检测H5N1型高致病性禽流感病毒抗体的间接ELISA方法的初步建立

合集下载

高致病性禽流感(H5N1)病毒感染模型的制作步骤及方法

高致病性禽流感（H5N1）病毒感染模型的制作步骤及方法禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒(avian influenza viruses, AIV)引起的一种禽类的急性、高度接触性、烈性传染病，可引起禽类的感染或疾病综合征。

该病毒属正黏病毒科、流感病毒属，其含有神经氨酸酶和血凝素，可凝集某些动物的红细胞，对消化道、呼吸道系统具有致病性。

鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，而家养的鸡和火鸡引起的危害为严重，国外报道，已发现带毒鸟类达88种。

根据其对易感鸡致病性强弱，可将禽流感病毒分为高致病性AIV(如H5N1等)和低致病性AIV(如H9N2等)。

火鸡、鸡、鸭和鹅自然状态下容易感染禽流感病毒，是常用的实验动物。

其他可用作AIV人工接种的实验动物有：雪貂、猫、仓鼠、小鼠、猴、水貂及猪。

1 啮齿类动物模型(1)复制方法4～6周龄SPF级ICR小鼠或NIH小鼠。

首先将病毒无菌接种于10日龄鸡胚的尿囊腔，病毒毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)，待活化增殖后，病毒的血凝滴度可达到1：256。

将小鼠麻醉后，经其鼻腔接种AIV，接种量为0.1ml/只，然后通过模型动物体温、体重、临床症状、病理变化、病毒分离和抗体测定进行比较分析。

接种后ICR及NIH小鼠的肺脏肉眼可见，充血和水肿，肺体积变大，肺组织表面局部有轻度实变，呈现斑点状充血；镜下病理组织学观察可见，肺间质充血，血管周围有炎症细胞浸润；细支气管内充血，部分管壁黏膜上皮细胞坏死、脱落。

(2)模型特点机体呼吸道是AIV病毒的主要感染途径，敏感动物可出现支气管和肺组织内明显病理变化；部分动物尚可出现体液免疫反应，有接近1/2的感染小鼠可检测到AIV抗体，且出现抗体的时间为接种后第6日。

部分动物体内有病毒复制，大部分ICR和NIH模型小鼠分离到AIV，ICR和NIH小鼠对AIV敏感，较适宜作为AIV小动物模型。

H5亚型高致病性禽流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立

H5亚型高致病性禽流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立曲站红;邓国华;王桂芹;张立春;田国彬;于康震;陈化兰【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2008(030)001【摘要】本研究在已有H5亚型禽流感病毒特异性单抗基础上,建立了以多抗作为包被抗体、单抗作为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法.通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:羊血清1:1 600倍稀释;单抗1:10 000稀释;酶标抗体最适工作浓度为1:5 000倍稀释;单抗反应时间1.5 h;酶标抗体作用时间1.5 h.特异性试验和敏感性试验结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感病毒的检测.【总页数】5页(P68-71,80)【作者】曲站红;邓国华;王桂芹;张立春;田国彬;于康震;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;东北农业大学,动物医学院,黑龙江,哈尔滨,150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国兽医药品监察所,北京,100081;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5;S854.43【相关文献】1.利用类病毒脂质体抗原检测 H5N1亚型禽流感病毒抗体 ELISA 方法的建立 [J], 杨倩;朱道中;薛春宜;李晓明;曹永长;段燕喻;王莹;吴晓薇;刘志玲2.中国H5N1亚型高致病性禽流感病毒抗原变异株的鉴定分析 [J], 李雁冰;陈化兰;施建忠;赵海丹;田国彬;王冬;宋家升;杨德全;邓国华;王秀荣3.H5亚型高致病性禽流感病毒抗原性变异分析 [J], 蒋文明;李金平;侯广宇;彭程;刘朔;王素春;陈继明4.H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立 [J], 陈艳;乔传玲;杨焕良;孔维;辛晓光;陈化兰5.H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立 [J], 宋建领;张富强;胡媛媛;王金萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

新型分子诊断技术在动物疫病检测中的应用与发展

新型分子诊断技术在动物疫病检测中的应用与发展庄向婷;白军;张振仓【摘要】快速有效的病原体检测对于动物疫病的防控和治疗有着非常重要的作用.近年来基于PCR扩增技术的新型分子诊断技术与传统的分子诊断技术相比,对病原体的检测更加快速、特异、敏感、准确,逐步向着分子检测的自动化、高通量和现地使用方向发展.日渐成熟的新型分子诊断技术对于动物疫病检测与鉴别以及出入境检验检疫等领域有着广阔的应用前景,同时可进行大范围的流行病学调查和分析,为动物疫病的科学防控奠定基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2018(039)006【总页数】5页(P108-112)【关键词】新型分子诊断技术;PCR扩增技术;病原体;检测;防控【作者】庄向婷;白军;张振仓【作者单位】杨凌职业技术学院,陕西杨凌 712100;杨凌职业技术学院,陕西杨凌712100;杨凌职业技术学院,陕西杨凌 712100【正文语种】中文【中图分类】S851.4;S855;Q78随着生命医学和科学技术的快速发展，基于分子生物学技术对病原体进行测定的分子诊断技术，大大提高了动物病原体的检测水平，从分子水平探讨疾病发生和发展的机制，为动物疫病的预防、诊断和治疗提供信息和决策的依据。

分子诊断技术发展至今，主要分为传统分子诊断技术（核酸杂交技术、聚合酶链反应技术和限制性酶切技术等）和新型分子诊断技术（实时荧光PCR技术、基因芯片技术和核酸扩增技术等）。

近些年来，一些新型分子诊断技术逐步实现了分子检测的自动化和高通量，并应用于动物疫病诊断，有效提高了疫病确诊速度与准确性，为及时控制疫情提供了决策依据。

该文就目前所应用的几类新型分子诊断技术在动物疫病检测中的原理及实践应用进行简单介绍和评论，并对其发展趋势与前景作出展望。

1 新型分子诊断技术在病原检测中的分类及应用病原体的检测是动物疫病确诊的基石，对采取防控措施、提高疗效、改善预后、降低费用有着极其重要的作用。

禽流感病毒H5N1的重组酶介导检测方法学研究

CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY禽流感病毒H5N4的重组酶介导检测方法学研究陈淑丹I廖静I王玲I罗鹏I郭利川2郑伟广吴忠华I应清界2摘要采用逆转录-重组酶介导核酸扩增技术(Reverse Transcription Recombinase-aided amplification,RT-RAA)建立检测禽流感病毒H5N1的快速方法，根据禽流感病毒H5N1保守序列设计引物及探针，将H5N1RNA逆转录为cDNA,然后以cDNA作模板.扩增检测病毒核酸序列本研究构建了带有H5N1核酸序列的质粒，以此为模板检测不同浓度的质粒.分析该方法的灵敏度，对已知样本进行检测来验证方法的特异性.设计的H5N1特异性引物和探针，能在3『C恒温下，10-30min可有效扩增岀相应病毒的核酸.与其他流感病毒无交叉反应；对质粒的检测灵敏度可达10拷贝建立的RT-RAA检测禽流感病毒H5N1方法灵敏度和特异性均较髙.且该方法操作简单，适用于禽流感病毒H5N1的快速检测关键词禽流感病毒H5N1；逆转录-重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)；分子检测Rapid Detection of H5N1Avian Influenza Virus Based onRAA Fluoresce n ee AssayCHEN Shu-Dan1LIAO Jing1WANG Ling1LUO Peng1GUO Li-Chuan*12ZHENG Wei1,WU Zhong-Hua1YING Qing-Jie2Abstract A quick assay of detecting H5N1avian influenza virus was established through reverse transcription recombinase-aided amplification assay(RT-RAA).H5N1avian influenza virus RNA was transcribed into the cDNA by a reverse-transcription reaction,which served as template for RAA amplification.We design universal primer and probe according to the conserved nucleic acid sequence of H5N1virus.Then constructed plasmid and clinical samples were used to evaluate the specificity and sensitivity of the method.The results showed that nucleic acids of H5N1could be well amplified with specific primer and probe,while nucleic acids of other viruses had negative amplification results.The whole reaction was completed within30minutes under constant temperature of 39°C.The study indicates that the RT-RAA method is very sensitive and able to detect10copies.The established RT-RAA assay had high sensitivity and specificity,ready-to-hand for rapid detection of H5N1avian influenza virus.Keywords H5N1avian influenza virus；reverse transcription recombinase-aided amplification(RT-RAA)；molecular detectio n基金项目:海关总署科研项目(2019HK139)通讯作者：郑伟(1979-),男，汉族，杭州人，博士，主任医师.主要从事口岸病原体检测工作，E-mail：*************** 1•杭州国际旅行卫生保健中心(杭州海关口岸门诊部)杭州3100122.江苏奇天基因生物科技有限公司无锡2141351.Hangzhou Intemationai Travel Healthcare Center(Hangzhou Customs Port Outpatient Departments),Hangzhou3100122.Jiangsu Qitian Gene Bio-Sci&Tech Co.Ltd,Wuxi2141354中国口岸科学技术禽流感病毒可通过空气传播，引起急性呼吸道感染高致病性禽流感H5N1曾在亚洲、欧洲和非洲引起大量家禽的流感暴发野生鸟类包括海鸟、海鸥和家鸭被认为是病毒的天然宿主。

用于检测高致病性H7N9禽流感病毒的荧光RT-PCR引物、探针及方法[发明专利]

