蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白复溶方法
蛋白复溶方法1. 简介蛋白复溶是将被冻结的蛋白质重新溶解为可用的形式的过程。
在蛋白质研究和生物工程中，蛋白复溶方法是非常重要的，因为冻结蛋白质常常会导致其变性和失活。
本文将介绍几种常用的蛋白复溶方法，包括直接溶解、逐渐稀释、温度递增和使用蛋白复溶缓冲液。
2. 直接溶解法直接溶解法是最简单的蛋白复溶方法之一。
它适用于那些易于溶解的蛋白质，特别是在低温下冻结的蛋白质。
以下是该方法的步骤：1.取出冻结的蛋白质样品，并将其放置在冰上或在低温环境中。
2.缓慢地加入适量的蛋白质溶解缓冲液，同时轻轻搅拌样品。
3.继续在低温下搅拌样品，直到蛋白质完全溶解。
需要注意的是，直接溶解法可能不适用于那些易于聚集的蛋白质，因为直接加入溶解缓冲液可能会导致进一步的聚集。
3. 逐渐稀释法逐渐稀释法是一种常用的蛋白复溶方法，适用于那些易于聚集的蛋白质。
该方法通过逐渐稀释蛋白质样品来减少聚集的可能性。
以下是该方法的步骤：1.取出冻结的蛋白质样品，并将其放置在冰上或在低温环境中。
2.缓慢地加入一小部分蛋白质溶解缓冲液，同时轻轻搅拌样品。
3.重复步骤2，逐渐增加蛋白质溶解缓冲液的体积，直到蛋白质完全溶解。
逐渐稀释法的优点是可以减少聚集的可能性，但需要耐心和时间。
4. 温度递增法温度递增法是一种根据蛋白质的热稳定性逐渐升高温度来实现蛋白复溶的方法。
该方法适用于那些在低温下冻结的蛋白质。
以下是该方法的步骤：1.取出冻结的蛋白质样品，并将其放置在冰上或在低温环境中。
2.缓慢地加入适量的蛋白质溶解缓冲液，同时轻轻搅拌样品。
3.将样品转移到较低的温度（如4°C）并继续搅拌，直到蛋白质完全溶解。
4.逐渐增加样品的温度，例如每隔10分钟增加1°C，直到达到所需的温度。
温度递增法的优点是可以逐渐恢复蛋白质的结构和活性，但需要严格控制温度和搅拌条件。
5. 使用蛋白复溶缓冲液蛋白复溶缓冲液是一种专门设计用于蛋白复溶的缓冲液。
它通常包含一些特殊的添加剂和条件，以帮助蛋白质的溶解和恢复。
蛋白复溶方法
蛋白复溶方法【实用版1篇】篇1 目录1.蛋白复溶方法的背景和意义2.蛋白复溶方法的常用类型3.各类蛋白复溶方法的优缺点分析4.蛋白复溶方法在实际应用中的案例5.蛋白复溶方法的未来发展趋势篇1正文一、蛋白复溶方法的背景和意义随着生物科学和生物技术的快速发展，对蛋白质的研究越来越深入。
在蛋白质研究过程中，样品的处理与保存是一个重要环节。
蛋白质复溶方法就是针对蛋白质样品在实验过程中的溶解与保存问题而发展起来的。
采用合适的蛋白复溶方法可以保证蛋白质的结构和功能不变，从而确保实验结果的准确性。
二、蛋白复溶方法的常用类型目前常用的蛋白复溶方法主要有以下几种：1.透析法：通过半透膜将小分子物质与大分子蛋白质分离，达到复溶目的。
2.稀释法：通过逐步加入适量的溶剂，降低蛋白质溶液的浓度，使其溶解。
3.酸碱法：调节溶液的 pH 值，使蛋白质在不同 pH 条件下的溶解度发生变化，从而达到复溶目的。
4.有机溶剂法：利用有机溶剂对蛋白质的溶解作用，使其溶解。
5.表面活性剂法：通过表面活性剂的作用，降低蛋白质溶液的表面张力，增加蛋白质的溶解度。
6.蛋白酶解法：通过蛋白酶的作用，将蛋白质分解为小分子肽段，从而提高其溶解度。
三、各类蛋白复溶方法的优缺点分析各类蛋白复溶方法都有其优点和缺点，选择时应根据实际需求和实验条件综合考虑。
例如，透析法能够有效去除小分子物质，但对蛋白质结构影响较大；稀释法操作简单，但对蛋白质浓度要求较高；酸碱法和有机溶剂法对蛋白质结构影响较小，但可能导致蛋白质变性。
四、蛋白复溶方法在实际应用中的案例蛋白复溶方法在实际应用中具有广泛的应用价值。
例如，在蛋白质纯化过程中，采用透析法可以去除样品中的盐分和小分子杂质；在蛋白质结晶研究中，通过酸碱法和有机溶剂法可以调整蛋白质的溶解度，促进结晶的形成。
五、蛋白复溶方法的未来发展趋势随着科学技术的进步，蛋白复溶方法将不断优化和改进。
未来，新型的蛋白复溶方法将更加高效、简便、温和，以满足不断增长的蛋白质研究需求。
蛋白复性
包涵体的变性及复性1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。
注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。
