Time-resolved two-photon excitation fluorescence spectroscopy and microscopy using a high repeti
荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用
荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用张建伟;陈同生【摘要】荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定量检测FRET效率的方法.作者结合自己的研究结果介绍了多种FRET 效率定量检测技术在细胞信号转导机制研究中的应用.%Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is the most widely used technology to study the protein - protein real - time dynamic interactions and the change of macromolecular conformation in living cells. Spectral cross - talks and acceptor - to - donor concentration ratio are the tissues harassing the quantitative measurement of FRET efficiency. Many different methods to quantitate FRET efficiency, such as FLIM - FRET, spectral FRET, acceptor photobleaching FRET and sensitized emission FRET methods, have been proposed. In this report, we introduce some quantitative FRET methods to study the mechanism of cell signal translation.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(044)003【总页数】6页(P12-17)【关键词】荧光共振能量转移(FRET);FRET效率;定量检测;荧光蛋白【作者】张建伟;陈同生【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q631荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子[1-2], 从而导致供体荧光淬灭和受体荧光发射的增加. 供体和受体之间的FRET效率(E)与分子间的空间距离(r)满足6次方的关系[3]：FRET效率是依赖于供体与受体间的距离r和Forster距离R0的. R0由下式给出[3-4]：已知主要有2个因素影响FRET效率的定量检测：一个是光谱串扰, 包括供体荧光串扰到受体通道(发射光谱串扰)和激发供体时直接激发受体(激发光谱串扰)[7-8]. 由于有机荧光团的光物理特性, 绝大数现有的FRET供体受体对都存在光谱串扰. 在定量检测FRET效率时必须消除这些串扰, 选择2个发射光谱分离较大的供体受体对, 能够减小串扰, 但同时J()会减小. 影响FRET定量检测的另一个因素是参与FRET作用的供体与受体对所占整个荧光基团的比例[9-10]. 自由的供体与受体相互作用时, 往往不是所有的供体或受体分子都参与相互作用. 参与相互作用分子的百分数难以知晓, 因此, 各种FRET效率的定量检测方法对有自由的供受体存在时都不能完全地反映FRET效率, 只能测量表观FRET效率. 另外, 活细胞中荧光蛋白表达水平和背景噪音等其它因素也可能影响FRET效率的定量检测.绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins, GFP)是从维多利亚水母中分离出来的,受紫外或蓝光激发而发出绿色荧光[11]. 与GFP融合的蛋白在细胞中仍然能够行使正常的功能, 因此GFP成为了检测蛋白质分子间相互作用的报告分子. 近年来又发现了GFP的多种变体, 与迅速发展的荧光显微镜技术结合极大地改善了活细胞成像和FRET技术在活细胞中的应用,使得FRET技术在细胞生物学和化学方面的应用得到了质的飞跃. 基于荧光蛋白的FRET(FPs-FRET)技术已被广泛应用于活细胞实验研究中,极大促进了生物学的发展[12]. 利用基因转导技术和共聚焦荧光显微成像可以在活细胞中研究蛋白质定位、信号的传递、蛋白质分子间的相互作用和蛋白质分子的构象变化. 将荧光蛋白(FPs)接到感兴趣的蛋白质分子上, 可以对细胞进行实时动态检测, 也可视化监测细胞内蛋白质与蛋白相互作用的生理过程[13]. FPs-FRET 传感器主要可以分为3类: 分子内的FRET传感器、双分子FRET传感器和基于双分子荧光互补传感器(BiFC)[13]. FPs-FRET传感器已经成为在活细胞中实时检测钙离子浓度、pH值、各种激酶活化、蛋白质磷酸化以及蛋白质分子间相互作用等动态过程的重要技术[13-14].FRET定量检测的常用方法有寿命成像(FLIM-FRET), 光谱成像(spectral FRET), 受体光漂白(acceptor photobleaching FRET)和敏化发射测量(sensitized emission FRET)等方法, 下面介绍FRET技术在细胞信号转导机制研究中的应用.FLIM方法主要是通过测量受体存在和不存在时的供体分子的荧光寿命 D和 DA来确定FRET效率E[5],FLIM方法检测的结果一般作为其他FRET定量检测方法的对照标准. 要求供体通道选择性探测供体荧光, 而且FLIM系统价格昂贵, 同时也需要熟练的操作人员进行操作, 这些都限制了FLIM方法的推广应用. 事实上用时间相关单光子计数(TCSPC)进行精确地拟合时可能带来了其他的方法没有的复杂问题[10], 尤其是复杂的光物理性质增加了寿命法分析的困难[15, 17]. 为了精确地对分子的荧光寿命进行多指数拟合, 在每个像素点上需有大量的光子[18], 这将大大延长成像时间, 使得FLIM方法不适合于活细胞中的实时动态检测[19-20].每一个荧光团都有各自的激发和发射光谱, 不同于采用荧光通道获得数据的强度测量方法和寿命测量方法的是光谱法获得的分别是供体、受体和供体与受体样本的发射光谱. 通过供体和受体的光谱对供体-受体样本的光谱进行拟合得到FRET效率. THALER等人[21]提出了一种利用光谱成像的FRET效率定量测量方法. 存在FRET 时混合光谱Fcomplex包括3个部分：供体的荧光、受体的荧光和从供体转移到受体的那部分荧光：Fcomplex=d×(1-E)×Fd+a×Fa+d×E×(Φa/Φd)×k()×Fa,本研究小组最近也提出了一种基于荧光光谱拟合的FRET定量分析方法[22]. 该方法通过测量细胞内供体-受体对的荧光发射谱, 然后按照供体和受体的荧光发射谱进行拟合得到FRET效率. 该方法有效地解决光谱串扰问题, 可用于检测蛋白质之间的相互作用. 最近, LEVY等[23]提出了基于2种不同激发光条件的发射光谱测量FRET效率的方法, 该方法能够测量很小的FRET效率和参与作用的供体与受体摩尔比, 而且能够通过仔细的校准来消除自发荧光和背景光的影响.sFRET方法是测量FRET效率最为灵敏的方法, 在目前已知的方法中只有光谱法能够探测出小于5%FRET信号. sFRET方法能够有效地解决光谱串扰问题, 也能够很好地消除背景光和自发荧光的影响, 因此sFRET方法可以用于测量蛋白质分子间弱的FRET信号. 但是sFRET方法对于数据采集要求很高, 因为较小的干扰就可能对结果造成较大影响, 所以须对数据要进行严格的校正, 特别是须对背景光和自发荧光进行严格校正.光漂白方法(Pb-FRET)通过检测光漂白受体前后供体的荧光强度来获得FRET效率, 光漂白受体会导致供体的荧光强度上升. 光漂白方法分为完全光漂白方法和部分光漂白方法.供体和受体发生FRET时, 供体的荧光减少, 即供体荧光会产生淬灭, 而受体的荧光增加. 一般采用最大的受体激发光完全漂白掉受体后, 供体就不再把能量传递给受体, 导致供体的荧光增加. 通过测量完全光漂白受体前后供体的荧光强度和就可以得出FRET效率[24]：ELDER等[20]提出了一种通过检测部分受体光漂白前后供体的荧光强度和受体光漂白程度来测量FRET效率的部分受体光漂白方法,受体光漂白方法(Pb-FRET)操作简单, 在共聚焦显微镜上也很容易实现. Pb-FRET方法测量FRET效率既不依赖于系统参数，也不依赖于供体与受体的量子产率和消光系数, 只依赖于受体光漂白前后供体的荧光强度变化. 但是, 受体光漂白会对生物体造成的损伤, 不利于在单细胞中进行多次测量, 也不能在细胞中进行实时动态检测[20, 27]. 必须注意的是：受体光漂白过程中用最大的光强的受体激发光也可能漂白掉供体分子,最近发现在光漂白过程中YFP分子可以光转换成CFP分子[28].敏化发射测量(SE-FRET)方法被广泛应用于活细胞中FRET效率的动态检测[20, 27]. SE-FRET既可以在共聚焦显微镜上实现, 也可以在宽场显微镜上实现. 传统的SE-FRET方法是利用3个滤光块组的方法, 每个滤光块组都是采用一个激发带宽滤光块来选择性激发供体或受体, 并用发射滤光块来收集供体或受体发射的荧光. 可是, 受体敏化发射荧光包括直接激发受体的荧光和供体串扰到受体通道的荧光, 其串扰路径如图1.在实际的实验中, 除了测量待测FRET样本实验外, 还需增加对3个参考样本来对系统进行串扰校正：只有供体荧光团的供体对照样本, 只有受体荧光团的受体对照样本和已知FRET效率的校正样本. 增加的供体对照样本测量供体发射串扰(图1中path2), 受体对照样本测定直接激发受体发射串扰(图1中path1), 已知FRET效率的校正样本获得给定条件下成像系统的校正因子G[27]. 也有文献报道用2个化学计量比为1∶1且FRET效率差别较大的参考样本来获得校正因子G[29].SE-FRET方法具有无损伤的特性, 成为在活细胞中最为适合于动态监测的方法[20, 26], 而且能够较好对光谱串扰和系统参数进行校正. 但是, SE-FRET方法也有其自身的限制，需要利用对照样本(至少3个)对光学检测系统以及荧光基团的光学性质进行事先校正，一旦校正完成,后续实验不能再改变任何系统参数, 且每次实验都要重新校正, 极大地增加了SE-FRET实验的工作量和难度, 也限制了该方法的推广应用. SE-FRET实验必须同时转染4个样本, 其中的任何一个样本没有转染成功, 都会导致实验的失败.FRET技术已经成为在活细胞中研究蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的广泛应的工具. 