专利名称：用于检测高致病性H7N9禽流感病毒的荧光RT-PCR引物、探针及方法
专利类型：发明专利
发明人：陈轩,黄海超,杨素,沙才华,赵福振,邵建宏
申请号：CN201910823823.7
申请日：20190902
公开号：CN110564892A
公开日：
20191213
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明中公开了一种用于检测高致病性H7N9禽流感病毒(HP‑H7N9)的荧光RT‑PCR引物、探针及方法。

本发明建立的HP‑H7N9荧光RT‑PCR检测方法，可特异性的检测HP‑H7N9，而与低致病性H7N9流感病毒(LP‑H7N9)、H7N3流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒(Re‑6疫苗株)、H5亚型禽流感病毒(Re‑8疫苗株)、H9亚型禽流感病毒、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)等不发生交叉反应；可检测到最低浓度为7.09copies/μL的阳性质粒；重复性试验的变异系数(CV)值在1.97％～4.89％之间，表明该方法具有很好的重复性。

本发明建立的HP‑H7N9荧光RT‑PCR方法具有特异、敏感、快速、重复性好的特点，是HP‑H7N9快速检测的良好方法。

申请人：拱北海关技术中心
地址：519000 广东省珠海市银桦路501号
国籍：CN
代理机构：广州嘉权专利商标事务所有限公司
代理人：郑莹
更多信息请下载全文后查看。

