基因打靶技术_开启遗传学新纪元_滕艳
博士生突破性研究利用基因编辑技术治愈遗传性神经疾病
博士生突破性研究利用基因编辑技术治愈遗传性神经疾病近年来，随着科学技术的快速发展，基因编辑技术作为一项革命性的生物工程技术，正逐渐改变着人们对于疾病治疗的认知。
最近，一项博士生的突破性研究引起了广泛关注，他利用基因编辑技术成功治愈了一种严重的遗传性神经疾病。
这位博士生的研究对象是一种名为亨廷顿舞蹈病的罕见遗传性神经系统疾病。
亨廷顿舞蹈病是由一个单基因突变引起的，患者会出现进行性的舞蹈样不自主运动、认知障碍和精神症状等症状。
目前，亨廷顿舞蹈病没有有效的治疗方法，患者只能通过药物缓解症状，而无法根治。
在这项突破性研究中，博士生首先通过基因测序技术发现了引起亨廷顿舞蹈病的基因突变位点。
然后，他利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，针对这一位点进行了修复。
CRISPR-Cas9技术是一种通过靶向修饰DNA序列来实现基因编辑的技术，它可以精准地定位到目标基因上并进行修复。
通过精确指导CRISPR-Cas9技术，博士生成功地修复了亨廷顿舞蹈病患者基因的突变位点。
为了验证修复效果，博士生将修复后的基因重新引入实验动物体内。
结果令人惊喜的是，实验动物不再出现亨廷顿舞蹈病的症状，其神经系统功能也得到了明显的改善。
这一突破性研究为亨廷顿舞蹈病的治疗提供了新的希望。
基因编辑技术的出现为遗传性疾病的治疗带来了革命性的变革。
传统的药物治疗往往只能缓解症状而无法从根本上解决问题，而基因编辑技术可以直接作用于基因水平，对疾病的根源进行修复。
这种精准的治疗方式可以为患者带来长期的疾病缓解和康复。
尽管基因编辑技术在遗传性神经疾病治疗领域取得了突破性的进展，但在应用过程中仍存在一些挑战和风险。
首先，基因编辑技术对目标基因的修复效果需要经过严格的验证和检测，以确保其安全性和有效性。
其次，基因编辑技术在临床应用中还需要解决基因传递、难以寻找合适的递送系统等问题。
此外，伦理和法律的问题也需要充分考虑，确保技术的应用符合伦理标准和法律规定。
基因打靶技术在现代生物学研究中的应用
miRNA 基因敲除小鼠的研究结果显示， miRNA 能够 决定特定发育过程 的 转 换， 但更多的时候对特定发 育过程 或 者 细 胞 功 能 起 到 精 细 调 节 的 作 用
［10 ， 11］
相当数量的 miRNA 基 因 敲 除 小 鼠 没 有 易 观 察 的 表 型， 或者 仅 在 应 激 或 者 损 伤 时 表 现 出 与 野 生 型 不 同
（ 蛋白质组学国家重点实验室， 军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室， 北京
【中图分类号 】R332
【文献标识码 】A
【文章编号 】16717856 （ 2011 ） 10 、 11003004
doi ： 10． 3969 / j． issn． 1671． 7856． 2011． 10 、 11． 008 尽 管 基 因 打 靶 技 术 的 先 驱 者 2007 年 才 获 得 诺 贝尔生物学或医学 奖， 基因打靶技术在现代生物学 研究中的应用却 已 经 有 25 年 的 时 间 。 基 因 打 靶 技 术的发明 和 应 用 革 命 性 地 改 变 了 现 代 生 物 医 学 研 催生了许 多 生 物 医 学 和 药 物 研 发 领 域 的 究的面貌， 前沿研究， 并直接导 致 了 生 物 医 学 研 究 领 域 中 的 许 多突破性 进 展 。 基 因 打 靶 技 术 的 发 明 使 得 科 学 家 第一次能 对 关 于 特 定 基 因 生 理 功 能 的 假 设 进 行 实 验验证， 并通过基因 打 靶 研 究 真 正 建 立 基 因 和 疾 病 间的因果关系 。 近 年 来， 基因打靶技术在现代生物 学研究中 的 应 用 日 益 深 入 和 广 泛 。 本 文 将 简 要 介 绍相关领域的部分 新 进 展， 以及我们实验室在利用 基因打靶技 术 研 究 转 化 生 长 因 子 -β 信 号 通 路 维 持 组织稳态 和 抑 制 疾 病 发 生 的 生 理 功 能 和 机 制 方 面 的新发现 。 1 基因打靶技术在基因组功能研究中的应用 在过去的二十 年 中， 基因打靶技术已经帮助研 究 者 揭 示 了 大 约 5000 种 哺 乳 动 物 基 因 的 生 理 功 能
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶是一种基因工程技术，它利用特定的DNA序列，将外源基因精确地导入到一个特定的基因位点中。