本研究小组近几年利用FRET技术在活细胞中研究了细胞增殖和细胞凋亡过程中的分析调控机制[30-34]. 通过构建基于GFPs的FRET质粒，利用共聚焦荧光显微镜在单个活细胞中研究各种诱导刺激条件下细胞凋亡的分子调控机理[32-36].FRET技术在生物上的重要应用是通过实时检测荧光蛋白之间FRET的效率变化来研究荧光蛋白标记蛋白质分子间的相互作用. 利用FRET技术并结合共聚焦显微成像技术，本研究小组证明了在碱性条件下诱导细胞凋亡过程中Bid被切割成tBid 并转位到线粒体上，并且证明凋亡过程中Caspase-3活化[31]. 为了在活细胞中实时研究Caspase-3的动态活化过程，筛选了稳定表达SCAT3的细胞系，在此基础上通过检测细胞凋亡期间SCAT3 FRET效率的动态变化，实现了在单个活细胞中实时检测caspase-3的动态活化过程[32].利用ECFP标记Bax蛋白和EYFP标记PUMA蛋白，本实验室利用FRET技术在活细胞中首次证明了在紫外诱导的细胞凋亡过程中PUMA可以直接促进Bax的活化和转位，并抑制Bcl-XL蛋白活化[37]. 本研究小组还证明了低功率激光辐照能够通过GSK-3β未活化的机制来抑制Bax转位的上游过程[38]，以及P53不依赖于PUMA转录因子而是通过Akt/FOXO3a介导的Bax活化和细胞凋亡[39].FRET技术已被广泛应用于活细胞中蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的动态研究. 影响FRET定量检测的因素主要有光谱串扰和供体与受体的浓度比. GFP 及其变种的发现以及显微荧光技术的发展使得FRET技术在活细胞中的应用更加广泛. 本文介绍了寿命测量法、光谱法、部分受光漂白方法和敏化发射等几种常用的FRET定量检测方法，并对上述各种方法在定量检测FRET效率上进行了简单的评述.【相关文献】[1] LAKOWICZ J R. Energy Transfer: In Principles of Fluorescence Spectroscopy[M]. New York: Plenum Press, 1983.[2] CLEGG R. Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy[M]. New York: Wiley, 1996.[3] FÖRSTER T. Intermolecular energy migration and fluorescence[J]. Ann Phys, 1948, 2: 55-75.[4] VAN DER MEER B. Kappa-squared: from nuisance to new sense[J]. Rew Mol Biotechnol, 2002, 82(3): 181-196.[5] LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy[M]. 2nd ed. New York: Plenum Press, 1999.[6] PATTERSON G H, PISTON D W, BARISAS B G. Forster distances between green fluorescent protein pairs[J]. Anal Biochem, 2000, 284(2): 438-440.[7] XIA Z, LIU Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes[J]. Biophys J, 2001, 81(4): 2395-2402.[8] ELANGOVAN M, WALLRABE H, CHEN Y, et al. Characterization of one- and two-photon excitation fluorescence resonance energy transfer microscopy[J]. Methods, 2003, 29(1): 58-73.[9] HOPPE A, CHRISTENSEN K, SWANSON J A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells[J]. Biophys J, 2002, 83(6): 3652-3664.[10] MILLINGTON M, GRINDLAY G J, ALTENBACH K, et al. High-precision FLIM-FRET in fixed and living cells reveals heterogeneity in a simple CFP-YFP fusion protein[J]. Biophys Chem, 2007, 127(3): 155-164.[11] TSIEN R Y. The green fluorescent protein[J]. Annu Rev Sci, 1998, 67: 509-544.[12] SHANER N C, STEINBACH P A, TSIEN R Y. A guide to choosing fluorescent proteins[J]. Nat Methods, 2005, 2(12): 905-909.[13] LBRAHEEM A, CAMPBELL R E. Designs and applications of fluorescent protein-based biosensors[J]. Curr Opin Chem Biol, 2010, 14(1): 30-36.[14] AYE-HAN N N, NI Q, ZHANG J. Fluorescent biosensors for real-time tracking of post-translational modification dynamics[J]. Curr Opin Chem Biol, 2009, 13(4): 392-397. [15] TRAMIER M, GAUTIER I, PIOLOT T, et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells[J]. Biophys J, 2002, 83(6): 3570-3577. [16] HOPPE A, CHRISTENSEN K, SWANSON J A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells[J]. Biophys J, 2002, 83(6): 3652-3664.[17] SARKAR P, KOUSHIK S V, VOGEL S S, et al. Photophysical properties of cerulean and venus fluorescent proteins[J]. J Biomed Opt, 2009, 14(3): 034 - 047.[18] KOLNER M, WOLFRUM J. How many photons are necessary for fluorescence lifetime measurements?[J]. Chem Phys Lett, 1992, 200(1/2): 199-204.[19] LAKOWICZ J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy[M]. New York: Springer, 2006.[20] ELDER A D, DOMIN A, KAMINSKI SCHIERLE G S, et al. A quantitative protocol for dynamic measurements of protein interactions by Först er resonance energy transfer-sensitized fluorescence emission[J]. J R Soc Interface, 2009, 6(S1): S59-81.[21] THALER C, KOUSHIK S V, BLANK P S,et al. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer[J]. Biophys J, 2005, 89(4): 2736-2749.[22] WANG L X, CHEN T S, QU J L, et al. Quantitative analysis of caspase-3 activation by fitting fluorescence emission spectra in living cells[J]. Micron, 2009, 40(8): 811-820. [23] LEVY S, WILMS C D, BRUMER E, et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency[J]. Microsc Microanal, 2011, 17(2): 176-190. [24] KENWORTHY A K, EDIDIN M. Distribution of a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein at the apical surface of MDCK cells exami ned at a resolution of <100 Å using imaging fluorescence resonance energy transfer[J]. J Cell Biol, 1998, 142(1): 69-84. [25] WANG F, CHEN T S, XING D, et al. Measuring dynamics of caspase-3 activity in living cells using FRET technique during apoptosis induced by high fluence low power laser irradiation[J]. Lasers Surg Med, 2005, 36(1): 2-7.