复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
名词解释蛋白质的复性
名词解释蛋白质的复性蛋白质的复性：现象与意义在生物化学领域中，蛋白质的复性是一个广泛而重要的研究课题。
复性是指蛋白质经历一系列空间结构和功能的调整，重建其原有的三维结构以及所能发挥的功能。
本文将探讨蛋白质复性的现象、机制以及其在生物体内的意义。
1. 蛋白质的复性现象复性是蛋白质遭受外部环境的一系列不良条件（如高温、极酸或极碱性条件、化学变性剂等）后，通过一定机制修复并重获原有结构与功能的过程。
在这个过程中，蛋白质的一级、二级和三级结构受到损伤，导致其失去正常功能。
蛋白质的复性可以发生在细胞内部和细胞外部。
在细胞内，复性通常由分子伴侣和分子伴侣系统促进，如分子伴侣热休克蛋白HSP70、HSP90等。
这些分子伴侣通过与蛋白质相互作用，引导失去结构的蛋白质重新折叠成正确的形式，并防止其在复性过程中发生聚集。
2. 蛋白质的复性机制复性过程涉及多个事件和步骤，其中最为关键的是解聚和折叠。
解聚是指复性过程中产生的不正常和不稳定的蛋白质聚集体分解为单体。
这个步骤由分子伴侣和其他调节蛋白质负责。
折叠是指蛋白质通过一系列无序到有序的结构变化，重新将其折叠成正确的三维构象。
折叠的过程中，分子伴侣系统与其他辅助蛋白质（如折叠辅助酶和蛋白激酶等）相互作用，协助和促进正确的二级和三级结构的形成。
此外，糖基化也被认为是蛋白质复性的关键机制之一。
在糖基化过程中，糖链与特定氨基酸残基结合，形成糖蛋白复合物。
这种复合物不仅能帮助维持蛋白质的稳定性，还可促进正确的折叠。
3. 蛋白质复性的意义蛋白质的复性在维持生物体内正常的生理功能中起着至关重要的作用。
在细胞内，复性可以防止异常蛋白质的聚集和沉积，减轻内环境的毒性。
此外，蛋白质复性还与许多重要的生物过程密切相关。
例如，蛋白质折叠失常与多种神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病相关。
了解复性过程可以帮助我们深入了解这些疾病的发生机制，并为研发相关的治疗方法提供新的思路。
另外，蛋白质复性也对生物技术领域具有重要意义。
色谱法使蛋白质复性的流程
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蛋白质复性技术
一、基本原理
• （4）色谱复性：在色谱的过程中实现复性， 称为色谱复性法。优点在于，色谱固定相 对变性蛋白质吸附性能低，甚至完全消除， 变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集， 产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在 蛋白质复性 的同时可使目的蛋白质与杂质 蛋白质分离，达到复性和纯化的双重效果。
一、基本原理
蛋白质复性
一、基本原理
1、包含体 • 是指以大肠杆菌为宿主细胞的基因表达产物由 于不能分泌到细胞外，而在细胞内聚集形成的 没有生物活性的固体颗粒。 • 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体 元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以 及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很 高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶 性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
一、基本原理
• （2）洗涤：为了除去包含体上粘附的杂质， 如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包含体， 通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或 盐酸胍会使包含体溶解，如2M尿素洗涤。 此外可以用温和去垢剂洗涤去除膜碎片和 膜蛋白。
一、基本原理