211240639_检测鸡毒支原体抗体的间接ELISA_方法和HI试验方法的建立及初步应用

畜牧兽医学报 2023,54(5):2062-2072A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.05.027开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):检测鸡毒支原体抗体的间接E L I S A 方法和H I 试验方法的建立及初步应用陈杨1,孟林春1,郭梦娇1,张成成1,薄宗义2,楚电峰3,曹永忠2,吴艳涛1,2,张小荣1*(1.扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病预防控制协同创新中心,扬州225009;2.扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室,扬州225009;3.青岛易邦生物工程有限公司动物基因工程疫苗国家重点实验室,青岛266114)摘要:本研究旨在建立一种检测鸡毒支原体(M y c o p l a s m a g a l l i s e pt i c u m ,MG )抗体的间接E L I S A 方法,结合H I 试验,为MG 感染的监测和净化提供一套有效的组合技术方案㊂以原核表达的V l h A 3.03重组蛋白(r V l h A )作为包被抗原,使用单一稀释法构建了关于血清抗体滴度与1ʒ500血清稀释度处S /P 值的回归方程l g(抗体滴度)=1.257ˑl g(1ʒ500处S /P 值)+3.709,R 2=0.9176,S /P 临界值为0.32,临界滴度是1200㊂经验证,r V l h A -E L I S A 方法具有良好的特异性㊁重复性,最低能检出1ʒ2000稀释的阳性血清㊂选择国内MG 分离株S H /2020-1作为血凝抑制抗原建立H I 试验方法㊂使用r V l h A -E L I S A 方法联合H I 试验进行血清样品检测,I D E X X -MG 方法作为对照,借助R T -q P C R 方法监测MG 感染情况㊂结果表明r V l h A -E L I S A 方法和I D E X X -MG 监测的血清抗体趋势与H I 复核结果均一致;r V l h A -E L I S A 与H I 联合判定结果与I D E X X -MG 符合率可达91.53%㊂上述结果显示,本研究建立的r V l h A -E L I S A 方法和H I 试验具有较好的临床应用价值,可以初步应用于MG 感染的临床大规模㊁快速筛查并对结果进行复核㊂关键词:鸡毒支原体;V l h A 蛋白;抗体检测;间接E L I S A中图分类号:S 852.62 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)05-2062-11收稿日期:2022-09-13基金项目:财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系资助项目(C A R S -40-K 16);国家重点研发计划科技助力经济2020重点专项(S Q 2020Y F F 0426460);动物基因工程疫苗国家重点实验室开放课题(A G V S K L -Z D -202003);江苏高校优势学科建设工程资助项目(2018年)作者简介:陈杨(1997-),男,江苏南通人,博士生,主要从事动物传染病学研究,E -m a i l :953679181@q q .c o m ;孟林春(1995-),女,山西大同人,硕士生,主要从事动物传染病学研究,E -m a i l :2366714405@q q.c o m ,陈杨和孟林春为同等贡献作者*通信作者:张小荣,主要从事动物传染病学研究,E -m a i l :z x r @y z u .e d u .c nE s t a b l i s h m e n t a n d P r e l i m i n a r y A p pl i c a t i o n o f I n d i r e c t E L I S A M e t h o d a n d H I T e s t f o r D e t e c t i o n o f M y c o p l a s m a G a l l i s e p t i c u m A n t i b o d yC H E N Y a n g 1,M E N G L i n c h u n 1,G U O M e n g j i a o 1,Z H A N G C h e n g c h e n g 1,B O Z o n g yi 2,C HU D i a n f e n g 3,C A O Y o n g z h o n g 2,WU Y a n t a o 1,2,Z H A N G X i a o r o n g1*(1.J i a n g s u C o -i n n o v a t i o n C e n t e r f o r P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l o f I m p o r t a n t A n i m a l I n fe c t i o u s D i s e a s e s a n d Z o o n o s e s ,C o l l e g e of V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Y a ng zh o u U ni v e r s i t y ,Y a n gz h o u 225009,C h i n a ;2.I n t e r n a t i o n a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y o f A g r i c u l t u r e a n d A g r i -P r o d u c t S a f e t y ,I n s t i t u t e s o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y D e v e l o p m e n t ,Y a n g z h o u U n i v e r s i t y ,Y a n g z h o u 225009,C h i n a ;3.S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f G e n e t i c a l l y E n g i n e e r e d V e t e r i n a r y V a c c i n e s ,Q i n g d a o Y e b i oB i o l o gi c a l E n g i n e e r i n g C o .,L t d ,Q i n gd a o 266114,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s s t u d y a i me d a t e s t a b l i s h i n g an i n d i r e c t -E L I S A m e t h o d f o r t h e t i t e r d e t e c t i o n o f Copyright ©博看网. All Rights Reserved.5期陈杨等:检测鸡毒支原体抗体的间接E L I S A方法和H I试验方法的建立及初步应用M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m(MG)a n t i b o d i e s i n c h i c k e n,w h i c h c o u l d p r o v i d e a s e t o f e f f e c t i v e t e c h n o l o g y f o r l a r g e-s c a l e c l i n i c a l m o n i t o r i n g o f MG i n f e c t i o n c o m b i n e d w i t h H I t e s t e s t a b l i s h e d. P r o k a r y o t i c-e x p r e s s e d p r o t e i n V l h A3.03(r V l h A)w a s o b t a i n e d a s e n v e l o p e a n t i g e n.T h e l i n e a r e q u a t i o n l g(a n t i b o d y t i t e r)=1.257ˑl g(S/P v a l u e a t1ʒ500)+3.709o f s e r u m a n t i b o d y t i t e r a n d S/P v a l u e a t1ʒ500w a s e s t a b l i s h e d b y a s i n g l e s e r u m d i l u t i o n t e s t a n d t h e c o r r e l a t i o n c o e f f i-c i e n t(R2)w a s0.9176.T h e c u t o f f v a l u e o f n e g a t i v e a nd p o s i t i ve S/P w a s d e t e r m i n e d t o b e0.32,a n d t h e c o r r e s p o n d i n g t i t e r i s1200.T h e r V l h A-E L I S A s h o w e d g o o d s p e c i f i c i t y a n d r e-p e a t a b i l i t y.T h e d e t e c t i o n l i m i t o f MG p o s i t i v e s e r a i s1ʒ2000.A n H I a s s a y w a s a l s o e s t a b l i s h e d u s i n g d o m e s t i c MG i s o l a t e S H/2020-1a s h e m a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t i o n t e s t a n t i g e n.T h e c o m b i n e d r V l h A-E L I S A m e t h o d a n d H I t e s t,a n d I D E X X-MG w e r e c o m p a r e d i n s e r u m s a m p l e d e t e c t i o n, w i t h R T-q P C R m e t h o d t o m o n i t o r MG i n f e c t i o n.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e t r e n d o f s e r u m a n-t i b o d y m o n i t o r e d b y r V l h A-E L I S A a n d I D E X X-MG w a s c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t o f H I a s s a y. T h e c o i n c i d e n c e r a t e b e t w e e n c o m b i n e d r V l h A-E L I S A a n d H I,a n d I D E X X-MG w a s91.53%. T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e r V l h A-E L I S A a n d H I t e s t e s t a b l i s h e d i n t h i s s t u d y w e r e b e n e f i-c i a l t o c l i n i c a l a p p l i c a t i o n,w h i c h c a n b e a p p l i e d t o l a r g e-s c a l e a n d r a p i d c l i n i c a l s c r e e n i n g o f MG i n f e c t i o n a n d r e c h e c k t h e r e s u l t s.K e y w o r d s:M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m;v a r i a b l e l i p o p r o t e i n h a e m a g g l u t i n i n;a n t i b o d y d e t e c t i o n;i n d i r e c t e n z y m e-l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Z H A N G X i a o r o n g,E-m a i l:z x r@y z u.e d u.c n鸡毒支原体(M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m,MG)主要感染鸡,可引起鸡慢性呼吸道疾病(C R D)[1]㊂MG可垂直传播和水平传播[2],易与传染性支气管炎病毒(I B V)㊁禽流感病毒(A I V)等病原发生混合感染而产生致病协同效应,给养鸡业造成较大经济损失[3-4]㊂因此,加强鸡场MG的日常监测并建立快速㊁有效的检测方法对MG的防控和净化具有重要意义㊂E L I S A方法操作简单,可批量检测,具有敏感性强㊁结果可量化等优点,在MG临床诊断中应用较广泛,一些研究使用完整或超声裂解后MG培养物作为全细胞抗原建立检测MG抗体的间接E L I S A方法或斑点印记E L I S A方法[5-6];任娟等[7]借助针对MG的单抗和多抗建立了夹心E L I S A方法,但只能针对抗原作出检测㊂目前,国内MG抗体检测依赖进口的商品化E L I S A试剂盒,检测成本较高,在全球新冠肺炎疫情的大背景下到货时间不确定,难以大规模推广应用㊂H I试验特异性强㊁诊断准确,常用于复核快速血清凝集试验(r a p i d s e r-u m a g g l u t i n a t i o n,R S A)或E L I S A检测结果[8]㊂为了提高间接E L I S A检测的特异性,国内外学者开始利用MG表面膜蛋白作为包被抗原建立E L I S A方法㊂P v p A蛋白被作为包被抗原建立了检测MG抗体的间接E L I S A方法,特异性良好,但其稳定性有待改善[9];王莉莉[10]建立了基于热休克蛋白家族P60蛋白的间接E L I S A检测方法,但与商品化试剂盒的符合率不高(90%以下)㊂MG的可变脂蛋白血凝素(V l h A)是MG的一种细胞黏附蛋白,与MG的发病机制和免疫应答密切相关[11],M a r d a s s i等[12]将MG V l h A蛋白家族的p MG A1.2蛋白(经比对即为本研究V l h A3.03蛋白)与其他抗原结合建立了区分MG㊁滑液囊支原体(M y c o p l a s m a s y n o v i a e,M S)和火鸡支原体感染的间接E L I S A方法,但敏感性较低;陈玥彤等[13]的试验结果表明,V l h A3.03可以作为MG抗体检测的候选靶标抗原,但未再有基于V l h A3.03蛋白抗体检测方法的报道㊂本研究以基因工程表达的重组V l h A3.03蛋白作为包被抗原,建立了检测MG抗体的r V l h A-E L I S A方法,结合H I试验,为MG感染的临床监测提供一套有效的组合技术方案㊂1材料与方法1.1主要试剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(I P T G)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;G S T融合蛋白纯化试盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司;T M B双组3602Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷分显色液和H R P 标记兔抗鸡I gG 购自美国T h e r -m o F i s h e r S c i e n t i f i c 公司;鸡毒支原体抗体检测试剂盒购自美国I D E X X 公司(以下简称:I D E X X -M G );牛血清白蛋白购自上海双洳生物有限公司;细菌基因组D N A 试剂盒购自康为世纪生物有限公司㊂1.2 生物材料MG 标准强毒株R l o w 株(保藏号:C V C C 1651)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心;MG 临床分离株S H /2020-1为本实验室分离并保存;S P F 鸡购自斯派福瑞禽业有限公司;H 5㊁H 7㊁H 9亚型A I V 