[26] WANG L X, CHEN T S, QU J L, et al. Photobleaching-based quantitative analysis of fluorescence resonance energy transfer inside Single living cell[J]. J Fluoresc, 2010, 20(1): 27-35.[27] ZAL T, GASCOIGNE N R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells[J]. Biophys J, 2004, 86(6): 3923-3939.[28] VALENTIN G, VERHEGGEN C, PIOLOT T, et al. Photoconversion of YFP into a CFP-like species during acceptor photobleaching FRET experiments[J]. Nat Methods, 2005, 2(1): 801.[29] CHEN H, PUHL H L, 3RD KOUSHIK S V, et al. Measurement of FRET efficiency andratio of donor to acceptor concentration in living cells[J]. Biophys J, 2006, 91(5): L39-41.[30] GUO W J, QIAN L, ZHANG J, et al. SIRT1 overexpression in neurons promotes neurite outgrowth and cell survival with reduced mTOR signaling[J]. J Neurosci Res, 2011, 89(11): 1723-1736.[31] CHEN T S, WANG J J, XING D, et al．Spatio-temporal dynamic analysis of Bid activation and apoptosis induced by alkaline condition in human lung adenocarcinoma cell[J]．Cell Physiol Biochem，2007，20(8)：569-578.[32] PAN W L, QU J L, CHEN T S, et al. FLIM and emission spectral analysis of caspase-3 activation inside single living cell during anticancer drug-induced cell death[J]. Eur Biophy J, 2009, 38:447-456.[33] LU Y Y, CHEN T S, WANG X P, et al. Single cell analysis of dihydroartemisinin(DHA)-induced apoptosis through reactive oxygen species (ROS)-mediated caspase-8 activation and mitochondrial pathway in ASTC-a-1 cells using fluorescence imaging techniques[J]. J Biomed Opt, 2010,15(4): 046028-1-16.[34] ZHANG W W, WANG Z P, CHEN T S. Curcumol induces apoptosis via caspases-independent mitochondrial pathway in huaman lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells[J]. Medicine Oncology, 2011, 28(1): 307-314.[35] WU Y X, XING D. CHEN W R. Single cell FRET imaging for determination of pathway of tumor cell apoptosis induced by photofrin-PDT[J]. Cell Cycle, 2006, 5(7): 729-734. [36] WU Y X, XING D, LUO S M, et al. Detection of caspase-3 activation in single cells by fluorescence resonance energy transfer during photodynamic therapy induced apoptosis[J]. Cancer Lett, 2006, 235(2): 239-247.[37] ZHANG Y J, XING D, LIU L. PUMA promotes bax translocation by both directly activating Bax and antagonizing Bcl-XL during UV-induced apoptosis[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20(13): 3077-3087.[38] ZHANG L L, ZHANG Y J, XING D. LPLI inhibits apoptosis upstream of Bax translocation via a GSK-3β-inactivation mechanism[J]. J Cell Physiol, 2010, 224(1): 218-228.[39] ZHANG Y J, ZHANG Z Z, XING D. P53-independent transcriptional regulation of PUMA by Akt/FOXO3a mediates Bax activation and cell apoptosis[J]. Cell Death Differ, 2010, in revision.。
单分子成像技术的发展现状
单分子成像技术的发展现状单分子成像技术是一种能够观察分子活动、探究生化机制的高分辨率成像技术。
其作用不仅仅局限于生物科学领域，还涉及到物理学、化学、材料学等多个学科领域。
技术的发展也离不开诸多学科的交叉与融合。
一、引言单分子成像技术最早的出现可以追溯到20世纪80年代，主要通过荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）的方法对单个荧光分子进行成像。
由于技术的限制，当时对于荧光信号的检测和信号处理还存在很大的问题。
然而，随着科技的飞速发展，扫描探针显微镜、光学共振散射显微镜、双光子激发荧光显微镜、强制调制近场显微镜等各种单分子成像技术相继问世，单分子成像技术的分辨率不断提高，对生命科学研究的价值也越来越受到重视。
二、扫描探针显微镜扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscopy，SPM）指的是一种用于观察界面的显微镜，它是通过用尖锐的金属探针在表面扫描来实现成像的。
该技术在生物化学等领域具有重要应用，可以实现对生物分子、蛋白质等的高分辨率成像。
同时，扫描探针显微镜在其它领域中也有诸如高材料的表面分析等多种应用。
三、光学共振散射显微镜光学共振散射显微镜（Optical Resonance Scattering Microscopy，ORS）是一种非荧光单分子成像技术。
相比于荧光显微镜，ORSM 技术不需要染色，不会造成光破坏，同时在信号的收集和处理上也更加灵敏。
因此，该技术具有对生物活体进行高效成像、建立生物分子与细胞之间的相互作用模型等独特的优势。
四、双光子激发荧光显微镜双光子激发荧光显微镜（Two-Photon Excitation Fluorescence Microscopy，TPE-M）是一种低光破坏，不需分子标记，对深部成像也能取得相较于传统显微镜的优越成像效果的技术。
TPE-M主要利用激光器中特定波长的激光对分子进行双光子激发，使得光子处在高能激发态，产生荧光现象。
二次谐波_双光子激发荧光显微成像技术定量评估非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝纤维化的价值 王晓晓
长，肝小叶内脂肪变形成，纤维化逐渐加重。 分别基于造模不同时间点和不同肝纤维化分期，选出 ２６ 和 ２７ 个参数；进一步采用
ＳＶＭ 模型分析筛选出 ７ 个共同参数（ ＃ＳｔｒＣＶ、＃ＳｈｏｒｔＳｔｒＣＶ、＃ＴｈｉｃｋＳｔｒＣＶ、＃ＳｔｒＰＴＡｇｇ、＃ＳｔｒＰＳＡｇｇ、＃ＬｏｎｇＳｔｒＰＳＡｇｇ 和 ＳｔｒＬｅｎｇｔｈＰＳＡｇｇ） 并进
王晓晓，等． 二次谐波／ 双光子激发荧光显微成像技术定量评估非酒精性脂肪性肝病小鼠模型
肝纤维化的价值
１７８７
（ ） （ ） ＡＵＣ ｏｆ ０． ８５７ － ０． ９２３ Ｐ ＜ ０． ０５ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｎ ＡＵＣ ｏｆ ０． ８２３ － ０． ９７６ Ｐ ＜ ０． ０５ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ
参数动态变化，找出并建立适合蛋氨酸胆碱缺乏饲料（ ＭＣＤ） 诱导的 ＮＡＦＬＤ 小鼠的自动化定量评估参数，为 ＳＨＧ ／ ＴＰＥＦ 显微成像技
方法 术应用于临床提供实验依据。 获取 ＭＣＤ 饮食小鼠不同时间点（０、４、８、１２、１６、２０ 和 ２４ 周） 的肝组织标本，行 ＨＥ、Ｍａｓｓｏｎ 和天
ｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｎｎｅｒ ｉｎ ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ．
： ； ； ； ， Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｎｏｎ － ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｉｃｅ ｉｎｂｒｅｄ Ｃ５７ＢＬ
， ， ， （ ’ ， ； ； ＷＡＮＧ Ｘｉａｏｘｉａｏ ＺＨＡＯ Ｊｉｅ ＬＩ Ｘｉａｏｈｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋｅｙ ， ， ） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４４ Ｃｈｉｎａ
同步辐射技术在生物学中的应用