• （3）溶解：一般用强的变性剂如尿素、盐 酸胍通过离子间的相互作用，打断包含体 蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使 多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素， 因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使 尿素不能溶解的包含体溶解，而且尿素分 解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲 酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。
一、基本原理
3、蛋白质复性
• 由于包含体中的重组蛋白缺乏生物学活性， 加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构 破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通去除还原剂使二硫键正常形成。
一、基本原理
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
蛋白质复性
选用复性方法的原则：在包含体蛋白质的复性中， 若利用盐酸胍或尿素溶解包含体，应首先考虑通 过调节盐酸胍或尿素的浓度来获得满意的复性效 果。只有在复性效果不佳的情况下才考虑其他添 加剂。 表面活性剂、添加剂的去除是必须考虑的问题。
蛋白质复性（二）
本章内容
包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 稀释复性、辅助因子的作用 分子伴侣和人工分子伴侣
本章重点
蛋白质复性的概念 包含体的概念及性质 蛋白质折叠的简化动力学模型（形成的机理） 包含体体内抑制策略 包含体分离纯化的一般方法和步骤 包含体的溶解方法 稀释复性的原理 蛋白质复性中常用的辅助因子及其作用
1.稳定天然态蛋白质的结构，降低错误 折叠蛋白质的稳定性
如甘油
2.提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度 (稳定性)
如低浓度变性剂、聚乙二醇（PEG)、表面活 性剂
辅助蛋白质复性的稀释添加剂
分类 低浓度变性剂 氨基酸 表面活性剂 物质名称 盐酸胍(0.5-2mol/L) 尿素(1-4mol/L) L-精氨酸 聚乙二醇 Triton X-100 十二烷基磺酸钠 十六烷基三甲基溴化胺 月桂醇麦芽糖苷 吐温 磷脂
4 蛋白质复性（了解）
1961年，Anfinsen发现，在自由能驱动下， 变性后的牛胰核糖核酸酶(RNase A)可在体外 通过空气氧化自发形成正确的二硫键。 提示了蛋白质一级结构和高级结构的关系。 蛋白质的一级结构含有其折叠成熟所需的全部 信息，变性的蛋白质在一定条件下可以完全自 发地恢复活性。 变性蛋白质溶解在高浓度变性剂中，降低变性 剂浓度至非变性浓度范围，就可引发蛋白质折 叠复性。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
蛋白复溶方法
蛋白复溶方法蛋白复溶方法简介蛋白复溶方法是一种将蛋白质从其失活的状态中恢复活性的技术。
在生物科学研究中，蛋白复溶方法扮演着非常重要的角色。
本文将介绍几种常见的蛋白复溶方法。
热处理法1.简介：热处理法是一种通过加热样品来消除蛋白质的失活状态的方法。
2.步骤：–将失活的蛋白质样品加热到适当的温度。
–在一定时间内保持温度。
–快速冷却样品。
3.适用性：热处理法适用于大多数失活的蛋白质，并且可以在较短时间内完成。
溶剂法1.简介：溶剂法是一种通过在特定溶剂中溶解蛋白质来消除其失活状态的方法。
2.步骤：–将失活的蛋白质样品加入适量的溶剂中。
–充分搅拌或振荡样品溶液。
–将蛋白质样品离心，去除杂质。
3.适用性：溶剂法适用于溶解度较高的蛋白质，能够有效恢复其活性。
pH调节法1.简介：pH调节法是一种通过调节溶液的pH值来改变蛋白质的环境，从而恢复其活性的方法。
2.步骤：–测定蛋白质溶液的pH值。
–根据蛋白质的理化性质，调节溶液的pH值。
–对蛋白质溶液进行离心或过滤，去除杂质。
3.适用性：pH调节法适用于那些对pH值敏感的蛋白质。
添加辅助剂法1.简介：添加辅助剂法是一种通过向蛋白质溶液中添加某些物质来改善蛋白质的活性。
2.步骤：–根据蛋白质的特性选择合适的辅助剂。
–将辅助剂加入到蛋白质溶液中，搅拌均匀。
–对蛋白质溶液进行进一步的处理，如离心或过滤。
3.适用性：添加辅助剂法适用于那些对特定物质敏感的蛋白质，如金属离子等。
