蛋白质复性方法及其注意事项

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变性蛋白的复性

用变性剂洗涤沉淀。 2、包含体的溶解
打断包含体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使多肽链伸展。
溶解采用强的变性剂，如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，SDS，各种溶解方法都各有利弊。
含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。
加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。
三、包含体蛋白复性方法
几个要求： ➢活性蛋白的回收率高 ➢正确的复性的产物易于与错误的折叠
６．加20％PEG4000至终浓度为0.2％，加50mM的氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽至终浓度为２mM,静置30min至２h（亦可４℃复性过夜）。７. 以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出-20℃保存备用。
8 .检验复性是否成功。 Buffer A配方：
ELISA,Immunoblotting • 受体结合实验（ Receptor Binding） • 各种高效液相分析法（HPLC） • 肽图分析法 • Edman N 末端序列分析法 • 圆二色谱（CD） • NMR
1.生物活性测定：需要动物体内实验和通过细胞培养进行体外效价测定。体内生物学活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型，体外生物活性测定有细胞计数法等。重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。
五、目标产品的质量控制

蛋白质变性与复性

蛋白质变性不涉及共价键的断裂，变性后的蛋白质仍保持完整的氨基酸序列。
变性因素
物理因素
高温、紫外线、X射线、超声波、剧烈搅拌等。
化学因素
强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂、尿素、胍等。
变性蛋白质的特点
生物活性丧失
变性后蛋白质的空间构象被破坏，导致其生物活性丧失。
溶解度下降
变性后蛋白质的疏水性氨基酸暴露出来，导致其在水中的溶解度下降。
成本问题
蛋白质变性与复性的实验条件要求高，需要精密的设备和专业的操作，增加了研究和应用的成本。
未来发展方向
新技术的应用
随着生物技术的不断发展，未来可以利用基因工程和蛋白质工程等技术手段，定向改造蛋白质，提高其稳定性和复性效率。
深入研究机制
拓展应用领域
随着蛋白质变性与复性技术的不断进步，未来有望在生物工程、制药、医疗等领域得到更广泛的应用。
进一步深入研究蛋白质变性与复性的机制，有助于更好地理解这一过程，为解决相关问题提供理论支持。
对人类生活的影响
1 2 3
生物工程领域
蛋白质变性与复性技术的突破将有助于提高生物工程产品的质量和产量，推动相关产业的发展。
制药领域
优化蛋白质药物的生产过程，降低生产成本，提高药物的稳定性和疗效，为人类疾病的治疗提供更多有效的药物。
蛋白质复性

蛋白复性

包涵体的变性及复性

1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；

2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静

置至完全溶解；

3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：

1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；

4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，

离心收集蛋白液；

5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。

注意：

透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。

复性过程的添加剂：

1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。

2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。

3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程

返回:包涵体复性常见问题分析与解决

包涵体的纯化与复性总结

包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点:较高的活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白;折叠复性方法易于放大等。蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤:

包涵体的洗涤

包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。

包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂,如2M尿素在50mM Tris,pH7、0-8、5,1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温与去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。同时,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl,使包涵体的纯度达到50%以上。

包涵体的溶解

变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白分子间的各种化学键,使多肽延伸。盐酸胍就是较尿素强的变性剂,它能溶解尿素不溶的包涵体。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。

另外,从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体,通常含有一些链间形成的二硫键与链内的非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形成与断裂就是可逆的,直到最有利的蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。

名词解释蛋白质的复性

蛋白质的复性：现象与意义

在生物化学领域中，蛋白质的复性是一个广泛而重要的研究课题。复性是指蛋白质经历一系列空间结构和功能的调整，重建其原有的三维结构以及所能发挥的功能。本文将探讨蛋白质复性的现象、机制以及其在生物体内的意义。

1. 蛋白质的复性现象

复性是蛋白质遭受外部环境的一系列不良条件（如高温、极酸或极碱性条件、化学变性剂等）后，通过一定机制修复并重获原有结构与功能的过程。在这个过程中，蛋白质的一级、二级和三级结构受到损伤，导致其失去正常功能。

