高中生物 专题5 第18课时血红蛋白的提取和分离同步课时作业 新人教版选修1

第18课时血红蛋白的提取和分离目标导航 1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

2.理解缓冲液的组成和作用机理。

3.体验提取生物大分子的基本过程和方法。

一、分离蛋白质的基本方法原理1．蛋白质的分离方法——凝胶色谱法凝胶色谱法也称做________________，是根据________________的大小分离________(1)作用在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界________和________对溶液________的影响，维持pH基本不变。

纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。

然而，1滴浓盐酸加入到 1 L CH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(从1.00×10－7 mol/L增到1.01×10－7 mol/L)，pH没有明显变化。

(2)组成缓冲溶液通常由________种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的____________就可以制得________________________的缓冲液，其类型主要有3种：①弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。

②多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。

③弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。

3．电泳(1)概念电泳是指____________在________的作用下发生________的过程。

许多重要的生物大分子，如________、________等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上________或________。

在电场的作用下，这些带电分子会向着________________的电极移动。

(2)原理在同一电场下，由于各种分子________性质的差异及分子本身________、________的不同，使带电分子产生________________，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用方法①____________电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状不同而不同，从而得以分离。

②________________电泳加入SD S作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

二、粗提取血红蛋白1．红细胞的洗涤(1)目的：____________，以利于后续步骤的分离纯化。

(2)过程①采集血样：为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠②低速短时：500 r/min，离心2 min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉淀，达不到分离效果③吸去④生理盐水：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅拌10 min⑤低速短时离心⑥重复③④步骤三次：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤(3)操作提示：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要，洗涤次数少，无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。

2．血红蛋白的____(1)方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加______到原血液的体积，再加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。

(2)目的：使红细胞吸水____，血红蛋白释放出来。

(3)原理：渗透作用。

3．分离血红蛋白溶液(1)方法①将搅拌好的混合液转移到__________中，以2 000 r/min的速度____10 min。

②将离心管中的液体部分用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。

③将滤液置于分液漏斗中，静止片刻后，分出下层的红色透明液体，即为血红蛋白溶液。

(2)目的：使________与大部分杂质分离开，便于后续纯化。

(3)离心后试管中的溶液分为4层，最上面的一层是甲苯层，第二层是脂溶性物质沉淀层，第三层是血红蛋白水溶液层，最下层是杂质沉淀层。

4．粗分离——透析(1)原理：______能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

(3)目的①除去样品中相对分子质量较小的杂质。

②用于更换样品的缓冲液。

三、纯化蛋白质1．凝胶色谱柱的制作(1)取长40 cm，内径为1.6 cm的________，两端需用砂纸磨平。

(2)柱底部制作：打孔→挖出________→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将________上部包好。

(3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。

(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。

2．凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量↓(2)凝胶________：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液↓(3)________：将色谱柱垂直固定在支架上↓(4)________：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内↓(5)________：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密3．样品的加入和洗脱(1)调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面________(2)________透析样品：关闭下端出口，用吸管小心将1 mL样品加到色谱柱顶端(3)样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内(4)再调整________：关闭出口，小心加入20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度(5)________：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱(6)收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集四、实验操作提示1．红细胞的洗涤：________________________________。

2．凝胶的预处理：_________________________________________________________。

3．色谱柱的装填：___________________________________________________________。

4．色谱柱成功的标志：________________________。

五、蛋白质纯度鉴定及实验结果分析与评价1．纯度鉴定——________________________________判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。

鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

血液样品的处理加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平血红蛋白的分离血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功知识点一分离蛋白质的基本方法原理1．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是()①相对分子质量最大的②相对分子质量最小的③相对分子质量适中的A．①②③B．③②①C．①③②D．②①③2．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须()A．具有相同的相对分子质量B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D．具有不同的相对分子质量知识点二分离蛋白质的实验操作3．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是()A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液4．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是()A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质一、选择题1．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷________方向的电极移动()A．相同B．相反C．相对D．相向2．在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是()A．维持溶液浓度不变B．维持溶液酸碱度不变C．催化蛋白质分离过程顺利完成D．无实际意义3．下列有关提取和分离血红蛋白的叙述，错误的是()A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D．可通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度4．凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C．将酶或细胞固定在凝胶中D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度5．下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因()A．分子带电性质的差异 B．分子的大小C．分子的形状D．分子的变性温度6．下列关于样品的加入和洗脱的叙述，正确的是()A．先加入1 mL透析后的样品B．加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水7．凝胶柱制作的顺序一般是()①橡皮打孔②挖凹穴③装玻璃管④盖尼龙网⑤盖尼龙纱⑥将橡皮塞插入玻璃管⑦接尼龙管、装螺旋夹⑧柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞A．①③④⑤⑥⑧⑦②B．①②③④⑤⑥⑦⑧C．①②③④⑥⑤⑧⑦D．①②③⑦⑥⑤⑧④8．凝胶色谱柱制作成功的标志是()A．凝胶装填紧密、均匀B．凝胶色谱柱中有气泡C．洗脱中，红色区带均匀一致移动D．洗脱中，红色区带偏向左边移动二、简答题9．凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。