同步辐射技术在生物学中的应用同步辐射技术(Synchrotron Radiation, SR)是一种高亮度、强偏振、连续谱和低时间展宽的光源，由于其在物理、材料科学和化学等领域的应用，被广泛认识和使用。
除此之外，SR技术在生物学中也有着广泛的应用，从微观到宏观，从结构到功能，都可以为生命科学研究提供重要的信息。
一、 X-射线结晶结构学晶体学是研究晶体内部结构的学科，而X-射线衍射技术是现代晶体学的核心技术之一，该技术能够解析分子内部结构，探究分子间相互作用，对于研究生命体系的结构和功能至关重要。
同步辐射技术能够提供更强的X-射线衍射光束，使得晶体衍射数据的精度更高，同时也缩短了数据收集时间和样品需求量，这对于高通量结晶筛选和结构解析等方面都具有很大的帮助。
二、倍频特征光谱学倍频特征光谱学(Two-Photon Excitation Fluorescence, TPEF)是利用倍频特性产生的激发光在生物样品中激发荧光分子，通过检测激发荧光来进行样品成像。
同步辐射技术提供了高亮度和高偏振的光束，使得TPEF成像的信噪比更高，分辨率更高，并且使得荧光标记材料的选择更加广泛。
三、 X-射线荧光光谱学X-射线荧光光谱学(X-ray Fluorescence, XRF)是利用X-射线在样品中产生的荧光来分析样品成分和组成的一种分析技术。
同步辐射技术提供了高能量、高亮度、高偏振和高纵向空间聚焦的X-射线光源，可以实现高分辨率、高灵敏度和元素选择性较高的XRF 方法。
该技术在生物地质化学、环境生态、生物医学等领域中具有较为广泛的应用。
四、 X-射线吸收光谱学X-射线吸收光谱学(X-ray Absorption Spectroscopy, XAS)是一种研究原子和分子内部结构、化学状态和相互作用的评价方法，是确定生命科学系统中特异性金属离子结合位置和键合情况的关键技术之一。
同步辐射技术的狭缝束和线探测器使得XAS信号的采集速度更快、精度更高，同时也能够探测到更低浓度的元素。
四波混频相互作用方式
四波混频相互作用方式
四波混频相互作用方式是指在物理中存在着四个波的相互作用方式。
这种相互作用方式主要有以下四种：
1. 双光子吸收（Two-photon absorption, TPA）：两个光子被共同吸收并相互作用。
这种过程可以用来产生高能量的激发态或者光学非线性响应。
2. 光折变（Optical parametric amplification, OPA）：在非线性材料中，光子可以通过与压缩光波或者拉伸光波相互作用，使得一个光子被分裂成两个较低能量的光子。
3. 光学双光子激发（Two-photon excitation, TPE）：两个光子被共同吸收，并且可以用来激发分子的高能激发态。
4. 光学参量振荡（Optical parametric oscillation, OPO）：当在非线性光学晶体中注入一个光泵浦波时，会产生一个激光输出波和一个较低频率的副波。
这种过程可以用来产生较宽的频率输出范围。
双光子激发截面
双光子激发截面双光子激发截面技术（Two-PhotonExcitationCross-Section，缩写为TPECS），又称双光子散射截面，是一种用于测量物质特性的技术。
这项技术主要用于测量各种物质分子的双光子散射截面，从而研究其光学性质，特别是同质或质化合物分子的双光子散射截面。
双光子激发截面技术，顾名思义，是指物质分子在受到两个相同波长的光子激发冲击时，会发生双光子激发反应，从而产生一种特殊的双光子散射效应。
双光子激发反应的特性决定了双光子激发截面的测量有着非常重要的意义。
双光子激发散射截面的测量有很多饱受争议的方法。
这些方法大致可以分为三类：第一类是用于测量自发双光子激发截面（Spontaneous Two-Photon Excitation Cross-Section，缩写为STPECS）的方法；第二类是用于测量非自发双光子激发截面（Non-Spontaneous Two-Photon Excitation Cross-Section，缩写为NSTPECS）的方法；第三类是用于测量双光子散射截面（Two-Photon Scattering Cross-Section，缩写为TPSCS）的方法。
不同的双光子激发截面测量方法都有其特定的优势和缺点，因此，在实际的应用中，利用多种方法来测量双光子激发截面是最可行的。
其中，STPECS和NSTPECS方法主要用于测量分子电磁学特性，TPSCS 方法则是用于测量分子构造和电子动力学行为的。
从理论上讲，双光子激发截面的测量可以用原子和分子模拟，用以获得关于分子性质的信息，这包括电磁特性及电子动力学行为等。
原子和分子模拟可以自动测量双光子激发截面，根据在分子结构上改变各种参数，可以轻松地测量出某个特定分子的双光子激发截面。
双光子激发截面的测量有很多应用。
在微纳米技术领域，双光子激发截面的测量是用来研究器件表面的特性，比如表面的光散射特性和电磁特性等。
活细胞成像技术的研究进展
活细胞成像技术的研究进展细胞是生命的基本单位，细胞内部发生的诸多过程也是生命活动的重要组成部分。
因此，对细胞内部活动的实时观察和研究显得极为重要。
近年来，随着活细胞成像技术的日益发展，人们可以实时观察细胞内部事件的发生，加深对生命科学的认识。
本文将从技术的发展历程、成像技术的种类、应用领域及前景等方面，全面阐述活细胞成像技术的研究进展。
一、技术的发展历程活细胞成像技术可以追溯到上个世纪中期。
20世纪50年代，对细胞的显微成像已经开始应用。
1953年，人类首次成功地观察到细胞内部的染色体结构和运动状态，进而推动了活细胞观察技术的发展。
60年代，出现了用荧光分析分子分布、交换、转移过程的追踪方法，成为细胞分子参与机制研究的重要手段之一。
随着计算机、数字成像技术等的发展，使得活细胞成像技术的观察精度和时间空间分辨率越来越高。
二、成像技术的种类1. 荧光共聚焦显微镜技术荧光共聚焦显微镜技术（confocal laser scanning microscopy, CLSM）是一种较为常见的活细胞成像技术，能够对生物样品进行非破坏性成像，在X-Y方向和Z方向上进行高分辨成像和立体成像。
该技术利用激光发出聚焦点，通过横向扫描样本，同时因厚度导致的散焦造成的模糊影响也被消除了。
适用于对细胞动态反应的实时成像、融合蛋白的二维和三维重建等。
2. 光片可控制镜技术光片可控制镜技术（spinning disk confocal microscopy, SDCM）是一种快速成像技术，样本成像速度快，能够用于快速成像大量细胞。
通过旋转大量的光学排列成的光片，甚至可以每秒钟旋转超过10000转对样品进行成像观察。
3. 双重共聚焦显微镜技术双重共聚焦显微镜技术（two-photon excitation fluorescence, TPEF）采用预聚焦技术，激发荧光物质由双重光子吸收，提高单点的荧光信号量，从而弱化了样品的对光损伤的效应，对于对细胞有损伤的样本有很好的应用。
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用中文摘要双光子吸收技术自问世以来一直受到了广泛的关注。
与单光子吸收材料相比，双光子吸收材料在分辨率、穿透深度具有显著的优势，可以用于显微成像、微纺织技术、三维数据存储、光限幅、上转换发光、光动力学治疗以及药物靶向释放等诸多领域。
特别是双光子显微技术，以近红外的激光为光源对生物样品进行成像，具有穿透性强，空间分辨率高，背景荧光干扰小，以及对生物样品的光损伤较小等优点，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
然而，传统的双光子材料常常具有大共轭结构，水溶性差、细胞穿透能力差、生物毒性也较大，并不适用于生物成像。
因此，设计合成具有较高双光子吸收截面的有机小分子用于生物体内细胞、血管、组织成像，具有重要的研究价值。
本文设计合成了两种具有双光子吸收特性的荧光小分子，对其发光性能进行了系统的研究，探索它们在生物成像中的应用。
具体的研究内容包括：1、设计合成了一类以寡聚苯乙烯为骨架的双光子次氯酸荧光探针OPV-HOCl，并将其应用于活细胞及组织内的双光子成像。
在寡聚苯乙烯骨架上引入次氯酸识别基团——氧硫杂环戊烷，通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS 对其结构进行了表征，并通过紫外光谱、荧光光谱等进一步研究了该探针对次氯酸的响应性能，测定了其双光子吸收截面。
加入次氯酸以后，探针分子末端的氧硫杂环戊烷基团被氧化，并生成醛基。
由于分子内强烈的电荷转移导致产物的双光子吸收截面提高了近15倍（从78.9GM提高到1131.5GM），因此OPV-HOCl可以作为一个双光子“turn-on”型次氯酸荧光探针。
此外，该探针还具有反应速度快、选择性好、pH适用范围宽等优点。
MTT实验表明该探针具有较小的细胞毒性。
由于该探针优异的次氯酸响应性能和较小的生物毒性，我们成功地将其用于小鼠胶质瘤细胞BV-2中次氯酸的检测，研究表明该探针可以透过细胞膜，并对细胞中外源性次氯酸和脂多糖诱导产生的内源性次氯酸具有高选择性的快速响应。
现代免疫分析方法最新进展
万方数据万方数据万方数据现代免疫分析方法最新进展作者：劳海苗， 吴英松， 刘天才作者单位：南方医科大学生物技术学院,广州,510515刊名：医学研究杂志英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL REASERCH年，卷(期)：2010,39(10)被引用次数：2次1.Yallow RS;Berson SA Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods 1959(Suppl 21)2.Nolan JP;Mandy F Multiplexed and microparticle-based analyses:quantitative tools for the large scale analysis of biological systems 2006(05)3.Chan WCW;Nie S Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[外文期刊]4.Dahan M;Lévi S;Luccardini C Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking[外文期刊] 2003(5644)5.Resch-Genger U;Grabolle M;Cavaliere-Jaricot S Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels[外文期刊] 2008(09)6.Patolsky