总结蛋白复溶方法根据不同的实验需求和蛋白质特性，可以选择合适的方法来恢复失活的蛋白质的活性。
热处理法、溶剂法、pH调节法和添加辅助剂法是常见的蛋白复溶方法，它们在生物科学研究中具有重要的意义。
研究人员可以根据具体实验情况选择最合适的方法来恢复蛋白质的活性。
冷冻融化法1.简介：冷冻融化法是一种通过冷冻蛋白质样品来恢复其活性的方法。
2.步骤：–将失活的蛋白质样品迅速冷冻到低温。
常用的方法是将样品浸泡在液氮中。
蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备( 1)查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
(2)如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
( 3)透析Buffer 的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体( Inclusion Bodies，IB)。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑： (1)退一步，优化表达条件；(2)接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCI(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT150mM NaCI, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液，因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯装40-60ml裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来.菌多就延长超声时间(全程冰浴)。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白质复性名词解释
蛋白质复性名词解释蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，是构成生物体各种组织和器官的重要成分。
蛋白质的功能多样，可以参与生物体内的酶催化、结构支持、运输、通信、能量存储、免疫防御等重要生理过程。
蛋白质的复性是指它的折叠状态和三维结构。
蛋白质synthesized 是在生物体内通过一系列复杂的生物化学反应合成的，但它不是以线性链的形式存在，而是经过折叠和组装形成复杂的三维结构。
这个过程被称为蛋白质的折叠，而折叠之后形成的三维结构就是蛋白质的复性。
蛋白质的复性是非常关键的，因为它决定了蛋白质的功能和稳定性。
如果蛋白质的复性受到破坏，它可能失去原有的生物活性和功能。
例如，当蛋白质的复性受到变性剂（如酸、碱、高温等）的作用时，蛋白质的结构可能会发生改变，导致其在生物体内无法正常发挥作用。
蛋白质的折叠和复性是一个自发的过程，在正常生理条件下，蛋白质可以自行正确地折叠成其稳定的复性。
但有时蛋白质的折叠过程会出现错位或失败，导致其形成不正确的复性。
这种情况下，被称为蛋白质的错折，错误复性的蛋白质可能会失去原有的功能，甚至产生有害的效应。
蛋白质折叠和复性的控制是一个复杂的过程，涉及到多个层面的调节。
通常，蛋白质的折叠主要由其氨基酸序列所决定，不同氨基酸之间的相互作用力（如氢键、离子相互作用、范德华力等）在折叠过程中扮演重要的角色。
此外，还有一些蛋白质专门参与蛋白质折叠和复性的分子辅助工具，如分子伴侣和分子伴侣辅助因子等，它们能够帮助蛋白质正确折叠和达到稳定的复性。
总之，蛋白质的复性是指其折叠和组装成稳定的三维结构的过程，它对蛋白质的功能和稳定性起着关键作用。
探索蛋白质复性的机制对于理解生物大分子的结构与功能具有重要意义，也对于研究蛋白质相关疾病和开发药物具有重要价值。
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蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
(1)査阅U标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
(2)如果日标蛋白易降解，可在纯化时加l-2mMDTT,全程低温，及时处理.