阳性血清㊁新城疫病毒(N D V )阳性血清㊁传染性喉气管炎病毒(I L T V )购自青岛易邦生物工程有限公司;M S ㊁副鸡禽杆菌(A v i b a c t e r i u m p a r a ga l l i n a -r u m ,A .p a r a g a l l i n a r u m )㊁I B V ㊁MG ㊁肠炎沙门菌(S a l m o n e l l a E n t e r i t i d i s ,S .E n t e r i t i d i s)㊁大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i ,E .c o l i )㊁A 型多杀性巴氏杆菌(P a s t e u r e l l a m u l t o c i d a ,P .m u l t o c i d a )阳性血清和S P F 鸡阴性血清为本实验室制备并保存㊂120份MG 抗体阳性的临床血清样品为从养殖场采集,经I D E X X -MG 方法检测确定抗体滴度㊂1.3 r V l h A 重组蛋白的表达与鉴定1.3.1 目的基因扩增根据MG 强毒株R l o w 的v l h A 3.03基因序列(G e n B a n k :A E 015450.2),T G A 在支原体中编码色氨酸,在大肠杆菌中为终止密码子,故将T G A 突变为T G G (图1),在目的片段两端分别添加酶切位点E c o RⅠ和X h o Ⅰ,使用软件O l i go 7设计特异性引物(表1)㊂提取MG R l o w 株基因组D N A 后对v l h A 3.03进行分段扩增,再以1F /4R 为引物进行O v e r l a p PC R 扩增获得完整v l h A 3.03片段㊂P C R 反应条件:94ħ预变性10m i n ;94ħ变性30s ,52~57ħ退火30s ,72ħ延伸2m i n ,35个循环;最后72ħ延伸10m i n㊂图1 v l h A 3.03分段扩增示意图F i g .1 S e g m e n t a l a m pl i f i c a t i o n o f v l h A 3.031.3.2 重组蛋白诱导表达及条件优化将v l h A 3.03基因P C R 扩增产物通过E c o RⅠ和X h oⅠ双酶切克隆入载体p G E X -6p-1,经P C R 及双酶切鉴定为阳性的克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序㊂将重组质粒转化到E .c o l i B L 21感受态细胞,I P T G 终浓度分别设置为0.3㊁0.5㊁0.7m m o l ㊃L -1,分别在25㊁30㊁37ħ诱导5h ,通过S D S -P A G E 检测重组蛋白V l h A 3.03(r V l h A )表达情况㊂1.3.3 重组蛋白的纯化和鉴定以 1.3.2中摸索的最佳条件,大量诱导表达r V l h A 蛋白,使用G S T 融合蛋白纯化试剂盒进行纯化;以MG 阳性血清为一抗,兔抗鸡I g G 为二抗,进行W e s t e r n b l o t (W B )试验鉴定重组蛋白㊂1.4 检测M G 抗体的间接E L I S A 方法的建立1.4.1 抗原最适包被浓度及血清最适稀释度的确定将r V l h A 蛋白包被液从8m g㊃L -1倍比稀释至0.0625m g㊃L -1;M G 阳性血清进行1ʒ125~1ʒ4000倍比稀释,阴性血清做同样处理㊂通过棋盘滴定法,选取阳性血清O D 450n m 值大于1.0,阴性血清O D 450n m值小于0.2,且P /N值标准阳性血清O D 450n m 值标准阴性血清O D 450n m 值较大的组合,确定为最适抗原包被浓度和血清稀释倍数㊂4602Copyright ©博看网. All Rights Reserved.5期陈杨等:检测鸡毒支原体抗体的间接E L I S A方法和H I试验方法的建立及初步应用表1v l h A3.03的扩增引物T a b l e1P r i m e r s u s e d f o r a m p l i f y i n g v l h A3.03引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e片段大小/b pF r a g m e n tv l h A3.031F G C C G A A T T C G T G A A G A G A A A A A A C A T A T T A A A G T T T G v l h A3.031R G T T C T C T G A G C A T A A T C C C A G T T A G G 863v l h A3.032F C C T A A C T G G G A T T A T G C T C A G A G A A C v l h A3.032R G T G C C A G C T A A A C T A T A A A T C C A A G A C 137v l h A3.033F G T C T T G G A T T T A T A G T T T A G C T G G C A C v l h A3.033R C A G C A A T A T A T G T T G A C C A A T C T G 473v l h A3.034F C A G A T T G G T C A A C A T A T A T T G C T Gv l h A3.034R C G C C T C G A G C T A A G A T G G A T T T G A A A C A T T A G T A G 560下划线处表示酶切位点,加粗部分表示需要突变部位B a s e s w i t h t h e u n d e r l i n e d i n d i c a t e t h e r e s t r i c t i o n s i t e,a n d b a s e s i n b o l d i n d i c a t e s t h e m u t a t i o n s i t e1.4.2间接E L I S A工作条件的优化分别用含1%B S A-P B S T㊁5%B S A-P B S T㊁5%脱脂奶-P B S T 和5%明胶-P B S T作为封闭液,每孔300μL,37ħ分别封闭1㊁2㊁3㊁4h,用于确定合适的封闭液种类和封闭时间;选择0.2%B S A-P B S T㊁0.5%B S A-P B S T㊁P B S T和P B S(0.01m o l㊃L-1㊁p H7.4),每孔100μL,37ħ反应30m i n,用于确定一抗最适稀释液;使用一抗最适稀释液将酶标二抗进行1ʒ5000~ 1ʒ20000倍比稀释,按照每孔100μL加入酶标板中,37ħ反应30m i n,以确定酶标二抗的最佳稀释倍数;底物显色时37ħ避光分别反应5㊁10㊁15m i n 以确定最佳显色时间㊂1.4.3临界值的确定和终点滴度方程的建立与验证借鉴S n y d e r等[14-15]建立的单一血清稀释E L I S A方法,收集MG阴阳性血清样品各25份,将阴性血清混合为阴性血清池,对血清进行1ʒ125~ 1ʒ256000同步倍比稀释,每份血清设置两个重复,以每块酶标板阴性血清不同稀释倍数处O D450n m的平均值与3倍标准差之和(x-+3s)构建P N T基线㊂统计阳性血清样品在不同稀释倍数下的O D450n m平均值,与P N T基线交点的最大稀释倍数定义为该血清样品的抗体终点滴度;计算阳性血清最适稀释度下的S/P值待检血清样品O D450n m值-M G标准阴性血清O D450n m值M G标准阳性血清O D450n m值-M G标准阴性血清O D450n m值,建立关于血清抗体终点滴度与S/P值的回归方程,建立的E L I S A方法命名为r V l h A-E L I S A方法㊂此外,计算阴性血清最适稀释度下的x-+3s值,换算为S/P值,确定阴㊁阳性临界值㊂使用r V l h A-E L I S A方法和经典倍比稀释法分别测定20份阳性血清和20份阴性血清,比较两种方法测得血清抗体滴度,验证回归方程准确性㊂1.4.4特异性试验利用r V l h A-E L I S A方法分别对M S㊁N D V㊁I B V㊁A I V(H5㊁H7㊁H9)㊁I L T V㊁S.E n t e r i t i d i s㊁E.c o l i㊁P.m u l t o c i d a和A.p a r a-g a l l i n a r u m单因子阳性血清进行检测,设MG阳性血清㊁S P F鸡阴性血清作为对照,计算S/P值,分析特异性㊂1.4.5灵敏度试验用r V l h A-E L I S A方法和I D E X X-MG分别检测1ʒ125㊁1ʒ250㊁1ʒ500㊁1ʒ1000㊁1ʒ2000㊁1ʒ4000㊁1ʒ8000㊁1ʒ16000㊁1ʒ32000倍比稀释的参考阳性血清,比较两种方法的检测灵敏度㊂1.4.6重复性试验使用同批次/不同批次酶标板检测5份阳性血清和阴性血清分别进行批内/批间重复性试验,每份血清样品都重复3次㊂读取每份样品O D450n m值并计算S/P值的平均值㊁标准差和变异系数㊂1.4.7保存期试验将酶标板以3种方式处理保存:a)真空包装后4ħ保存;b)真空包装并添加干燥剂4ħ保存;c)用铝箔自封袋真空包装并添加干燥剂4ħ保存㊂每隔一个月,使用相同的阴㊁阳性血清进行平行检测,确定最佳保存条件㊂1.5检测M G抗体的血凝抑制(H I)试验选择M G分离株S H/2020-1,参照文献方法制备H I试验抗原和进行H A㊁H I试验[16-18]㊂使用该方法5602Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷检测收集的90份阳性血清和75份S P F鸡阴性血清,通过M e d C a l c绘制R O C曲线和交互式点状分布图并进行分析,确定H I试验结果的判定标准㊂1.6检测M G抗体的两种血清学方法的临床应用采集两批鸡群不同日龄的血清和腭裂拭子样品,使用建立的r V l h A-E L I S A㊁H I检测方法和I D E X X-MG持续监测鸡群血清抗体,比较不同血清学方法检测MG抗体的一致性;使用实时荧光定量P C R(R T-q P C R)方法[19]检测上述日龄对应的腭裂拭子样品,比较不同检测方法的阳性率㊂2结果2.1r V l h A重组蛋白的表达与纯化2.1.1v l h A3.03目的片段的扩增及重组质粒的酶切鉴定利用4对v l h A3.03特异性引物,成功突变3个位点,经O v e r l a p P C R扩增得到完整v l h A3.03产物(图2A)㊂使用限制性内切酶E c o R Ⅰ和X h oⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定,分别出现载体(4984b p)和v l h A3.03全长(1938b p)相应大小条带(图2B)㊂A.v l h A3.03全长扩增(M.D L2000D N A相对分子质量标准;1.1F/4R扩增产物);B.重组质粒酶切鉴定(M.D L5000 D N A相对分子质量标准;1.重组质粒p G E X-6p-1-v l h A3.03)A.T o t a l l e n g t h o f a m p l i f i c a t i o n f o r v l h A3.03(M.D L2000D N A m a r k e r;1.A m p l i f i c a t i o n p r o d u c t i o n o f1F/4R);B.R e-s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d(M.D L5000D N A m a r k e r;1.R e c o m b i n a n t p l a s m i d p G E X-6p-1-v l h A3.03)图2v l h A3.03全长扩增和重组质粒酶切鉴定F i g.2T o t a l l e n g t h o f a m p l i f i c a t i o n f o r v l h A3.03a n d r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d2.1.2重组蛋白的纯化和鉴定经I P T G诱导,超声裂解后收集上清和沉淀,通过S D S-P A G E鉴定r V l h A蛋白的表达情况㊂r V l h A蛋白大小在96k u 左右,最终确定的最佳诱导表达条件是I P T G终浓度是0.3mm o l㊃L-1,37ħ诱导5h,蛋白以上清形式表达㊂纯化r V l h A蛋白后以MG阳性血清作为一抗,H R P标记的兔抗鸡I g G抗体作为二抗,S D S-P A G E和W e s t e r n b l o t鉴定后特异性条带大小符合预期(图3)㊂2.2检测M G抗体的间接E L I S A方法2.2.1抗原最适包被浓度及血清最适稀释度根据棋盘滴定法结果,抗原最适包被浓度为0.5m g㊃L-1,血清最适稀释倍数为1ʒ500,P/N值为13.18㊂2.2.2间接E L I S A最适工作条件经优化,抗原最适封闭条件为5%脱脂奶-P B S T,37ħ封闭3h;一抗最适稀释液为0.2%B S A-P B S T;酶标二抗最适工作浓度确定为1ʒ10000,底物显色时间为15m i n(37ħ避光反应)㊂2.2.3阴阳性临界值和终点滴度方程将阴性血清池和30份阳性血清倍比稀释,构建P N T基线,确定各阳血清样品的抗体终点滴度,计算阳性血清1ʒ500稀释度下的S/P值,建立关于血清抗体滴度与1ʒ500血清稀释度处S/P值的回归方程l g(抗体滴度)=1.257ˑl g(1ʒ500处S/P值)+3.709 (图4),R2=0.9176㊂同时,求出1ʒ500处的阴性血清S/P值(0.32)作为阴㊁阳性临界值,代入回归6602Copyright©博看网. All Rights Reserved.5期陈杨等:检测鸡毒支原体抗体的间接E L I S A 方法和H I试验方法的建立及初步应用A.重组蛋白纯化效果的S D S -P A G E 鉴定(M.蛋白质相对分子质量标准;1.重组蛋白r V l h A ;2.滤出液;3.洗涤液;4.洗脱液);B .重组蛋白W e s t e r n b l o t 鉴定(M.蛋白蛋白质相对分子质量标准;1.重组蛋白r V l h A )A.I d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n p u r i f i c a t i o n e f f e c t b y S D S -P A G E (M.P r o t e i n m a r k e r ;1.R e c o m b i n a n t pr o t e i n r V l -h A ;2.F i l t r a t e ;3.W a s h i n g ;4.E l u e n t );B .W e s t e r n b l o t o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n (M.P r o t e i n m a r k e r ;1.R e c o m b i n a n t pr o t e i n r V l h A )图3 纯化蛋白的S D S -P A G E 和W e s t e r n b l o t 鉴定F i g .3 I d e n t i f i c a t i o n o f p u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n e f f e c t b y SD S -P A GE a n d W e s t e r n b l o t 方程算出临界滴度为1200㊂r V l h A -E L I S A 方法和经典倍比稀释法测得的血清抗体滴度基本一致,回归方程较准确(表2)㊂2.2.4 特异性设MG 阳性㊁S P F 阴性血清作为对照,计算待检血清的S /P 值,M S ㊁N D V ㊁I B V ㊁A I V (H 5㊁H 7㊁H 9)㊁I L T V ㊁S .E n t e r i t i d i s ㊁E .c o l i ㊁P .m u l t o c i d a 和A .p a r a ga l l i n a r u m 阳性血清S /P 值均在临界值0.32以下,具有良好的特异性㊂2.2.5 灵敏度 r V l h A -E L I S A 方法最低可检测到1ʒ2000稀释的阳性血清样本,I D E X X -MG 最低可检测到1ʒ1000(图5)㊂图4 S /P 值与抗体滴度的回归分析F i g .4 R e g r e s s i o n a n a l y s i s o f S /P v a l u e a n d a n t i b o d yt i t er 图5 灵敏度试验结果F i g .5 T h e s e n s i t i v i t yt e s t r e s u l t s 2.2.6 重复性使用同一批次/不同批次包被的酶标板分别检测5份阳性血清样品和5份阴性血清样品,批内变异系数为0.4%~7.9%,批间变异系数为1%~9.6%,均小于10%,重复性较好㊂7602Copyright ©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷表2r V l h A-E L I S A验证试验T a b l e2V e r i f i c a t i o n t e s t o f r V l h A-E L I S A血清S e r aN o.