蛋白质的复性可以发生在细胞内部和细胞外部。在细胞内，复性通常由分子伴侣和分子伴侣系统促进，如分子伴侣热休克蛋白HSP70、HSP90等。这些分子伴侣通过与蛋白质相互作用，引导失去结构的蛋白质重新折叠成正确的形式，并防止其在复性过程中发生聚集。

2. 蛋白质的复性机制

复性过程涉及多个事件和步骤，其中最为关键的是解聚和折叠。解聚是指复性过程中产生的不正常和不稳定的蛋白质聚集体分解为单体。这个步骤由分子伴侣和其他调节蛋白质负责。

折叠是指蛋白质通过一系列无序到有序的结构变化，重新将其折叠成正确的三维构象。折叠的过程中，分子伴侣系统与其他辅助蛋白质（如折叠辅助酶和蛋白激酶等）相互作用，协助和促进正确的二级和三级结构的形成。

此外，糖基化也被认为是蛋白质复性的关键机制之一。在糖基化过程中，糖链与特定氨基酸残基结合，形成糖蛋白复合物。这种复合物不仅能帮助维持蛋白质的稳定性，还可促进正确的折叠。

3. 蛋白质复性的意义

蛋白质的复性在维持生物体内正常的生理功能中起着至关重要的作用。在细胞内，复性可以防止异常蛋白质的聚集和沉积，减轻内环境的毒性。

体外蛋白质复性方法及小分子添加剂在复性过程中的作用_余秀娟

来稿日期：２０１３－０３－

０６作者简介：余秀娟（１９８４－）

，女，河北张家口人，硕士，河北北方学院药学系助教，从事蛋白质药物的制备及其分离纯化研究。体外蛋白质复性方法及小分子添加剂在复性过程中的作用

余秀娟１，赵丽艳１，张晓光２

（１．河北北方学院药学系，河北张家口０７５０００；２．中国特种设备检测研究院，北京１０００１３

）摘要：变性蛋白质体外复性的方法主要有传统的辅助复性法包括了：稀释法、透析法、超滤法以及蛋白质折叠液相色谱法（ＰＦＬＣ），也有在此基础上模拟体内分子伴侣、折叠酶、人工分子伴侣、反胶束的辅助复性方法。到目前为止，在复性液中添加小分子试剂是提高体外辅助蛋白质复性效率的策略之一。其目的是为了降低蛋白质复性过程中聚集形式的形成，从而促进变性蛋白质向其天然和活性构象的转变。这种方法在一定程度上能够提高蛋白质的复性效率并且得到了长足的发展。为了捕捉变性蛋白质向其活性结构折叠过程的差异性变化规律，明确小分子添加剂对体外辅助蛋白质分子折叠过程的机制，推测一些小分子添加剂辅助蛋白质色谱复性过程中构象的变化规律，为解决包涵体蛋白质难于复性和复性效率低的问题起到指导性的作用。

关键词：小分子添加剂；蛋白折叠液相色谱法；蛋白质复性；包涵体蛋白中图分类号：Ｑ　

５１８．４文献标识码：Ａ　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ

．ｉｓｓｎ．１６７３－１４９２．２０１３．０２．００４１　引　言

蛋白质是维持生命体正常进行的必不可少的物质，也是生命遗传的第二代密码。蛋白质的复性或折叠问题是生命科学研究中的核心问题之一，蛋白质从它的变性状态转变到它特定的生物学天然构象称为蛋白质复性，这个过程并不复杂。但是，一直以来将变性蛋白质恢复其天然的活性构象却是一项很艰难的工作。

蛋白的变性和复性

变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.

蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.

变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。

引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。

蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：

（一）生物活性丧失

蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。

蛋白的变性和复性

蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：

（一）生物活性丧失

蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。（二）某些理化性质的改变

蛋白质变复性.