F;Gill R;Weizmann Y Lighting-up the dynamics of telomerization and DNA replication by CdSe-ZnS quantum dots[外文期刊] 2003(46)7.Medintz IL;Clapp AR;Mattoussi H Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors[外文期刊] 2003(09)8.Medintz IL;Konnert JH;Clapp AR A fluorescence resonance energy transfer-derived structure of a quantum dot-protein bioconjugate nanoassembly[外文期刊] 2004(26)9.Zhang CY;Yeh HC;Kuroki MT Single-quantum-dot-based DNA nanosensor[外文期刊] 2005(11)10.Clapp AR;Medintz IL;Uyeda HL Quantum dot-based multiplexed fluorescence resonance energy transfer [外文期刊] 2005(51)11.De Pauw PE;Vermeulen I;Ubani OC Simultaneous measurement of plasma concentrations of proinsulin and C-peptide and their ratio with a trefoil-type time-resolved fluorescence immunoassay[外文期刊] 2008(12)12.Bacigalupo MA;Meroni G;Secundo F Time-resolved fluoroimmunoassay for quantitative determination of ampicillin in cow milk samples with different fat contents[外文期刊] 2008(01)13.徐伟文;吴英松;杭建峰时间分辨荧光免疫法定量检测AFP 试剂盒临床应用研究[期刊论文]-标记免疫分析与临床 2006(01)14.Bacigalupo MA;Ius A;Longhi R Homogeneous immunoassay of atrazine in water by terbium-entrapping liposomes as fluorescent markers[外文期刊] 2003(04)15.Liu L;Shao M;Dong X;Yu X Homogeneous immunoassay based on two-photon excitation fluorescence resonance energy transfer[外文期刊] 2008(20)16.McGiven JA;Sawyer J;Perrett LL A new homogeneous assay for high throughput serological diagnosis of brucellosis in ruminants[外文期刊] 2008(01)17.Ullman EF;Kirakossian H;Switchenko AC Luminescent oxygen channeling assay(LOCI):sensitive,broadly applicable homogeneous immunoassay method 1996(09)18.Wang G;Yuan J;Hai X Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay of 3,5,3′-triiodo-l-thyronine in human serum by using europium fluorescence energy transfer[外文期刊] 2006(01)19.Kimura H;Matsumoto K;Mukaida M Rapid and simple quantitation of methamphetamine by using a homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay based on fluorescence resonance energy transfer from europium to Cy5[外文期刊] 2005(08)20.Leblanc V;Delaunay V;Claude Lelong J Homogeneous time-resolved fluorescence assay for identifying p53 interactions with its protein partners,directly in a cellular extract[外文期刊] 2002(02)21.王永成;唐棣;常文宝时间分辨荧光免疫分析法间接测定雌二醇[期刊论文]-分析科学学报 2001(02)22.Uehara M;Lapcik O;Hampl R Rapid analysis of phytoestrogens in human urine by time-resolved fluoroimmunoassay[外文期刊] 2000(05)23.Bradley M;Bruno N;Vincent B Distribution of CdSe quantum dots within swollen polystyrene microgel particles using confocal microscopy[外文期刊] 2005(07)24.Wang H-Q;Liu T-C;Cao Y-C A flow cytometric assay technology based on quantum dots-encoded beads [外文期刊] 2006(01)25.Riegler J;Ehlert O;Nann T Afacile method for coding and labeling assays on polystyrene beads with differently colored luminescent nanocyrstals 200626.Fournier-Bidoz S;Jennings TL;Klostranec JM Facile and rapid one-step mass preparation of quantum-dot barcodes[外文期刊] 2008(30)27.Harma H;Soukka T;Shavel A Luminescent energy transfer between cadmium telluride nanoparticle and lanthanide(III) chelate in competitive bioaffinity assays of biotin and estradiol[外文期刊] 2007(02) 28.Weibel N;Charbonire LJ;Guardigli M Engineering of highly luminescent lanthanide tags suitable for protein labeling and time-resolved luminescence imaging[外文期刊] 2004(15)29.Charbonnire LJ;Hildebrandt N;Raymond F Ziessel Lanthanides to quantum dots resonance energy transfer in time-resolved fluoroimmunoassays and luminescence microscopy[外文期刊] 2006(39)1.王强.刘瑞宝.张立成时间分辨荧光免疫定量分析与肿瘤临床应用进展[期刊论文]-中国实用医药2009,4(28)2.刘天才.梁志伟.吴英松.LIU Tian-cai.LIANG Zhi-wei.WU Ying-song共振能量转移技术研究进展[期刊论文]-广东医学2010,31(12)1.陈玫君.陈振华.吴英松.任志奇.李思雯.刘天才基于量子点的新型均相荧光免疫分析技术[期刊论文]-中国科技论文 2013(6)2.赵红.易海英.陈亮文.何睿免疫分析快速检测三氮苯类农药残留的研究进展[期刊论文]-农业灾害研究 2011(1)本文链接：/Periodical_yxyjtx201010042.aspx。
生命科学中的新型分析技术和仪器
生命科学中的新型分析技术和仪器随着科技的不断发展，生命科学领域也迎来了一系列新型分析技术和仪器，这些新技术和仪器不仅提高了实验效率，同时也使得科研成果更加准确和可靠。
本文将重点介绍几种当前生命科学领域中的新型分析技术和仪器，并对它们的原理和应用进行探讨。
一、质谱分析技术质谱分析技术是生命科学研究中最重要的分析技术之一，它可用于分析生物大分子如蛋白质、核酸、碳水化合物等的质量、构型和化学结构。
历史上，质谱仪运用广泛在质量分析领域，直到20世纪下半叶，有了电喷雾（ESI）和飞行时间（TOF）质谱技术的推广，质谱技术逐渐进入生命科学领域。
ESI技术通过将高压电场加速生物大分子到据二次电场附近处使样品溶液中的原子和分子被电离，生成带电粒子。
之后，这些带电粒子经过弱化的电场加速器进入到质谱仪中，在高速的载气气流的作用下，分子结构不同的带电粒子呈现出不同的质荷比例，用荧光屏幕采集产生的信号，即可得到质谱图。
这种方法可用于直接检测生物分子在低pg级别量级的存在，而且不需要分离样品中的生物分子，大大加快了分析速度。
TOF质谱技术则是通过将生物大分子按质荷比或质序排列出栈，每个粒子离开质谱仪堆积出碰撞池的时候就知道自己的精确时间，最终在算法处理的帮助下，形成质谱图和碎片谱。
这种方法实现了准确的分子质量测定，可以高通量化的进行样品检测。
二、单细胞测序技术单细胞测序技术可用于研究生物体内一个个单独的细胞的转录水平和基因表达的异质性。
相比传统的样本处理方法，单细胞测序技术可以更好地去除掉组成样品的杂质细胞，减少表观差异，既丰富了我们的样本，又精细了我们的数据。
该技术的关键在于解决单细胞其低模板数量问题。
发明者通过将样品进行单独细胞形态上的鉴定和分选，然后通过内部放大和杂交的DNA合成策略对目标细胞进行RNA分析。
这种科技可帮助我们了解某个个体细胞层级发生变化所带来的物质和功能上的变化。
同时，这也为个体化治疗奠定了基础，未来可以通过单细胞测序技术帮助以一个单元格为单位的治疗。