类型T y p e S/P值(1ʒ500)S/P v a l u e滴度(方程)T i t e r(e q u a t i o n)滴度(P/Nȡ2.1)T i t e r(P/Nȡ2.1)1阳性P o s i t i v e0.3311275.1831000 2阳性P o s i t i v e0.5872618.1932000 3阳性P o s i t i v e1.0505439.1374000 4阳性P o s i t i v e3.27322715.55116000 5阳性P o s i t i v e0.3961595.4371000 6阳性P o s i t i v e0.8374092.2454000 7阳性P o s i t i v e0.4011622.7701000 8阳性P o s i t i v e2.01912374.1048000 9阳性P o s i t i v e1.5859132.6478000 10阳性P o s i t i v e0.6512985.5042000 11阳性P o s i t i v e0.5112202.6982000 12阳性P o s i t i v e2.50116194.12616000 13阳性P o s i t i v e0.6082739.5302000 14阳性P o s i t i v e0.4281760.8321000 15阳性P o s i t i v e1.2606840.0744000 16阳性P o s i t i v e0.6192800.6172000 17阳性P o s i t i v e0.7323457.9192000 18阳性P o s i t i v e0.4872072.3532000 19阳性P o s i t i v e0.9454764.4504000 20阳性P o s i t i v e3.66126146.89816000 21阴性N e g a t i v e0.057138.227125 22阴性N e g a t i v e0.070180.794125 23阴性N e g a t i v e0.03575.646-24阴性N e g a t i v e0.113330.359250 25阴性N e g a t i v e0.124370.381250 26阴性N e g a t i v e0.083225.530125 27阴性N e g a t i v e0.127380.530250 28阴性N e g a t i v e0.065163.489125 29阴性N e g a t i v e0.086234.712125 30阴性N e g a t i v e0.03575.646-31阴性N e g a t i v e0.100281.703250 32阴性N e g a t i v e0.070180.794125 33阴性N e g a t i v e0.151474.279250 34阴性N e g a t i v e0.046105.983-35阴性N e g a t i v e0.03883.032-36阴性N e g a t i v e0.059146.550125 37阴性N e g a t i v e0.086234.712125 38阴性N e g a t i v e0.078207.394125 39阴性N e g a t i v e0.092253.297250 40阴性N e g a t i v e0.054130.004125 8602Copyright©博看网. All Rights Reserved.5期陈杨等:检测鸡毒支原体抗体的间接E L I S A方法和H I试验方法的建立及初步应用2.2.7保存期选择铝箔自封袋真空包装并添加干燥剂4ħ条件(方式c)保存酶标板,可以稳定保存6个月,其余方式保存有效期均不超过3个月(图6)㊂2.3检测M G抗体的H I试验使用建立的H I试验检测阳性血清样品和阴性血清样品,通过统计学软件M e d C a l c制备R O C曲线并绘制交互式点状分布图,R O C曲线线下面积(A U C)=0.999,结合交互式点状分布图,确定H I 试验结果的判定标准:H I滴度在1ʒ80及以上判定为阳性;1ʒ40~1ʒ80判定为疑似;1ʒ40以下判定为阴性(图7)㊂2.4临床应用r V l h A-E L I S A方法和I D E X X-MG检测的血清抗体滴度趋势一致,符合率为96.61%(图8,表3)㊂a.真空包装,4ħ保存;b.真空包装并添加干燥剂,4ħ保存;c.用铝箔自封袋真空包装并添加干燥剂,4ħ保存a.V a c u u m p a c k a g i n g,s t o r e d a t4ħ;b.V a c u u m p a c k a g e a n d a d d d e s i c c a n t,a n d s t o r e a t4ħ;c.V a c u u m p a c k a g e w i t h a l u m i n u m f o i l s e l f-s e a l i n g b a g a n d a d d d e s i c c a n t,a n d s t o r e a t4ħ图6酶标板保存条件的优化F i g.6O p t i m i z a t i o n o f e n z y m e l a b e l p l a t e s t o r a g e c o n d i t i onA.R O C曲线分析;B.样品点状图分布A.R O C a n a l y s i s;B.D o t p l o t d i s t r i b u t i o n o f s a m p l e图7H I试验R O C曲线分析和样品点状图分布F i g.7R O C a n a l y s i s a n d d o t p l o t d i s t r i b u t i o n o f H I t e s t1日龄时r V l h A-E L I S A方法与I D E X X-MG检测阳性率分别为76.67%和86.67%,H I试验复核阳性率为50%,但R T-q P C R结果为阴性㊂26日龄时,r V l h A-E L I S A方法㊁I D E X X-MG及H I试验结果均为阴性,R T-q P C R阳性率为13.33%㊂48日龄时,r V l h A-E L I S A方法检测结果为阴性,I D E X X-MG检出一份阳性样品,H I试验复核结果为阴性,R T-q P C R阳性率为6.67%㊂62日龄时,r V l h A-E L I S A方法㊁I D E X X-MG阳性率分别为13.79%和17.24%,H I试验复核结果为13.79%,R T-q P C R阳性率升高(53.33%)㊂90日龄时,r V l h A-E L I S A方法㊁I D E X X-MG检测阳性率均在96%以上,H I试验复核结果为89.29%,R T-q P C R阳性率进一步升高(63.33%)㊂97日龄时,3种血清学检测方法阳性率均达100%,R T-q P C R阳性率下降到30%㊂图8r V l h A-E L I S A与I D E X X-M G检测抗体趋势F i g.8A n t i b o d y t r e n d d e t e c t e d b y r V l h A-E L I S A a n d I D E X X-M G9602Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷r V l h A -E L I S A 方法与H I 复核结果符合率为93.79%,联合判定结果与I D E X X -MG 符合率为91.53%(表3)㊂表3 不同检测方法的阳性率T a b l e 3 P o s i t i v e r a t e o f d i f f e r e n t d e t e c t i o n m e t h o d s%日龄A ge 联合判定C o m b i n e d j u d ge m e n t r V l h A -E L I S A H II D E X X -MG R T -q P C R 176.67(23/30)50(15/30)86.67(26/30)0(0/30)260(0/30)0(0/30)0(0/30)13.33(4/30)480(0/30)0(0/30)3.33(1/30)6.67(2/30)6213.79(4/29)13.79(4/29)17.24(5/29)53.33(16/30)90100(28/28)89.29(25/28)96.43(27/28)63.33(19/30)97100(30/30)100(30/30)100(30/30)30(9/30)符合率C o i n c i d e n c e r a t er V l h A -E L I S A 与H I 试验93.79(166/177)联合判定结果与I D E X X91.53(162/177)3 讨论近年来,规模化养殖场防控措施越来越严格,但MG 感染问题依然普遍,且大部分为隐性感染,增加了MG 垂直传播和与其他病原混合感染的风险㊂美国农业部国家家禽改良计划(U S D e pa r t m e n t o f A g r i c u l t u r e N a t i o n a l P o u l t r y l m pr o v e m e n t P l a n ,N P I P )要求鸡场采用E L I S A 对鸡群MG 感染情况进行初筛,随后用H I 试验或分子学方法进行复核[20]㊂与野毒感染产生的高水平血清抗体相比,E L I S A 方法只能检测到低水平的疫苗株抗体[21-22];在对鸡群MG 血清抗体的长期监测中,若出现抗体异常升高,则表明鸡群极大可能出现了MG 感染㊂本研究以原核表达的MG 重组V l h A 3.03蛋白作为包被抗原,建立了检测MG 抗体滴度的r V l h A -E L I S A 方法,与呼吸道常见病原阳性血清不发生反应,具有良好的重复性;在4ħ条件下,可至少保存6个月,这有助于该方法的标准化及大规模应用㊂单一血清稀释法E L I S A 可显著降低试剂成本和操作时间,减少血清连续稀释固有的误差,吸光度对数与抗体滴度对数存在较高的线性关系,已被证明并用于一些动物各种病毒性疾病的快速血清学分析[14-15,23-27]㊂利用本研究建立的回归方程计算待检血清1ʒ500稀释度下的S /P 值即可得到相应的抗体滴度㊂在r V l h A -E L I S A 和H I 试验方法的临床应用中,由于鸡群母源抗体的存在,鸡群1日龄血清学方法检测阳性率均在50%以上,在前3周迅速下降,并维持到48~62日龄,随后逐渐升高,在90~97日龄到达高峰㊂r V l h A -E L I S A 与H I 复核结果符合率达93.79%,联合判定结果与I D E X X -MG 总符合率达91.53%,进一步表明将r V l h A -E L I S A 与H I试验组合作为临床筛查MG 感染方案的可行性㊂根据腭裂拭子R T -q P C R 检测结果可知,该鸡群最晚在26日龄发生MG 感染,3周后血清抗体才开始检出阳性,这与疾病发生发展规律相符,客观上表明与病原检测相比,血清学检测存在一定滞后性;这提示在临床监测中若需要第一时间发现野毒感染,在条件允许的情况下可同时配合R T -q P C R 方法进行检测㊂此外,由监测结果可知,尽管E L I S A 方法与H I 试验得到的抗体消涨规律一致,但E L I S A 方法较H I 试验更灵敏,这也与此前相关研究报道一致[28-29]㊂综上所述,本研究建立的r V l h A -E L I S A 和H I检测方法具有较好的临床应用价值,若未来我国也将MG 纳入家禽改良计划,便可及时提供一套用于MG 野毒感染的临床大规模㊁快速筛查的组合技术方案,对规模化鸡场MG 感染的监测㊁防控具有重要意义㊂4 结论以原核表达的V l h A 3.03重组蛋白(r V l h A )作为包被抗原建立了一种检测MG 抗体的间接E L I S A 方法,构建了关于血清抗体滴度与1ʒ500血清稀释度处S /P 值的回归方程㊂选择国内MG 分离株作为血凝抑制抗原建立H I 试验方法㊂使用702Copyright ©博看网. All Rights Reserved.5期陈杨等:检测鸡毒支原体抗体的间接E L I S A方法和H I试验方法的建立及初步应用r V l h A-E L I S A方法联合H I试验检测临床血清样品,与商品化试剂盒I D E X X-MG符合率为91.53%㊂该研究结果可为MG感染临床大规模㊁快速筛查提供有效的组合技术方案,为MG的监测和净化提供科学工具㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] L E V I S O H N S,K L E V E N S H.A v i a n m y c o p l a s m o s i s(M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m)[J].R e v S c i T e c h,2000,19(2):425-442.[2] A R MO U R N K,F E R G U S O N-N O E L N.E v a l u a t i o no f t h e e g g t r a n s m i s s i o n a n d p a t h o g e n i c i t y o fM y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m i s o l a t e s g e n o t y p e d a s t s-11[J].A v i a n P a t h o l,2015,44(4):296-304. [3]向勇,曹伟胜.禽支原体检测技术进展[J].养禽与禽病防治,2018(4):2-9.X I A N G Y,C A O W S.A d v a n c e s i n d e t e c t i o nt e c h n o l o g y o f a v i a n m y c o p l a s m a[J].P o u l t r y R a i s i n ga n d D i s e a s e C o n t r o l,2018(4):2-9.(i n C h i n e s e)[4] B R A D B U R Y J M.A v i a n m y c o p l a s m a i n f e c t i o n s:p r o t o t y p e o f m i x e d i n f e c t i o n s w i t h m y c o p l a s m a s,b ac t e r i a a nd v i r u se s[J].A n n M i c r o b i o l(P a r i s),1984,135(1):83-89.[5] Y A D A V J P,B A T R A K,S I N G H Y,e t a l.C o m p a r a t i v e e v a l u a t i o n o f i n d i r e c t-E L I S A a n dD O T b l o ta s s a y f o r s e r o d e t e c t i o n o f M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m a n dM y c o p l a s m a s y n o v i a e a n t i b o d i e s i n p o u l t r y[J].JM i c r o b i o l M e t h o d s,2021,189:106317.[6] A N S A R I A A,T A Y L O R R F,C HA N G T S.A p p l i c a t i o n o f e n z y m e-l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a yf o r d e t e c t i ng a n t i b o d y t o M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u mi n f e c t i o n s i n p o u l t r y[J].A v i a n D i s,1983,27(1):21-35.[7]任娟.间接夹心E L I S A检测鸡毒霉形体研究[D].武汉:华中农业大学,2009.R E N J.R e s e a r c h o f i n d i r e c t s a n d w i c h E L I S A f o rm y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m[D].W u h a n:H u a z h o n gA g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2009.(i n C h i n e s e)[8]甘孟侯.中国禽病学[M].