一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用

二、包涵体变复性

三、包涵体洗涤纯化——7~10

四、包涵体提出、纯化和复性

一、

二、包涵体变复性

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。

基本信息

中文名称

包涵体变复性

复性方法

稀释复性

原因

基因工程菌的表达产率过高

包涵体变性

破菌洗涤溶解

1包涵体

2包涵体变性

3包涵体复性

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

包涵体的形成原因

主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白前期准备

（1）查阅目标蛋白相关文献,了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1—2mMDTT，全程低温，及时处理。（3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性

包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来,这些包涵体

蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(1）退一步，优化表达条件;(2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤

破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少,加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8。0), 2mM EDTA，2mM DTT，150mM NaCl，1％Triton X—100，1mg/ml Leupeptin，1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。

超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装

40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来。菌多就延长超声时间(全程冰浴）。

蛋白质复性技术

一、基本原理
2、包含体破菌、分离、洗涤及溶解 • （1）破菌、分离：基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包含体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包含体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g 15min离心，可使大多数包含体沉淀，与可溶性蛋白分离。
一、基本原理
• （4）色谱复性：在色谱的过程中实现复性，称为色谱复性法。优点在于，色谱固定相对变性蛋白质吸附性能低，甚至完全消除，变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂质蛋白质分离，达到复性和纯化的双重效果。
一、基本原理
一、基本原理
• （2）分子伴侣和折叠酶等这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。
一、基本原理
• 复性效果的检测：根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。方法主要有：凝胶电泳、光谱学方法、色谱方法、生物学活性及比活测定、黏度和浊度测定、免疫学方法

第3章(2) 蛋白质变性与复性

Unfolding and Refolding
变性与复性
• 1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、尿素、重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白质变性。弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保持一定构型；强变性条件下，蛋白质完全变性肽链伸展成无序随机状态。
变性与复性
缺点：过程缓慢，耗时间长，效率低。
对某些蛋白质复性率高于稀释复性法。
色谱复性法
在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。优点是：
• 色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低，甚至完全消除提高复性质量和活性收率。
达到复性与纯化同时进行的目的。 • 便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。方法：凝胶过滤色谱(GFC)、离子交换色谱(IEC)、亲合色谱(AFC).
其他——反胶束萃取复性法
反胶束萃取复性与稀释复性相比较
提高复性率的策略
1、二硫键的形成拥有多重二硫键的蛋白，需要更复杂的再折叠过程，要求氧化剂和还原剂都在最佳的浓度下，以便于二硫键的形成。 2、小分子添加物
降低蛋白聚集的策略是使用小分子添加剂，如丙酮、乙酰、尿素、去污剂、蔗糖、短链醇、DMSO和PEG等。最常用的是Ｌ－精氨酸、低浓度（1-2M）尿素或盐酸胍以及去污剂（SDS）。
各种色谱复性方法的比较
• 亲合色谱(AFC)复性法：因蛋白质与介质有特异的相互作用，变性蛋白质分子间聚集反应少，使原不可逆折叠的蛋白质变成可逆。但使用范围窄，分子伴侣昂贵，时间长。色谱复性方法的问题：

层析复性蛋白质

影响凝胶过滤层析复性蛋白质的收率的两个重要因素
第一个是变性条件下蛋白质的上样，第一个是变性条件下蛋白质的上样，第二个是复性缓冲液中蛋白质结构的变化。第二个是复性缓冲液中蛋白质结构的变化。从 Sephacryl S-100 到S-400，介质的分离范围变大，，介质的分离范围变大，降低了聚集体的形成，降低了聚集体的形成，但是折叠的蛋白质与变性剂的分离效率降低了。对于分子量为45Kd 的蛋白质，的蛋白质，的分离效率降低了。对于分子量为其最优的层析介质应该是Sephacryl S-300。其最优的层析介质应该是。蛋白质上样量也会影响蛋白质复性收率，蛋白质上样量也会影响蛋白质复性收率，因为在层析柱的顶端会因为上样量的增加而发生结构的聚集。析柱的顶端会因为上样量的增加而发生结构的聚集。
在变性剂浓度梯度降低的同时，在变性剂浓度梯度降低的同时，或者提高或者降低复性缓冲液中的pH值或者降低复性缓冲液中的值，可以使含有二硫键的蛋白质的复性效率大大提高。有二硫键的蛋白质的复性效率大大提高。在复性Fe-SOD 的过程中，双梯度离子交的过程中，在复性换层析方法显示了其优越性。换层析方法显示了其优越性。
最近层析复性方法成为研究的热点，最近层析复性方法成为研究的热点，不仅可以降低聚集体的形成，以降低聚集体的形成，还可以适用于大规模生产，同时对目标蛋白质有纯化作用。生产，同时对目标蛋白质有纯化作用。