(3 )透析Buffer得选择可参考文献。
蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子，它们
致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性得结构称
为包涵体(Indus! on Bod i es» I B)。
在E、co li中累积得重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包
涵体蛋白就是丧失生物活性得不可溶得错误折叠蛋白得聚集体.
包涵体得处理一般包括这么儿步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋0在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(2)退一步/尤化
表达条件；(2)接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性•这里主要考虑第二
种方案。
包涵体得洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物
降解，导致天然物质量得减少,加入蛋0酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于U得物质得提取。
2mM EDTA, 2mM D 洗涤Buf f e r :50mM T r i s -H CI (pH8、0),
TJr 1 5 0 mM NaCI, l%Tn t on X—1 0 0, Img/ml Lwupe p t in^ Img/ml P
epstat in, ImM TCER
超声时用40— 6 0 ml裂解液'因为我们得超声仪很适合用1 0 0 ml小烧
杯，装4 0-60m I裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来、菌
多就延长超声时间(全程冰浴)•
包涵体得溶解
I、对于尿素与盐酸M得选择:
尿素与盐酸属中强度变性剂，易经透析与超滤除去。
它们对包涵体氢键有
较强得可逆性变性作用，所需浓度尿素8-1 0M.盐酸肌6-8M。
尿素溶解包涵
体较盐酸慢而弱，溶解度为7 0 — 90%,尿素在作用时间较长或温度较高时会裂
解形成氤酸盐，对重组蛋白质得氨基进行共价修饰/旦用尿素溶解具有不电离，呈
中性，成本低，蛋口质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解得包涵体可
选用多种色谱法纯化等优点，故U前已被广泛采用。
盐酸M溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修
饰。
但它也有成本高.在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白
质沉淀与对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2、去垢剂:
温与去垢剂Tr i tonX-I 0 0洗涤去除膜碎片与膜蛋0。
如强得阴离子去
垢剂SDS,可以破坏蛋白内得疏水键，可以增溶儿乎所有得蛋白。
问题就是山
于S DS无法彻底得去除而不允许在制药过程中使用。
包涵体得复性
1复性:
通过缓慢去除变性剂使U标蛋0从变性得完全伸展状态恢复到正常得折
叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
2复性得效率:
复性就是一个非常复杂得过程,蛋口质得复性效率在20%左右•影响复性
效率得因素有蛋口质得复性浓度，变性剂得起始浓度与去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂与其她添加剂得存在与否等。
4、复性中常采用得方法有: 稀释复性:直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点就是体积增
加较大，变性剂稀
释速度太快，不易控制。
透析复性：好处就是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去
除速度，缺点就是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多得使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺
点就是不适合样品量较少得悄况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆得变性。
柱上复性：就是最近研究较多并成功得在生产中应用得一种复性方法，常用
于复性得层析方法有SEC、HIC等。
复性得具体方法还要根据前期试验及筛选来确定!
包涵体得复性还要注意以下几点：
首先要获得较高纯度得包涵体.
2、包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要
有助溶描施。
3、复性前后均要离心
4、复性不能太快、
5、纯化得最佳条件要摸索与结合相关文献。
6、变性蛋白得浓度
浓度不要太高，一般0、4・0、5mg/ml左右较适宜,若浓度高了，可稀释至适宜浓度。
有些蛋
白可能更低，此时需要结合文献与实践，确定最佳浓度。
要结合透析询后得浓度,如果透析液
加入甘油，这需要结合浓缩比（W%甘油可浓缩2 0%左右）.