北京:中国农业出版社,1999.G A N M H.A v i a n e p i d e m i o l o g y i n C h i n a[M].B e i j i n g:C h i n a A g r i c u l t u r a l P u b l i s h i n g H o u s e,1999.(i n C h i n e s e)[9]周云雷,李健,魏飞龙,等.以重组P v p A蛋白作为抗原的鸡毒支原体抗体间接E L I S A检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2011,33(9):713-717.Z HO U Y L,L I J,W E I F L,e t a l.D e v e l o p m e n t o fa n i n d i r e c t E L I S A f o r d e t e c t i n g a n t ib o d i e s a g a i n s tM y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m b a s e d o n r e c o m b i n a n tP v p A p r o t e i n[J].C h i n e s e J o u r n a l o f P r e v e n t i v eV e t e r i n a r y M e d i c i n e,2011,33(9):713-717.(i nC h i n e s e)[10]王莉莉.鸡毒支原体抗体间接E L I S A检测方法的建立及初步应用[D].北京:中国农业科学院,2018.W A N G L L.E s t a b l i s h m e n t a n d p r e l i m i n a r y a p p l i c a t i o no f i n d i r e c t E L I S A f o r d e t e c t i n g a n t i b o d y t o M y c o p l a s m ag a l l i s e p t i c u m[D].B e i j i n g:C h i n e s e A c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,2018.(i n C h i n e s e)[11] B E N C I N A D.H a e m a g g l u t i n i n s o f p a t h o g e n i c a v i a nm y c o p l a s m a s[J].A v i a n P a t h o l,2002,31(6):535-547.[12] M A R D A S S I B B A,BÉJ A O U I A,O U S S A E I F L,e ta l.A r e c o mb i n a n t a n t i g e n-b a s e d E L I S A f o r t h es i m u l t a n e o u s d i f f e r e n t i a l s e r o d i a g n o s i s o f M y c o p l a s m ag a l l i s e p t i c u m,M y c o p l a s m a s y n o v i a e,a n d M y c o p l a s m am e l e a g r i d i s i n f e c t i o n s[J].A v i a n D i s,2008,52(2):214-221.[13]陈玥彤,祁晶晶,胡增金,等.鸡毒支原体V L HA3.03蛋白的原核表达及免疫原性分析[J].中国动物传染病学报,2022,30(2):134-141.C H E N Y T,Q I J J,HU Z J,e t a l.P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n a n d i mm u n o g e n i c i t y a n a l y s i s of V L HA3.03p r o t e i n i n M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m[J].C h i n e s eJ o u r n a l o f A n i m a l I n f e c t i o u s D i s e a s e s,2022,30(2):134-141.(i n C h i n e s e)[14] S N Y D E R D B,M A R Q U A R D T W W,M A L L I N S O N ET,e t a l.R a p i d s e r o l o g i c a l p r o f i l i n g b y e n z y m e-l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y.I.M e a s u r e m e n t o f a n t i b o d ya c t i v i t y t i t e r a g a i n s t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s i n a s i n g l es e r u m d i l u t i o n[J].A v i a n D i s,1983,27(1):161-170.[15] S N Y D E R D B,M A R Q U A R D T W W,R U S S E K E.R a p i d s e r o l o g i c a l p r o f i l i n g b y e n z y m e-l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y.I I.C o m p a r i s o n o f c o m p u t a t i o n a lm e t h o d s f o r m e a s u r i n g a n t i b o d y t i t e r i n a s i n g l e s e r u md i l u t i o n[J].A v i a n D i s,1983,27(2):474-484.[16] M E H L HO R N H.W o r l d o r g a n i z a t i o n f o r a n i m a lh e a l t h[M]//M E H L HO R N H.E n c y c l o p e d i a o fP a r a s i t o l o g y.B e r l i n:S p r i n g e r,2016:3037. [17]何吉鑫.检测滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的研制和间接E L I S A方法的建立[D].扬州:扬州大学,2020.H E J X.D e v e l o p m e n t o f l y o p h i l i z e d h e m a g g l u t i n a t i o ni n h i b i t i o n t e s t a n t i g e n a n d e s t a b l i s h m e n t o f i n d i r e c t1702Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷E L I S A m e t h o d f o r d e t e c t i n g M y c o p l a s m a s y n o v i a ea n t ib o d i e s[D].Y a n g z h o u:Y a n g z h o u U n i v e r s i t y,2020.(i n C h i n e s e)[18]陶丽寒.滑液支原体血凝抑制试验与荧光定量P C R检测方法的建立与应用[D].合肥:安徽农业大学,2018.T A O L H.D e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o fh e m a g g l u t i n i n i n h i b i t i o n a s s a y a n d S Y B R g r e e nⅠr e a l-t i m e P C R a s s a y f o r d e t e c t i o n o f M y c o p l a s m as y n o v i a e[D].H e f e i:A n h u i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2018.(i n C h i n e s e)[19] S P R Y G I N A V,A N D R E Y C HU K D B,K O L O T I L O V A N,e t a l.D e v e l o p m e n t o f a d u p l e xr e a l-t i m e T a q M a n P C R a s s a y w i t h a n i n t e r n a l c o n t r o lf o r t h e d e t e c t i o n o f M y c o p l a s m ag a l l i s e p t i c u m a n dM y c o p l a s m a s y n o v i a e i n c l i n i c a l s a m p l e s f r o mc o mm e r c i a l a nd b a c k y a r d p o u l t r y[J].A v i a n P a t h o l,2010,39(2):99-109.[20]任妮,邵建忠,何闪.监控种鸡群沙门氏菌㊁支原体和禽流感的流行情况[J].国外畜牧学(猪与禽),2018,38(7):9-13.R E N N,S HA O J Z,H E S.M o n i t o r i n g b r e e d e rf l o c k s f o r s a l m o n e l l a,m y c o p l a s m a a n d a v i a ni n f l u e n z a[J].A n i m a l S c i e n c e A b r o a d(P i g s a n dP o u l t r y),2018,38(7):9-13.(i n C h i n e s e) [21] L E Y D H,M C L A R E N J M,M I L E S A M,e t a l.T r a n s m i s s i b i l i t y o f l i v e M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u mv a c c i n e s t r a i n s t s-11a n d6/85f r o m v a c c i n a t e d l a y e rp u l l e t s t o s e n t i n e l p o u l t r y[J].A v i a n D i s,1997,41(1):187-194.[22] S T E I N L A G E S J T,F E R G U S O N N,S A N D E R J E,e t a l.I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n of a6/85-l i k eM y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m f r o m c o mm e r c i a l l a y i n gh e n s[J].A v i a n D i s,2003,47(2):499-505.[23] P R A D HA N S K,K AM B L E N M,P I L L A I A S,e ta l.R e c o mb i n a n t n uc l e o c a p s id p r o te i n b a s e d s i n g l es e r u m d i l u t i o n E L I S A f o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e st o i n f e c t i o u s b r o n c h i t i s v i r u s i n p o u l t r y[J].J V i r o lM e t h o d s,2014,209:1-6.[24] MOHA N C M,D E Y S,R A I A,e t a l.R e c o m b i n a n th a e m a g g l u t i n i n n e u r a m i n i d a s e a n t i g e n-b a s e d s i n g l es e r u m d i l u t i o n E L I S A f o r r a p i d s e r o l o g i c a l p r o f i l i n go f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s[J].J V i r o l M e t h o d s,2006,138(1-2):117-122.[25] R A M A D A S S P,P A R T H I B A N M,T H I A G A R A J A NV,e t a l.D e v e l o p m e n t o f s i n g l e s e r u m d i l u t i o n E L I S Af o r d e t e c t i o n o f i n f e c t i o u s b u r s a l d i s e a s e v i r u s a n t i b o d i e s[J].V e t e r i n a r s k i A r h i v,2008,78(1):23-30. [26] A R A V I N D S,P A T I L B R,D E Y S,e t a l.R e c o m b i n a n t U L30a n t i g e n-b a s e d s i n g l e s e r u md i l u t i o n E L I S A f o r de t e c t i o n of d u c k v i r a l e n t e r i t i s[J].J V i r o l M e t h o d s,2012,185(2):234-238. [27] D E Y S,MOHA N C M,K UMA R T M A S,e t a l.R e c o m b i n a n t L i p L32a n t i g e n-b a s e d s i n g l e s e r u md i l u t i o n E L I S A f o r de t e c t i o n of c a n i n e l e p t o s p i r o s i s[J].V e t M i c r o b i o l,2004,103(1-2):99-106.[28] A V A K I A N A P,K L E V E N S H,G L I S S O N J R.E v a l u a t i o n o f t h e s p e c i f i c i t y a n d s e n s i t i v i t y o f t w oc o mm e r c i a l e n z y m e-l i n k ed i mm u n o s o r be n t a s s a y k i t s,t h e s e r u m p l a t e a g g l u t i n a t i o n t e s t,a n d t h eh e m a g g l u t i n a t i o n-i n h i b i t i o n t e s t f o r a n t i b o d i e s f o r m e di n r e s p o n s e t o M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m[J].A v i a nD i s,1988,32(2):262-272.[29] S T I P K O V I T S L,C Z I F R A G,S U N D Q U I S T B.I n d i r e c t E L I S A f o r t h e d e t e c t i o n o f a s p e c i f i c a n t i b o d yr e s p o n s e a g a i n s t M y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m[J].A v i a n P a t h o l,1993,22(3):481-494.(编辑白永平)2702Copyright©博看网. All Rights Reserved.。