FL应用
• Increased or decreased fluorescence，e.g. Ca2+ probes
Fig.1. pH dependence of 4MeU excitation spectra
Fig. 2 pH dependence of 4MeU emission spectra
861405 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich); FluoReporter Blue Fluorometric dsDNA 1424602 Quantitation Kit (Molecular Probes) QliGreen ssDNA Quantitation Reagent And Kit 1425382 (Molecular Probes) RiboGreen RNA Quantitation Reagent And Kit 1425382 (Molecular Probes)
21
一、核酸定量：化学发光方法
AluQuant™：
在法医实验室用于人类DNA定量 使用人类特异性重复序列的DNA探针（微卫星序列，DNA指纹） 不需要靶序列的固定或清洗步骤 不受其他物种DNA序列存在的影响，甚至是当这种DNA以超出人 类DNA10倍的量存在时 定量范围 0.1 – 50ng 用不带有人类特异性探针的相同样品做背景校准 未知样品的人类DNA浓度根据标准曲线来计算
所有的化学发光计都能检测上述两种形式的 发光
11
化学发光检测光路原理
高度敏感模式
标准模式 (滤光片)
12
发光反应的检测类型
闪光反应（Flash） 在试剂混合液上快速发光 反应在几秒钟内完成 例如，发光蛋白质，锕酯 增强的闪光反应 试剂在混合以后快速发光 在几秒钟内达到最大值 在某一时段内保持稳定 例如，萤光素酶和ATP的方法（延迟率5%每分钟）
荧光染料 染色 拉曼光谱 干扰
荧光染料染色拉曼光谱干扰1.染料的荧光发射会对拉曼光谱结果产生干扰。
The fluorescence emission of the dye will interfere with the Raman spectrum results.2.在采集拉曼光谱时，需要注意荧光染料的存在。
When collecting Raman spectra, attention should be paidto the presence of fluorescent dyes.3.染料的荧光信号可能覆盖目标物质的拉曼特征峰。
The fluorescence signal of the dye may overlap with the Raman characteristic peaks of the target substance.4.为了减少干扰，可以尝试使用非荧光染料。
To reduce interference, non-fluorescent dyes can be tried.5.使用滤波器可以帮助排除染料的荧光信号。
Using filters can help eliminate the fluorescence signal of the dye.6.需要谨慎选择染料的激发波长，以避免与拉曼光谱的激发波长重叠。
Care should be taken in choosing the excitation wavelength of the dye to avoid overlapping with theexcitation wavelength of Raman spectra.7.荧光染料的存在可能导致拉曼信噪比下降。
The presence of fluorescent dyes may lead to a decrease in the signal-to-noise ratio of Raman spectra.8.检测荧光染料的存在可以采用荧光显微镜。
活细胞内钙离子浓度的检测
活细胞内钙离子浓度的检测钙离子—第二信使钙离子在信号传导通路中发挥第二信使作用。
在细胞收缩、运动、分泌和分裂等重要活动中，均需要钙离子的参与及调节。
钙离子的信使作用是通过其浓度的升高或降低来实现的。
细胞内游离钙离子的浓度是10-8---10-7M，比细胞外钙离子浓度低104---105倍，当细胞受到特异性信号刺激后，细胞内钙库（内质网、肌浆网）的钙通道或质膜上的钙通道开放，使细胞内钙离子浓度快速升高，产生钙信号，进而使细胞内某些酶的活性和蛋白质功能发生改变，产生细胞效应。
荧光钙离子测定技术发展简史荧光钙离子浓度测定中常用的指示剂 荧光钙离子测定常用仪器荧光钙离子测定的原理及具体方法荧光钙离子测定技术发展简史In 1920s 许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定。
1962年，Shimomura 等首次分离出水母蛋白作为钙激活蛋白检测Ca 2+浓度浓度，，但其发光高峰较相应生理过程出现慢但其发光高峰较相应生理过程出现慢，，且分子量大且分子量大，，通过细胞膜及在胞浆内扩散的能力较差浆内扩散的能力较差，，难于反映细胞内Ca 2+浓度的动态变化浓度的动态变化。
1967年Ross 使用离子选择性微电极直接测定细胞内Ca 2+水平水平，，该方法简便该方法简便，，但反应时间长但反应时间长，，只能测定静息状态下的Ca 2+水平水平。
70年代用砷偶氮年代用砷偶氮ⅢⅢ（aresenazo Ⅲ）染色染色，，可定量分析钙离子变化可定量分析钙离子变化，，但用微注射技术将染料注入细胞内注射技术将染料注入细胞内，，故只能测大细胞的Ca 2+变化变化。
1980s ，Tsien 和同事合成了一种不需微注射就能进入到细胞的新荧光染料Quin2，以后又合成了Fura-2、Indo-1和Fluo-3，这些新的荧光染料被称为荧光钙探针(Fluorescent probes)或钙荧光指示剂(Fluorescent indicators)，很容易透过细胞膜进入胞内很容易透过细胞膜进入胞内，，对Ca 2+的敏感性高敏感性高。
生物医学光子学
生物医学光子学biomedical photonics 定义：运用光子学原理和技术，为医学、生物学和生物技术领域中的问题提供解决方案即构成生物医学光子学的研究内容。
生物医学光子学涉及对生物材料的成像、探测和操纵。
在生物学领域，主要研究分子水平的机理，监测分子结构与功能，在医学领域，主要研究生物组织结构与功能，能对生物体以非侵入的方式，实现宏观与微观尺度分子水平的疾病探测、诊断和治疗。
研究内容：生物医学是光子学的一个重要应用领域, 两者的交叉形成了新兴学科“ 生物医学光子学”. 主要研究内容包含: 一是生命系统中产生的光子及其反映的生命过程, 以及这种光子在物学研究、医学诊断与治疗方面的重要应用; 二 是医学光学与光子学基础和技术 , 包括组织光学、光与组织相互作用和组织工程、新颖的光诊断和光医疗技术及其作用机理的研究等. 生物医学光子学目前仅具雏形, 但其发展之快引人注目.新进展：近年来, 在国家自然科学基金、省部级基金以及其他基金项目的资助下, 我国在生物医学光子学的研究中取得了很大的进展, 尤其是2000年第152 次主题为 “ 生物医学光子学与医学成像若干前沿问题” 、第217 次主题为“ 生物分子光子学” 的香山会议后, 有许多学校和科研单位开展了生物医学光子学的研究工作, 并初步建成了几个具有代表性的、具有自己研究特色和明确科研方向的研究机构或实验室, 并在生物医学光学成像( 如optical coherence tomography, 简称OCT, 光声光谱成像, 双光子激发荧光成像, 二次谐波成像, 光学层析成像等) 、组织光学理论及光子医学诊断、分子光子学( 包括成像与分析) 、生物医学光谱、X 射线相衬成像、光学功能成像、认知光学成像、PDT 光剂量学、高时空谱探测技术及仪器研究等方面取得了显著的研究成果. 发表了许多研究论文, 申请了许多发明专利, 有些已经获得产业化. 国家自然科学基金委员会生命科学部与信息科学部联合发起并承办的全国光子生物学与光子医学学术研讨会已经举办了六届, 对我国生物医学光子学学科的发展起到了积极的推动作用. 我国近年所召开的亚太地区光子学会议中, 有关生物医学光子学的内容已大幅增加, 成为主要的研讨专题. 我国的生物医学光子学研究方兴未艾, 呈现与国际同步的态势。
时间分辨荧光寿命英文缩写
时间分辨荧光寿命英文缩写Time-resolved fluorescence lifetime (TRFL) is a technique used in spectroscopy to measure the decay time of fluorescence after excitation. It provides valuable information about the molecular environment and interactions of fluorophores. TRFL measurements are commonly used in various scientific fields, such as biology, chemistry, material science, and medical diagnostics.The most commonly used method for TRFL measurements is time-correlated single photon counting (TCSPC). In TCSPC, a pulsed laser is used to excite the sample, and the resulting fluorescence emission is collected and detected using a photon-counting detector. The detector records the arrival time of each emitted photon relative to the excitation pulse, and this information is used to build a decay curve. The decay curve represents the fluorescence intensity as a function of time, and the fluorescence lifetime can be derived from the decay curve.The fluorescence lifetime is the average time that a fluorophore spends in the excited state before