复性Buffer得选择
包涵体复性液配方
对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2 M 左右时结束。
对于盐酸肌而言,可以从4M开始，到i、5M时复性过程已经结束。
Tris 系统与PBS系统都没有明确得规定，这些需要您在实验过程中不断试验，确定
合适得缓冲系统；复性过程主要就是注意以下儿个问题:
<1）最适pH值范用为8、0-9. 0之间；（有时需要过酸或过碱性）
（2）温度适宜选择4°C；
（3）复性过程蛋白浓度不宜过大：（小于0、5 mg/ml为宜）
（4）复性时间一般为2 4 —36小时;
（5）低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物得溶解度：JK、盐酸M 等，在非变性浓度下就是很有效得促进剂，都可阻止蛋0聚集;hi S对蛋白质复性有促进作用。
（6）氧化还原体系如GSH/GSSG、DTT/GSSG等•常用得氧化方法有：空气氧化法:在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好得效果，缺点就是不易控制氧化还原电势•
氧化还原电对（redox）:常采用G S SG/GSll（l： 5 - I : 10）,通过调整两者
得比例来控制较精确得氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如DTG如:5rnM
GSSG/2mMDTT = G SH/GSSG（1> 3 3/1）。
（7）复性过程得添加剂：
1、共溶剂：如PEG 6 0 0 0 -200 0 0,据说可以可逆得修饰折叠中间体得疏水集团，此外山于阻止了蛋白质分子间得相互接触得机会，也可能对复性效率得提高起作用。
一般得使用浓度在0、1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、0、4—0、6 M L—Arg：促进蛋G溶解，（成功得应用于很多蛋白如t -PA得复性中，也可以抑制二聚体得形成。
）
3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%—30%.
4、一定得盐浓度，可能就是为了降低某些带电集团间得斥力，有利于蛋白
质得折叠.
5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须得辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配
体等（如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确得折叠就是有利得。
6、特殊离子:如CaCb，Mg Cl2等特殊得金属离子，可参与蛋白质得正确
折叠，促进活性得作用。
（此时勿加入EDTA.）
例如复性Buffer：
SOmMTris—HCI (p H8、0), 10m M CaCl/O、4 M L—Arg, 2 mM GSH / 0、4mM GSSGJO%甘油。
透析buffer： 5 0 mM Tris-HC 1 ( p H &0)jOmM CaCb，2mM DTT, 1 0 %甘油.
复性中蛋白析出!
出现蛋白析出，肯定就是条件变化太剧烈。
复性应该采取复性液浓度与pH值逐渐变化得方法，例如根据包涵体得溶液成分，每隔1个pH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。
此外透析时必须浓度极低，条件温与，使蛋口质能够正确折叠。
{I）蛋口析出最大得可能性：蛋口浓度太高，建议稀释以后再复性；
（2 ）透析得盐浓度（比如urea）要平缓降低:8M—6M—2M —PBS；
（3）若加变性剂（尿素可加到2M,盐酸脈可加到1-1、5M）;
（4）另外可将甘油浓度增加（范H可在W30%）,且在复性样品中也可加适量甘油；
（5）如果还不行，可以换新得复性缓冲液；
（6）纯度不够!出现纯化得U标蛋0纯度不够时，可以先过分子筛再复性；带有二硫键蛋白得复性！
如果蛋口中存在两个以上得半胱氨酸,立即形成正确得二硫键就是不可能得。
随着二硫键得数U增加（分子间与分子内得），可能得组合数U也在剧烈上升（3个二硫键就就是15种可能组合，4个对应1 05,5个对应9 45等等）。
如果二硫键就是正确折叠所必须得话，应该在溶解时加入一种还原性试剂
（如1 OmM DTT）O这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。
加入二硫化物置换试剂（如氧化型+还
原型谷胱甘肽）就是为了提供氧化还原作用力。
这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。
这些二硫键得形成或断裂反应就是可逆得，直到最有利得蛋白二
硫键形成,这种平衡才会被破坏•这个过程被称作氧化型折叠.。