液体发酵松茸胞外多糖测定方法的研究

液体发酵松茸胞外多糖测定方法的研究摘要:测定液态发酵松茸胞外多糖含量时,由于受到培养基中夹带的糖类物质(如淀粉、蔗糖)等物质的干扰,其有效松茸胞外多糖的含量测定可能会受到较大影响。

分别以苯酚-硫酸法和改进的ROBERTS铜方法进行羊肚菌胞外多糖测定。

实验表明,用ROBERTS铜法所测多糖含量仅占苯酚硫酸法所测多糖含量的17.3%,证明用ROBERTS铜法测定羊肚菌胞外多糖更准确一些。

关键词:羊肚菌;多糖;分光光度法Abstract: During the measurement of polysaccharide of T. matsutake derived from liquid fermentation, the content of the extracellular polysaccharide of T. matsutake may be interfered by the carbohydrate (such as starch, sucrose) brought from culture medium. In this article, the extracellular polysaccharide is mensurated by two methods: the method of phenol-vitriol and the improved ROBERTS method. It shows that the resulting polysaccharide content by the later method is about 17.3% of that by the former method. It proves that ROBERTS Determination on extracellular Polysaccharide of toadstool is more accurate.Key words: T. matsutake; polysaccharide; spectrophotometer传统的多糖测定方法是苯酚-硫酸法[3-4]。

但在液体发酵中,往往由于在培养基中添加了淀粉、蔗糖等糖类物质作为碳源,其胞外多糖的含量测定可能受到较大影响。

现多采用苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法,用葡萄糖作为标准溶液测定多糖的含量,这两种方法都是糖的特异性反应,不能排除淀粉等的干扰,而且普遍报道真菌类胞外多糖的含量都较高,这可能与培养基中夹带的糖类成分有关。

有实验证明,用改进的ROBERTS铜方法测多糖,可排除蔗糖、乳糖等双糖、棉籽糖等低聚糖,淀粉、糊精等多糖及甜味剂糖精的干扰[5]。

本文以羊肚菌发酵液为原料,分别以葡萄糖和葡聚糖为标准品测定松茸胞外多糖的含量,来检验两种方法的差别。

松茸[Tricholoma matsutake[S. Ito et Imai] Sing]属担子菌门(Basidiomycota),担子菌纲(Basidiomyce-tes),伞菌目(Agaricales),口蘑科(Tricholomataceae),口蘑属(Tricholoma),其菌肉肥厚,具有香气,味道鲜美,是名贵的野生食药用菌[1]。

现代医学临床实验表明,松茸具有治疗糖尿病和抑制癌细胞增殖作用的特殊功能。

日本的千原吴郎(1969)的实验表明,其子实体的热水提取物(松茸多糖类物质)对小鼠肉瘤S-180的抑制率高达91.8%,对艾氏腹水癌的抑制率为70%[2]。

蒋谷人等研究报道,松茸多糖可使小鼠脾脏增重为正常鼠的5倍(香菇多糖为4.6倍),同时使脾组织中cAMP含量增高。

高菊珍(1997)等的研究表明,松茸提取物(主要含多糖成分),对非特异性免疫和特异性免疫都有增强作用,同时还具有抗应激作用[3]。

因此,松茸有效成分的测定方法,对人体抗癌药物的开发和医药保健的研究方面有一定的应用价值。

1 供试材料1.1 菌种：本研究室保藏1.2 斜面种子培养基：浜田培养基。

液体发酵培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.1%、酵母浸粉0.1%、KH2P04 0.05%、MgS04 7H20 0.05%、FeS04 7H20 0.001%。

1.3 试剂乙醇溶液(80%)：20m L水中加入无水乙醇80m L混匀。

氢氧化钠溶液(10%)：称取l00 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 L。

加入固体无水硫酸钠至饱和,备用。

铜储备液:称取3.0 g CuS04·5H2O，30.0g柠檬酸钠,加水溶解并稀释至1L ，混匀,备用。

铜试剂溶液：取铜储备液50 mL，加水50 mL，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g 并使其溶解，临用新配。

洗涤剂：取水50 mL，加入l0 mL铜试剂溶液10 mL氢氧化钠溶液，混匀。

硫酸溶液(10%)：取100 mL浓硫酸加入到800mL水，混匀，冷却后稀释至1L 。

苯酚溶液(5%)：称取精制苯酚50.g ,加水溶解并稀释至100 mL，混匀。

溶液置冰箱中可保存一个月。

葡萄糖/葡聚糖标准储备液:精密称取干燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖(MW500000) 标准品1.000g 。

加水溶解,并定容至100 mL，混匀，置冰箱中保存。

此溶液1mL含10. 0mg葡萄糖/葡聚糖。

葡萄糖葡/聚糖标准使用液:吸取葡萄糖/葡聚糖标准储备液2.00 mL。

置于100 mL容量瓶中,加水至刻度，混匀，置冰箱中保存，此溶液每1mL含葡萄糖/葡聚糖02.mg。

2 试验方法2.1 松茸培养培养基常规灭菌后，在温度22℃、接种量10%、装液量100mL/250mL三角瓶，在150r/min条件下，摇床培养15d。

2.2 葡萄糖标准曲线制备精密吸取葡萄糖标准使用溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1. 0mL,分别置于25 mL 比色管中,准确补充水至2.0mL,加入苯酚溶液2.0mL,在旋转混匀器上混匀,小心加入浓硫酸10mL,在旋转混匀器上混匀,置沸水浴中煮沸15 min,冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比,1cm比色皿测定吸光度值。