returning to the ground state. It is determined by various factors, including the molecular structure, solvent environment, and the presence of other molecules that can quench or enhance the fluorescence. By measuring the fluorescence lifetime, researchers can obtain valuable information about the structure and dynamics of molecules, as well as their interactions with other molecules.TRFL measurements have been widely used in the study of biological systems. For example, in fluorescence microscopy, TRFL can be used to differentiate between different fluorophoresin a sample based on their fluorescence lifetimes. This allows for the simultaneous detection of multiple fluorophores with overlapping emission spectra. TRFL can also be used to study protein-protein interactions, DNA-protein interactions, and membrane dynamics in living cells.In the field of chemistry, TRFL can be used to study the kinetics and mechanisms of chemical reactions. By monitoring changes in fluorescence lifetime during a reaction, researchers can gain insights into reaction intermediates and transition states. TRFL can also be used to study the properties of nanomaterials, such as quantum dots and nanoparticles, as well as the behavior of dyes and sensors.In medical diagnostics, TRFL has been used in various applications, such as drug discovery, clinical diagnostics, and imaging. For example, TRFL-based assays can be used to detect and quantify specific biomarkers in clinical samples, such as blood or urine, for disease diagnosis and monitoring. TRFL imaging techniques, such as fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), can provide high-resolution images of biological samples, allowing for the visualization of molecular interactions and spatial localization of fluorophores.In summary, TRFL is a powerful technique for studying the fluorescence properties of molecules. It provides valuable information about the molecular environment, interactions, and dynamics. TRFL has applications in various scientific fields, including biology, chemistry, material science, and medicaldiagnostics, and it continues to contribute to advancements in these areas.。
BIOSPECIFIC, TWO PHOTON EXCITATION, FLUORESCENCE
专利名称：BIOSPECIFIC, TWO PHOTON EXCITATION, FLUORESCENCE DETECTION AND DEVICE 发明人：SOINI, Erkki,HÄNNINEN, Pekka,SOINI, Juhani 申请号：FI1997000704申请日：19971118公开号：WO98/025143P1公开日：19980611专利内容由知识产权出版社提供摘要：A method for measuring the end point and for monitoring the real time kinetics of a bioaffinity reaction in biological fluids and suspensions, employing microparticles as bioaffinity binding solid phase, biospecific reagent labelled with a fluorescent label and a fluorescence detection system which is based on two-photon fluorescence excitation, contacting the analyte, the labelled reagent and the solid phase simultaneously, focusing a two-photon exciting laser beam into the reaction suspension and measuring the fluorescence signal emitted by the microparticles from one particle at a time when they randomly float through the focal volume of the laser beam. In this method the signal is monitored kinetically for obtaining information about the concentration of the analyte before the reaction is approaching the highest point of the response. Since the growth rate of the signal intensity is directly proportional to the concentration of the analyte, the analyte concentration can be predicted in the initial phase of the reaction. The growth rate monitoring also predicts whether the analyte concentration is higher than the binding capacity of the reagent and whether the reaction will be continued over the highest point of the response curve. This method allows measurement of low and high concentrations without any risk for ambiguous results. The dynamic range of the assaycan also be extended significantly. Combining the features of this invention allows a method and device for performing a fast, single-step, separation free biospecific assays with large dynamic range for very small sample volumes of body fluids, cell suspensions or other biological specimens.申请人：SOINI, Erkki,HÄNNINEN, Pekka,SOINI, Juhani地址：FI,FI,FI国籍：FI,FI,FI代理机构：TURUN PATENTTITOIMISTO OY更多信息请下载全文后查看。
神经生物学中的光遗传学研究
神经生物学中的光遗传学研究随着神经科学的发展，越来越多的研究表明，光遗传学是神经科学中新发展的一个重要领域。
它结合了光学和基因学等多个领域的技术，可以用于研究解剖学和生理学级别上的神经网络。
光遗传学是通过使用类似于人工合成的光敏蛋白、多肽和小分子来操纵神经细胞的活动。
可以通过使用不同的光敏蛋白或者选择发射不同波长的光来控制蛋白的活性，从而达到控制神经细胞的目的。
其中，最早被用于研究的是双光子激光技术,TPE（Two-Photon excitation），该技术利用高强度的光束将分子激发至高能态，在经过碰撞或辐射自发跃迁后产生荧光来进行成像和控制。
随着技术的发展，多个新的光控制技术陆续出现。
如光遗传学、光控制离子通道和光调控二代荧光信号等技术的发展不断拓展了光遗传学的应用范围。
现在，光遗传学被广泛用于神经科学领域长期以来难以解决的问题。
通过操纵神经细胞活动，我们可以更好地理解神经系统功能。