高致病性禽流感诊断技术

一、标准制定背景高致病性禽流感(HPAI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的。

在2005年至2021年期间，高致病性禽流感已导致全球3.16亿多只家禽死亡和扑杀，最多的年份是在2016，2020，2021年。

另外，在2006，2016，2017和2021年，这几年受到高致病性禽流感疫情影响的国家或地区超过50个。

此外，人偶尔也会感染禽流感病毒。

据WHO统计，人感染H5N1亚型约850例，其中约半数出现死亡；人感染H7N9约1500例，死亡约600例、感染H5N6病例约80例，死亡约30例，感染H9N2约75例，其中2例死亡，还有其他的H3N8，H7N4, H7N7和H10N8亚型感染人的报告。

这些数据表明，高致病性禽流感不仅会给养殖业造成严重的经济损失，还会给人类的生命安全带来威胁，因此要密切监测禽流感的动态以及发生发展趋势。

监测一个病原，离不开有效的诊断技术。

国际上禽流感诊断的依据是世界动物卫生组织出版的WOAH陆生动物法典和WOAH陆生动物诊断试验和疫苗标准手册，通常简称为陆生动物手册。

世界动物卫生组织OIE的缩写，今年5月份更改为WOAH。

陆生动物手册，每过一两年，都会根据病原的变化进行更新。

我国对禽流感诊断的依据有国家标准、行业标准等。

今天要和大家共同学习的《高致病性禽流感诊断技术》国家标准，第一版是在2003年制定的，标准起草单位是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

经过十几年的应用，伴随禽流感病毒不断遗传演化，伴随科技不断发展进步，新的诊断技术、诊断方法逐渐成熟，2003年出版的标准已经出现了滞后现象，对一些常用的，国际公认的检测方法，例如荧光RT-PCR检测方法，没有收录进来，因此，在2017年，我们提出了修订，该工作得到动卫中心全国动物卫生标准化技术委员会大力支持，并且在标准的征求意见阶段，得到大学、省市疫控部门、出入境检疫部门、大型养殖企业的大力帮助。

在此一并表示感谢。

在各位同行的帮助下，2020年末，《高致病性禽流感诊断技术》新版国家标准正式出版。

高致病性禽流感(H5N1亚型)灭活疫苗免疫鸡后其抗体消长规律试验

１４试验设计．
种鸡：３００羽种鸡鸡苗，期检测母源抗体，１０定当母源抗
体降至４ｌｇｏ２以下，２周龄时进行免疫，部皮下注射疫约颈
结果显示，免后１抗体即上升到将近８ｌｇ，达二０ｄ２３周ｏ到高峰，以后缓慢下降，其抗体滴度下降的速度比首免快，但这可能与种鸡产蛋后其免疫物质传给子代有关，二免后至１９周降至４４ｇ。．２ｌ２ｏ
次免疫。定期采血样，次采４每ｏ份，离血清检测抗体。分
肉鸡：２批肉鸡分别为３００羽和５００羽，期检测母００定
源抗体，当母源抗体降至４ｌｇｏ２以下时，择第二批试验鸡选
一
接种、疫抗体检测、情监测、场生物安全体系建立和各免疫禽项措施的落实。针对性疫苗的使用，禽类获得特异性的抗使
病能力，防治禽流感十分重要的一个环节。目前，内提供是国的禽流感免疫程序还不尽完善合理。嘉定种鸡现有９套，万
由表２可知，鸡２周龄时０３ｍｌ羽免疫后１，种．／０ｄＨＩ抗体就可达到６８ｌｇ，～５周达到高峰期，后缓慢下降．ｏ２３然形成一个平台期，疫１免８周后ＨＩ体水平仍然维持在抗

国家流感中心标准操作规程

第四章病毒鉴定 SOP........................................................................................61
1%鸡红细胞悬液制备 ...................................................................................................63 1%豚鼠红细胞悬液制备 ...............................................................................................67 1%马红细胞悬液制备 ...................................................................................................71 受体破坏酶制备.............................................................................................................75 血清处理.........................................................................................................................79 流感/禽流感病毒红细胞凝集试验................................................................................83 红细胞凝集抑制试验鉴定流感/禽流感病毒方法 ........................................................ 85 流感病毒神经氨酸酶活性试验及其活性抑制试验 .....................................................91 禽流感 H5N1 病毒感染间接免疫荧光检测技术 .........................................................97

重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒病检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒病检测中的应用秦立得;南文龙;陈义平【摘要】重组酶聚合酶扩增技术是近年来建立起的一种常温DNA扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、反应速度快、所需仪器简单等优点.本文介绍了该技术的检测原理、引物及探针设计和影响因素,分析了该技术在动物病毒病检测方面的应用,指出该技术具有良好的现场快速检测与多重及大量样品检测的应用前景.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2017(034)005【总页数】5页(P81-85)【关键词】重组酶聚合酶扩增技术;动物病毒病;研究进展;展望【作者】秦立得;南文龙;陈义平【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032【正文语种】中文【中图分类】S851.342006年，Olaf Piepenburg等[1]报道发明了重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplifi cation，RPA）。

该技术可在37～42 ℃条件下、10～20 min内等温扩增目的基因片段。

随后，英国TwistDx公司开发出了商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用。

与聚合酶链式反应（PCR）相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单（甚至可制作成侧流层析试纸条）等优点，特别适用于快速检测。

目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用。

在目的DNA片段扩增的过程中，引物与uvsX重组酶形成的复合物与DNA结合并沿DNA链寻找引物的同源序列，完成定位后发生链交换反应并打开2条DNA单链间的氢键，单链绑定蛋白（SSB）与单链DNA链结合，阻止形成双链，之后Bsu聚合酶从发生链交换反应的位置开始复制DNA；同时反应体系中含有uvsY 酶，能与uvsX结合并促进uvsX与单链DNA更加紧密的结合，以发生链交换反应，如此循环，从而完成了对目的DNA片段的扩增（图1）。

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立廖志勇;王压娣;温坤;丘立文;狄飚;袁国勇;车小燕【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2007(23)3【摘要】目的制备和鉴定禽流感病毒（H5N1）血凝素（H5）特异性单克隆抗体（mAb）,建立H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。

方法以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb,利用血凝抑制（HI）实验筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验筛选捕获抗体和检测抗体,建立测定H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。

结果获得16株特异性针对H5的单克隆抗体,与A型流感病毒H1、H3、H7、H9和B型流感病毒的血凝素无HI 交叉反应,对H5血凝素的血凝抑制效价为1∶100-1∶51200;通过配对实验,建立以单克隆抗体H5M9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA;检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位,检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性。

结论建立了一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法,可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断。

【总页数】5页(P339-343)【关键词】禽流感病毒H5N1;H5血凝素;单克隆抗体;酶联免疫吸附试验【作者】廖志勇;王压娣;温坤;丘立文;狄飚;袁国勇;车小燕【作者单位】南方医科大学珠江医院临床医学基础研究所;广州市疾病预防控制中心;香港大学微生物系【正文语种】中文【中图分类】R373.17【相关文献】1.H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 谢青梅;徐维加;陈俊伟;王玲玲;马静云;毕英佐;曹永长2.抗禽流感病毒H5亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制 [J], 邵红霞;秦爱建;钱琨;刘岳龙;金文杰3.H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 崔佳莹;李印;于扬;张文亮;邓国华;陈化兰4.抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制及应用 [J], 秦爱建;邵红霞;钱琨;刘岳龙;金文杰5.抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体的研制及鉴定 [J], 郝贵杰;提金凤;陈清;刘文博;吴艳涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《免疫调节》精编练习题

