶仍能保持部分活 性，因而，酶催化作用实际上也未停止，在长期的冷藏过 程中，酶的作用仍可使食品变质。 例如，胰蛋白酶在-30℃下仍然有微弱的活性，
脂肪分解酶在-20℃下仍能引起脂肪水解。 一般来说，如将温度维持在-18℃ 以下，酶的活性才 会受到很大程度的抑制。 因此，商业上一般将冻制食品放于-18℃下冻藏，对于 多数冻制食品可贮藏数周至数月。
☞ 在冰点左右，特别在冰点以上，微生物仍然具有一定 的生长繁殖能力，虽只有部分能适应低温的微生物和嗜冷 菌逐渐增长，但最后会导致食品变质。对低温不适应的微 生物则逐渐死亡。这就是高温冷藏食品时仍会出现不耐久 藏的原因。
☞ 稍低于生长温度或冻结温度时对微生物的威胁性最大， 一般为-1～-12℃,尤以-2～-5℃为最甚，此时微生物的活 动会受到抑制或几乎全部死亡。
当温度降低到微生物最低生长温度 时，它们就停止生长并出现死亡。
值得注意的是，低温可以减缓微生 物的生长和活力，并可使部分细菌死 亡，但死亡速度比在高温下缓慢得多。 仅依靠冷是不能使食品杀菌。
不同微生物对低温的敏感性不同，许 多嗜冷菌和嗜温菌的最低生长温度低 于0℃，有的可达-8℃。
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长期处在低温中的微生物能产生新的适应性，这是长 期低温培育中自然选育后形成了能适应低温的菌种。这种 微生物对低温的适应性可以从微生物生长时出现的滞后期 缩短的情况加以判断
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（二）低温导致微生物活力减弱和死亡的原因
3、冰晶体引起的机械伤害 细胞内外冰晶体的形成和增大还会使微生物细
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。
它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。
在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。
同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。
1. 取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2. 速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。
液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。
具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）,如组织块小可适量加OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内, 当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾, 此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s 组织即迅速冰结成块。
在制成冻块后, 即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
若需要保存, 应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80 C 冰箱贮存备用。
3．固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4C冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE 上30min。
4.切片：恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10 z。
切片时，低温室内温度以-15 C〜-20C为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
切好室温放置30min后，入4C丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS洗5min X3。
进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。
可用3%H2O2孵育5~10min,消除内源性过氧化物酶的活性。
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冰冻切片技术原理
• 1.结构：恒温冷冻切片机主要由冷箱体及切片机构成，具 有快速双重制冷、自动除霜、自动消毒、负压等功能。
• 2.功能：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻使其产 生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需 要脱水处理，因此制片速度快，是为术中提供快速病理诊 断的良好方法。
冰冻切片技术原理
• 一、冷冻切片的意义 • 二、恒温冷冻切片机的结构与功能 • 三、冷冻切片组织的取材 • 四、冷冻切片的制作方法 • 五、冷冻切片的固定和染色 • 六、冷冻切片的标准及染色的注意事项 • 七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维
护
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
冰冻切片技术原理
• 1.快速诊断：冷冻切片可称之为病理科的急诊工作，常
用于临床手术科室快速组织学诊断，特别是在手术进行当 中取出病变组织，要求病理医师在很短的时间内做出良、 恶性的正确的诊断，为临床医师下一步的手术方案及治疗 提供指导。 • 2.显示组织中脂质 脂肪染色和神经组织髓鞘的染色等 • 3.显示酶活性 主要应用于肌肉活检的检查 • 4.免疫荧光的研究
• 7.放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突 出刀刃。
• 8.以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷 板下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲可 用小毛笔轻轻展平。
• 9.打开放卷板，用载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸 附到载玻片上。
冰冻切片技术原理
• 10.也可不使用放卷板，用毛笔轻带组织下方的白边（OCT），随机 器的慢慢转动，用毛笔轻轻从上至下展开组织，使其平坦，组织齐 全满意时，用毛笔轻轻压住切片的下方，右手拿载玻片轻 轻平稳地压组织，使其平整地吸附在载玻片上，迅速放入固 定液，进入染色程序。
• 2.室温过低时，影响着色，可适当加温促进染色。 • 3.盐酸酒精分化应适度，显微镜下控制，否则易造成核着色
不佳，染色质不清晰，影响诊断。
冰冻切片技术原理
• 1.切片前，厚度应预先调制好，刀具提前安放好。 • 2.刀的角度调好位置，并多备几个冷冻托，以供速冻组织
块使用。 • 3.切片时，观察窗不可打开过大，以防温度升高影响切片。 • 4.每一例冷冻切片完成后都应及时清理冷冻组织碎屑，以
冰冻切片技术原理
• 一、冷冻切片的标准
• 1.操作正确 • 2.切片完整 • 3.厚薄均匀 • 4.无褶无刀痕 • 5.组织内无冰晶 • 6.核质分明，染色适度 • 7.组织结构清晰 • 8.脱水透明洁净 • 9.封裱美观 • 10.时间迅速
冰冻切片技术原理
• 二、冷冻切片染色的注意事项
• 1.提倡使用新鲜苏木精染液，每天过滤，防止沉渣及结晶 的形成，保证高质原理
• 1.标本必须新鲜无固定，无液体浸泡； • 2.组织块大小厚薄适宜； • 3.组织块未受挤压； • 4.尽量保持组织的原有形态； • 5.选择好组织切面； • 6.保持组织的清洁； • 7.切除不需要的部分，遇有脂肪组织要剔除； • 8.组织内有异物一定要清除。
• 4.标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上，调整 机头的位置使其恰好位于切片刀的后方。
冰冻切片技术原理
• 5.以粗切削的方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平 面，用毛笔清除机头、标本托及刀片上的组织碎屑。
• 6.确认切片的厚度，一般6~10um不等，根据组织的不同 可适当调整切片的厚薄。
冰冻切片技术原理
• 二、冷冻切片染色
• 1.冷冻切片应立即放入固定液中。 • 2.固定1min左右，水洗。
• 3.入苏木精染色2min，水洗。 • 4.1%盐酸酒精分化数秒，水洗。（0.5%氢氧化铵水溶液
返蓝数秒，水洗）
• 5.伊红染液20s-1min，水洗。 • 6.70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇逐级脱水。 • 7.无水乙醇脱水2次。 • 8.二甲苯透明两次。 • 9.中性树胶封固。
防造成污染。 • 5.切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片粗削后必
须用毛笔清洁碎屑，以防其他组织碎屑沾染到正在进行切 片的标本上。
冰冻切片技术原理
• 冷冻切片的重要环节是温度。
• 1.冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻头温度和箱内温度调整 到适宜的切片温度，一般情况下为-25~-18℃。
• 2.在标本托上涂一层冷冻包埋剂OCT，然后将取材后的新 鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT包埋剂覆盖标本。
• 3.组织较小或较薄，可先将OCT滴加在标本托上，冻成一 个小冷台，将组织放在小冷台上，再覆盖OCT冷冻，并用 冷冻锤轻轻压平。
• 11.正确地调整使用冷冻切片机的放卷板是获得平展完整 冷冻切片的重要手段，放卷板的正确位置是，与切片刀的 刀刃平行并略微突出于刀刃。
冰冻切片技术原理
• 一、冷冻切片的固定、固定液的选择
• 1.丙酮液 • 2.10%中性福尔马林缓冲液 • 3.95%酒精 • 4.乙醚、纯酒精等量混合固定液 • 5.AF液 • 6.AFA液 • 可根据工作要求选择适合于本单位的固定液