以葡萄糖质量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

2.3 葡聚糖标准曲线制备精密吸取葡聚糖标准使用溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别置于25 mL 比色管中，准确补充水至2.0mL，加入苯酚溶液2.0 mL,在旋转混匀器上混匀,小心加入浓硫酸10mL,在旋转混匀器上混匀,置沸水浴中煮沸15 min,冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比,1cm比色皿测定吸光度值。

以葡聚糖质量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

2.4沉淀粗多糖准确吸取松茸发酵液10.0mL,置于50mL离心管中,加入无水乙醇30mL,混匀5min后以4000r/min离心15min,弃去上清液。

残渣用80%(体积分数) 乙醇溶液数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复操作3次。

残渣用水定容至10m L,混匀,制成粗多糖溶液。

2.5苯酚硫酸法测定多糖准确吸取粗多糖溶液2.0mL置于50mL离心管中,加入6.0mL乙醇溶液,混匀5 min 后以4000r/min 离心15min,弃去上清液。

残渣用水溶解转移至50 mL 容量瓶中定容至刻度,混匀。

吸取2.0mL 加入25mL 比色管中,加入5%的苯酚溶液2.0mL,在混匀器上混匀,小心加入浓硫酸10.0mL 于旋转混匀器上小心混匀,置沸水浴中煮沸15min,冷却后,用分光光度计在490nm 波长处,以试剂空白为参比,1cm 比色皿测定吸光度值。

从标准曲线上查出葡萄糖含量,计算样品中粗多糖含量。

2.6 ROBERTS 铜法沉淀葡聚糖法测定多糖准确吸取粗多糖溶液2.0mL 置于50mL 离心管中,加入100g/L 氢氧化钠2.0mL,铜试剂溶液2.0mL,沸水浴中煮沸3min,冷却后,以4500 r/min 离心15min,弃去上清液,残渣用洗涤液5mL 洗涤,离心后弃去上清液,反复操作3次,残渣用10%的硫酸溶液2.0mL 溶解并转移置50mL 容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀。

吸取2.0mL 加入25mL 比色管中,加入5%的苯酚溶液2.0mL,在混匀器上混匀,小心加入浓硫酸10.0mL 于旋转混匀器上小心混匀,置沸水浴中煮沸15min,冷却后,用分光光度计于485nm 处以试剂空白为参比,1cm 比色皿测定吸光度值。

从标准曲线上查出葡聚糖含量,计算样品中粗多糖含量。

同时做样品空白实验。

2.7 计算公式()224135ML M V V x V V V -⨯⨯=⨯⨯式中:X 为样品中粗多糖含量(以葡聚糖/葡萄糖计),mg/g;ML 为样品测定液中葡聚糖/葡萄糖质量,mg;M2为样品空白液中葡聚糖/葡萄糖质量,mg;V1为沉淀粗多糖所用样品提取液体积,mL;V2为粗多糖溶液体积,mL;V3为沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积,mL;V4为样品测定液总体积,mL;V5为测定用样品测定溶液体积,mL。

3结果与讨论3.1葡萄糖标准曲线3.2葡聚糖标准曲线3.3两种方法测定结果(表1)3.4稳定性实验样品显色后,每隔15min测定一次吸光度,共测6次,结果见表2。

RSD值分别为0.21%和0.89%,结果表明显色结果稳定。

表1 苯酚硫酸法和ROBERTS铜法测定多糖含量表2 吸光度稳定性试验3.5回收率实验取已知浓度的松茸发酵液,加入葡聚糖标准使用溶液1.0 mL,测定其吸收度并计算含量和回收率。

加样回收率=(样品中总的葡聚糖的量—样品中葡聚糖的量)/加入葡聚糖标准使用溶液的量。

平均回收率为98.7%。

4 小结由表1结果可知,苯酚硫酸法所测多糖含量比ROBERTS铜法所测多糖含量高,ROBERTS铜法所测多糖含量仅占苯酚硫酸法所测多糖含量的17.3%,说明培养基中添加的供菌体生长的淀粉类碳源物质对多糖含量测定有影响。

这与文献中普遍报道真菌类胞外多糖含量高可能有关系,如灵芝胞外多糖可达3.5g/L。

根据国内外大量研究资料表明:香菇、金针菇、云芝、冬草、夏草、灵芝、茯苓、猪苓中所含的具有增强免疫、抑制肿瘤、镇静、强心、消炎等生理活性的水溶性多糖均由β(1-3)或β(1-6)糖苷键连接葡聚糖构成主链和支链,有的甚至就是β-葡聚糖[6],因而本文利用改进的ROBERTS铜方法作为多糖的测定方法之一与苯酚硫酸法进行比较。

其原理为食品中相对分子量>10000的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀,与水溶液中的单糖和低聚糖分离,用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖,用苯酚-硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量,其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比,以此计算食品中粗多糖的含量。