蛋白质复性的条件及影响因素_cropped

摘要蛋白质复性是一个过程 ,存在中间阶段 ,此阶段的各种相互作用

力决定了蛋白质能否复性。蛋白质复

性要求有一定的条件 ,如 p H、温度、离子强度、蛋白质浓度等。另外多种添加剂能促进蛋白质复性 ,其中包括表面

活性剂、低浓度变性剂、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对 ,但对于不同

蛋白质 ,因其结构及理化特性不同 ,采取不同

复性方法 ,可以使其达到最佳复性效果。

关键词蛋白质 ; 结构与复性

蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分,某些脯氨酸异构酶在含有脯氨酸的变性蛋白结构

质中被证明对复性有辅助作用。来源于不同物种中子物质 ,易受外界条件的影响发生变性。随着基因

的同一蛋白质在氨基酸排列顺序上会存在不同程度工程技术的发展 ,许多

实验通过将目的蛋白基因转入原核或真核表达体系进行表达的方法 ,得到需

要的差异 , 但其折叠方式却有很大的保守性。Wal2

3 的蛋白质 ,这大大丰富了蛋白质的来源。但这些蛋 lace 研究了来

源于大肠杆菌、人和乳酸杆菌的二氢白质 ,由于表达体系本身的原因 , 或实验过程的处叶酸还原酶的复性 ,虽然这 3 种蛋白在氨基酸顺序

理 ,多以无活性的形式存在 ,需要进行复性。因此 , 上只有 30 %相同 ,但是却具有相同的复性途径和两对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生个中间体。蛋白质的空间结构由一系列化学键来维物工程研究到最终临床应

用过程中不可避免的一系 ,其中二硫键是维系蛋白质结构完整的重要共价步。本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研键 ,二硫键的打开或错误搭配会引起蛋白质高级结究作一综述。构的丧失 ,恢复二硫键结构是蛋白质复性的重要一

包涵体复性注意事项和常见问题解析

返回:包涵体复性介绍及包涵体复性操作方法

包涵体复性注意事项

1.最适pH值范围为8.0-9.0之间;

2.温度适宜选择4℃;

3.复性过程蛋白浓度不宜过大,一般为0.1-0.2mg/mL;

4.复性时间一般为24-36小时;

5.低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度;脲、盐酸胍、烷基脲、

以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂,都可阻止蛋白聚

集;Tris 对蛋白质复性有促进作用;EDTA可以防止蛋白降解;

6.首先要获得较高纯度的包涵体;

7.包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大,不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施;

8.透析前后均要离心;

9.包含体要彻底洗涤干净,洗涤液中加入适量Triton-X100;

10.包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性;

11.复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ;

12.复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定

13.TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除,在制药行业中一般不允许采用。用

Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步,改变培养条件,再洗涤包涵体,有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带,这样后续的纯化就很方便了。

14.复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度

不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。

包涵体复性常见问题分析

包涵体复性原则

低浓度,平缓梯度,低温。

怎样洗涤包涵体?

通常的洗涤方法一般是洗不干净的,可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分,过滤除去未溶解的物质,注意留样跑电泳,然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以一直稀释到合适的浓度,可以找到一个合适去除杂质的办法,其实这就是梯度沉淀的方法,比通常的直接洗脱效果好。

蛋白的变性和复性

蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：

（一）生物活性丧失