《免疫调节》精编练习题1．人体排除“非己”成分的方式是①阻挡②杀灭③吞噬④凝集⑤溶解A．①②③④⑤ B．只有④⑤ C．只有③④⑤D．②③④⑤2. 下列属于人体的第二道防线的是A. 皮肤角质层细胞屏障作用B. 胃粘膜起保护作用C. 白细胞的吞噬作用D. 淋巴细胞的杀伤作用3. 下列细胞中具有分化能力的是A. 效应B细胞B. 骨髓瘤细胞C. 记忆B细胞D. 胸腺细胞4. 在体内体液免疫和细胞免疫是共同作用来维持内环境的稳态的，下列说法错误．．的是A. 同一抗原物质既可以与抗体结合，也可以被T细胞识别B. 抗原物质在进入组织细胞后，抗体就会与相应的组织细胞结合，刺激细胞消化抗原C. 淋巴因子在细胞免疫过程中产生，广泛分布于内环境中D. 记忆细胞可以接受同一抗原物质的刺激增值、分化5．下列免疫细胞中，不能进一步分化的是( )A．T细胞 B．B细胞C．记忆细胞 D．吞噬细胞6．关于吞噬细胞的叙述中，正确的是（）A．吞噬细胞只在非特异性免疫中发挥作用B．吞噬细胞只在特异性免疫中发挥作用C．吞噬细胞不属于免疫细胞D．吞噬细胞在特异性免疫和非特异性免疫中都发挥重要作用7．下列过程中不属于体液免疫过程的是（）A．抗原处理、呈递和识别的阶段B．形成浆细胞C．形成效应T细胞D．浆细胞产生抗体与相应抗原的特异性结合8．给健康婴儿接种卡介苗，目的是使婴幼儿体内产生（）A．浆细胞 B．效应T细胞 C．记忆细胞 D．抗体9．关于体液免疫的叙述正确的是（）A．有的抗原可以直接刺激B淋巴细胞，产生浆细胞B．抗体是由B淋巴细胞分泌的C．抗体一般可以直接杀死入侵的病菌D．记忆细胞经迅速增殖分化，可形成大量的记忆B细胞10．某种病毒已侵入人体细胞内，机体免疫系统对该靶细胞发挥的免疫作用是（）A．体液免疫 B．细胞免疫 C．自身免疫 D．非特异性免疫11．病毒侵入人体后，血液中会出现相应的抗体。

抗体的基本组成单位及合成抗体的细胞器分别是（）A．氨基酸和核糖体 B．氨基酸和高尔基体C．核苷酸和核糖体 D．核苷酸和高尔基体12．为使移植器官长期存留，病人要长期使用某种药物，该药物的作用是（）A．激活免疫系统 B．使免疫系统变得“迟钝”C．抑制术后感染 C．保证植入器官的血液供应13．现有大小和生长状况相同的同一品系小鼠甲、乙、丙及另一品系小鼠丁，并对甲、乙、丙分别做如下处理：分组甲乙丙处理不做任何处理将丁的皮肤小片移植到乙体表上，14天后，皮肤结痂脱落切除胸腺两周后，再将丁的皮肤片分别移植到甲、乙、丙体表上，则移植的皮肤片最易脱落和最易成活的分别是( )A．乙、甲 B．乙、丙C．甲、丙 D．丙、甲14．最近，高致病性禽流感病毒(H5N1)卷土重来，成千上万只鸟，包括家禽和野鸟，或病死或被宰杀。

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立李娜;张保平;秦爱建【摘要】A double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-EIiSA) for detecting avian influenza viruses was developed. In this method, the microplates were coated by IgC of rabbit polyclonal antibodies against AIV-H9 at the concentration of 3.531 μg/ml (1=8 000). Primary antibody of Mab-7B4 with 1=800 dilutions and antibody-HRP of 1:4 000 dilutions gave the best result. No cross-reaction was observed with NDV, IBV, and EDS-,6V. All of these results showed that DAS-EUSA method was quick, sensitive and repeatable, which was applicable to the detection of AIV and epidemiological investigation.%采用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒(AIV)抗原的双抗体夹心ELISA方法.经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件:兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1:8 000(浓度为3.531 μg/ml),抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1:800,酶标二抗的工作浓度为1:4 000.与其他禽易感病毒(NDV、IBV、EIDS-76 V)等均没有交叉反应.结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可应用于AIV的检测和流行病学调查.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)028【总页数】3页(P17330-17331,17333)【关键词】禽流感病毒;单克隆抗体;双抗体夹心ELISA【作者】李娜;张保平;秦爱建【作者单位】湖南文理学院生命科学学院,湖南常德415000;常德职业技术学院生物工程系,湖南常德415000;扬州大学兽医学院江苏省动物预防医学重点实验室,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65+7禽流感(Avian Influenza，AI)是由流感病毒引起的一种发生于禽类的病毒性传染病［1］。

标准操作规程(SOP)H5N1 流感病毒ELISA 抗体检测方法的建立

本标准操作规程（SOP ）规定了H5N1流感病毒ELISA 抗体检测实验的程序和相应的操作。

本SOP 为规范实验操作、保证样本质量、操作安全而制定。

二、范围中国国家流感中心的所有技术人员使用ELISA 进行H5N1流感病毒抗体检测。

三、责任实验室操作人员严格按要求执行。

四、定义标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。

五、程序（一）生物安全要求检测疑似人高致病性禽流感病例和不明原因肺炎病人血清标本时，血清标本的灭活处理需要在BSL-3级实验室操作，操作人员需以BSL-3级防护。

血清灭活后的检测实验需在BSL-2级实验室操作，操作人员需以BSL-2级防护。

（二）材料1．设备和材料恒温水浴箱：长风 HHW21 微量振荡器：国华 ZW-A 酶标仪：Thermo MK3 洗板机：Thermo WellWashPlus 精确移液器：单通道可调 1－10μL 、20-200μL 、100-1000μL 12通道可调 20-200μL一、目的标准操作规程（SOP ）H5N1ELISA专用试剂槽2．试剂（1）抗原包被液：50mmol/L pH9.6的碳酸缓冲稀释液。

碳酸钠0.79g，碳酸氢钠1.46g，去离子水500mL。

注明配制时间，填写配制记录，配制好的抗原包被液保存在4ºC。

（2）抗原使用杆状病毒表达纯化的HA蛋白（购自 Proteinscience 公司）、有关的抗原应该使用每次监测时流行毒株表达的蛋白作为抗原。

（3）洗液：含0.05％Tween20 ( Sigma Cat# P3563 )PBS，（4）封闭液：2%脱脂奶。

2 mL脱脂奶加入至100mLPBS中。

注明配制时间，填写配制记录，配制好的封闭液保存在4ºC。

（5）样品稀释液：含1%BSA （ Gibco Cat＃15260）PBS（6）阳性对照血清： H5流感病毒阳性的人血清或羊血清（7）阴性对照血清：正常人群血清（8）酶标记物稀释液：含1%BSA PBS（9）辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（sigma公司）使用浓度：1:6000 （10）TMB显色液：北京万泰公司（11）终止液：北京万泰公司（三）实验步骤1．洗板程序：自动洗板机上编程，为H5N1流感病毒抗体检测洗板程序。

H5N1禽流感病毒核酸多重RT—PCR检测方法的建立

学试验仍是诊断ＡＩ和对ＡＩＶ进行定型普遍采用的参考基因库中禽流感病毒Ｍ基因、ＨＡ基因和ＮＡ基因序列．经Ｃｌｕｓｔａｌｘ序列软件比对后，选择在保守区域用ＰｉｒｍｅｒＰｒｉｍｅｒ５．０软件设计了３对引物（表１）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
表１多重ＲＴ — ＰＣＲ引物
引物名称引物寡核苷酸序列（５繁琐、复杂和耗时，难以对ＡＩ进行快速诊断，还存在潜在散毒的危险。ＰＣＲ方法是一种基因体外扩增技术．可以在数小时内对某片断基因扩大数百万倍。该技术具有特异性强、敏感性高、检测快速等特点，已广泛应用于生物学、医学、兽医学的各个领域。多重分型ＰＣＲ是一种特殊ＰＣＲ形式．其最突出的特点是一次反应可以达到既分型又能够鉴定亚型的目的，在Ａ、Ｂ、ｃ三种流感及其他
ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００均购自宝生物工程（大连）有限公司：ＲＮＡ提取液购自科登生物工程有限公司；０．１％组序列高度保守，ＨＡ基因组变异性最强．ＮＡ基因组变异次之ＨＡ基因和ＮＡ基因某些位点的变异可导ＤＥＰＣ水由本室自制：二甲基亚砜购自上海生工生致不同的ＨＡ亚型和ＮＡ亚型［．目前发现ＡＩＶ有ｌ６物工程有限公司。个ＨＡ亚型和１０个ＮＡ亚型。其中Ｈ５、Ｈ７亚型常表１．３引物设计及合成现为高致病性．除了给养禽业带来严重经济损失外［．还可感染人。甚至导致死亡［３］。目前，病毒分离、血清

禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

ａｎｔｉｓｅｒｕｍａｇａｉｎｓｔ９ｋｉｎｄｓｏｆａｖｉａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅａｇｅｎｔａｎｄａｎｔｉｓｅｒｕｍａｇａｉｎｓｔＥ．ｃｏｌｉ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１０％ｉｎｔｈｅｉｎｔｒｏ—ｂａｔｃｈａｎｄｉｎｉｎｔｅｒ—ｂａｔｃｈｔｅｓｔｓ．ＴｈｅｐｒｏｔｏｅｏｌｏｆｉＥＬＩＳＡｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄ
符合率。
［关键词］禽白血病病毒；重组Ｐ２７蛋白；间接ＥＬＩＳＡＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＩｎｄｉｒｅｃｔ— — ＥＬＩＳＡＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｖｉａｎＬｅｕｋｏｓｉｓＶｉｒｕｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
内、批间重复试验变异系数均小于１０％，具有良好的重复性；新建立的ＥＬＩＳＡ方法比ＩＤＥＸＸ公司生
产的ＡＬＶＡ、Ｂ亚群抗体检测试剂盒和Ｊ亚群抗体检测试剂盒相对于免疫光试验（ＩＦＡ）有更高的

禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立

禽流感（avian influenza ，AI ）是由正粘病毒科、流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病[1]。

禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。

尤其是高致病性禽流感，是OIE 规定的法定报告A 类动物疫病[2]。

禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。

H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。

此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒[3,4]。

目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。

以分子生物学技术为基础的荧光PCR 方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR 为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。

本研究基于Taq-Man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。

1材料与方法1.1质粒样品携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL 。

1.2禽流感病毒核酸样品禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。