例如我们是否可以通过控制某些神经细胞的活动，来治疗某些神经退行性疾病。
不同的光敏蛋白和多肽可以操纵神经元活性，实现光遗传学中的“on-off”控制，这种控制的方式允许神经元的时间和空间选择性操纵，因此可以适用于多种神经元类型以及不同神经网络中的细胞之间的同步或异步通讯。
此外，光遗传学也为我们研究阿尔茨海默病这类疾病提供了新的思路。
在阿尔茨海默病患者的大脑中，存在一种被称为β淀粉样蛋白的异常蛋白。
在光遗传学的帮助下，科学家们可以对β淀粉样蛋白的聚集进行控制，并且研究这些蛋白聚集是如何在细胞中进行的，从而可以给医生提供更好的治疗方式。
总之，我们相信光遗传学的不断进步将继续为神经科学的发展带来更多创新。
从尚未完全理解的人脑中发现答案是一个漫长但值得追求的道路，光遗传学的发展为我们打开了一扇新窗户。
双光子显微镜在小动物活体光学成像中的研究进展
双光子显微镜在小动物活体光学成像中的研究进展张文豪;李建军;杨德刚;杨明亮;杜良杰;高峰;刘长彬;李大鹏;胡安明【摘要】双光子显微镜结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术.双光子荧光显微镜具有光损伤小、漂白区域小、穿透能力强、高分辨率、荧光收集率高、图像对比度高、可实现暗场成像、适合多标记复合测量等多种特点,可应用于小动物活体光学成像,在肿瘤免疫治疗、基因治疗、干细胞研究、药物筛选与评价、活体脊髓损伤成像等领域研究中有广泛应用.%Two-photon microscopy is a new technique which combines laser scanning con-focal microscopy and two-photon excitation technique. Two-photon fluorescence microscopy has the advantages of little light damage, small bleaching area, strong penetrability, high resolution, high fluorescence collection efficiency, and high image contrast. It is suitable for dark field imaging and multi-labeled compound measurement, and has been widely used in small animals in vivo optical imaging, such as research for tumour, gene therapy, stem cells, drug development, spinal cord injury, etc.【期刊名称】《中国康复理论与实践》【年(卷),期】2017(023)001【总页数】5页(P37-41)【关键词】双光子显微镜;活体光学成像;小动物;综述【作者】张文豪;李建军;杨德刚;杨明亮;杜良杰;高峰;刘长彬;李大鹏;胡安明【作者单位】首都医科大学康复医学院,北京市 100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市 100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市 100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市 100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市 100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市 100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市 100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市 100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市 100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市 100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市 100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市 100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市 100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市 100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市100068;中国康复研究中心北京博爱医院,脊柱脊髓神经功能重建科,北京市100068;北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所,北京市 100068;北京市神经损伤与康复重点实验室,北京市 100068;首都医科大学康复医学院,北京市100068;中国康复研究中心北京博爱医院,神经外科,北京市 100068【正文语种】中文【中图分类】R446.8[本文著录格式] 张文豪，李建军，杨德刚，等.双光子显微镜在小动物活体光学成像中的研究进展[J].中国康复理论与实践, 2017,23(1):37-41.CITED AS:Zhang WH,Li JJ,Yang DG,et al.Research progress of two-photon microscopy in small animals in vivo imaging(review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(1):37-41.1931年，Maria Göppert-Mayer在博士论文中第一次提出原子或分子双光子激发的理论假设。
光动力治疗光源的研究新进展
光动力治疗光源的研究新进展梁富强;沈毅;顾瑛;布瑞恩·坎贝尔·威尔逊;李步洪【摘要】光动力疗法(PDT)是一种联合利用治疗光源、光敏剂和氧分子,选择性治疗恶性肿瘤和良性疾病的精准靶向疗法.光源作为PDT治疗的关键要素之一,其发光波长、照光方式和剂量直接影响疗效.本文详细介绍了太阳光、近红外光、X射线、在体发光和发光二极管等5种PDT光源的研究新进展,并分析了这五种治疗光源在生物组织穿透深度上的不同特性以及所存在的不足.随后,重点讨论了以提高PDT治疗精度为目标的体表照光和体内照光等两种个性化照光模式.研发操作简便、价格低廉、性能优异的新型PDT光源是未来的发展方向.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2019(028)002【总页数】12页(P97-108)【关键词】光动力疗法;光源;组织光学;近红外光;X射线;发光二极管【作者】梁富强;沈毅;顾瑛;布瑞恩·坎贝尔·威尔逊;李步洪【作者单位】福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室,福建省光子技术重点实验室,福建福州350007;福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室,福建省光子技术重点实验室,福建福州350007;中国人民解放军总医院激光医学科,北京100853;多伦多大学,生物物理与成像研究部,玛格丽特癌症研究所,大学大道610,多伦多M5G 2M9,加拿大;福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室,福建省光子技术重点实验室,福建福州350007【正文语种】中文【中图分类】R454.2光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种治疗肿瘤、老年性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和鲜红斑痣(port wine stain，PWS)等临床疾病的新型疗法[1]。
与手术、化疗和放疗等肿瘤治疗手段相比，PDT 具有双重性选择、副作用少、微创等优点[2-4]。
荧光钙离子测定常用技术
钙离子测定技术得益于两种近代实验技术，一是钙激活蛋白及荧光指示剂（或称荧光探针），二是荧光检测及成像分析，这些技术的日臻成熟使我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象。
近年来，数字CCD成像荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子扫描显微镜、流式细胞仪等技术的发展，使我们不但能够精确地测定出钙离子浓度的变化，还可以得出准确的亚细胞水平空间定位。
一、荧光钙离子测定常用技术1、荧光显微镜测定法是一类以荧光显微镜检测为基础的测量技术，可用来分析单独的完整活细胞中钙离子的分布和功能分子动力学。
然而，钙离子指示剂的性质易受细胞内环境（如pH）的影响，而且在多种细胞内现象中可见许多分子的浓度、分布、功能会同时或相应地发生一系列变化，为了研究这些细胞内现象的机制并排除测量准确性的干扰，目前多采用多参数分析。
（1）多参数数字化荧光显微镜系统（Multi-parameter digitized video microscope）多参数数字化荧光显微镜系统可允许观测单一活细胞被多种荧光指示剂标记的情况，对细胞内特定物质（细胞参数）发生特异性荧光反应。
组成该系统的几个主要部分是：装有相差或微分干涉相差的倒置（或正置）荧光显微镜、CCD数码相机（一般为高速、高灵敏度冷CCD）、可进行荧光钙离子浓度测定的图像工作站，荧光激发光源采用氙灯或汞灯，也有用激光的情形。
在荧光激发光路上放置有滤光片转轮，由软件经开关装置控制不同激发波长滤光片的转换，见图1。
CCD相机相当于一个检测器起到荧光信号检测和图像采集双重作用，采集到的荧光强度信号与钙离子浓度成正比，经软件分析得出细胞内钙离子浓度，钙离子浓度的基本计算方法见下式：①单波长测定[Ca2+]=Kd（F－Fmin）/ （Fmax－F）式中Kd为荧光剂与Ca2+形成复合物的解离常数。
Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。
②双波长测定系用比值（Ratio）信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，不必校正。