这种技术可以用来研究基因功能、修复基因缺陷以及开发新的基因治疗方法。
基因打靶的过程包括两个主要步骤：识别和切割。
首先，研究人员使用特定的酶或蛋白质来识别目标基因的特定序列。
这些序列通常是一段短的DNA片段，称为“打靶位点”。
一旦打靶位点被识别，酶或蛋白质会结合到该位点，并启动下一步的切割。
接下来，酶或蛋白质会切割目标基因的DNA序列。
这个切割过程会导致DNA链的断裂，并触发细胞的DNA修复机制。
细胞会尝试修复这个断裂，但通常会出现错误的修复方式，导致插入或删除一些基因序列。
这些插入或删除的基因序列可以是研究人员提前设计好的，也可以是随机发生的。
基因打靶的最终目标是通过插入或删除特定的基因序列，改变目标基因的功能或修复基因缺陷。
例如，科学家可以使用基因打靶来修复一些遗传性疾病中的突变基因。
他们可以通过删除或替换这些突变基因来恢复正常的基因功能，从而治疗相关疾病。
此外，基因打靶还可以用于研究基因功能。
通过切割和修改特定的基
因序列，研究人员可以观察到这些基因对生物体的影响，并进一步理解基因在不同生物过程中的作用。
总而言之，基因打靶是一种精确编辑基因的技术，可以用于研究基因功能和开发基因治疗方法。
随着技术的不断发展，基因打靶有望成为一种重要的工具，用于治疗遗传性疾病和改善人类健康。
基因打靶技术及其应用前景
基因打靶技术及其应用前景摘要：基因打靶是近年来发展起来的对细胞基因组中的某一基因进行定点操作的生物技术。
综述了基因打靶的筛选系统，影响基因打靶效率的几个主要因素及其解决方法，总结了基因打靶在各个学科领域中的应用。
基因打靶是指外源DNA与受体细胞染色体 DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。
它产生于70年代末和80年代初，最初应用于酵母细胞，80年代中期应用于培养的哺乳动物细胞。
此后，科学家将此技术与胚胎干细胞操作技术相结合，使其得到迅猛的发展，并在生物学、医学和畜牧学等学科领域的研究和应用中展现出广阔的前景。
基因打靶的原理和技术路线虽不复杂，但是，由于高等真核生物细胞内外源DNA与靶细胞DNA 序列发生同源重组的机率非常低，所以要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来将是一种非常困难的工作，所以，筛选和富集中靶细胞就成为基因打靶技术中的关键一环。
基因打靶筛选系统选择标记基因定点突变的筛选以犹它大学Capecchi教授的实验为例，介绍选择标记基因定点突变的筛选方法。
首先，在HPrt 序列的第8外显子处插入一个新霉素抗性基因（neo r）作为选择标记，然后用电击转移法将打靶载体导人ES细胞中，通过G418和6-TG（6- thioguanine，6-巯基鸟嘌呤）两种药物的双筛选，得到了既抗G418又抗6-TG的细胞克隆。
从理论上推测，这些细胞克隆都应是对靶细胞Hprt基因进行了定点突变的克隆，因为如果外源基因没整合入靶细胞基因组，靶细胞（Neo--/Hprt+）在G418和6- TG的任何一种选择培养基中都将全部死亡；如果打靶载体只是随机整合入靶细胞基因组，则该 Neo+/Hprt+细胞在6-TG选择液中将全部死亡。
所以，只有通过同源重组，使Hprt位点发生了定点突变的克隆（Neo+/Hprt-）才能在两种选择培养基都存在的情况下存活。
正向选择法（positive lection）正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。
基因打靶技术_开启遗传学新纪元_滕艳
HEREDITAS (Beijing) 2007年11月, 29(11): 1291―1298 ISSN 0253-9772 综 述收稿日期：2007-10-16; 修回日期：2007-10-19基金项目：国家重点基础研究发展规划(973计划)项目(编号：2005CB522506; 2006CB943501)、国家自然科学基金重点项目(编号：30430350)、国家高技术研究发展计划项目(863计划)(编号：2006AA02Z168)、国家支撑计划(编号：2006BAI23B01-3)和北京市平台计划(编号： Z0006303041231)[Supported by National Basic Research Program of China(973 Program) (No.2005CB522506; 2006CB943501), Chinese National Natural Science Foundation (No.30430350), Hi-Tech Research and Development Program of China (863 Program) (No.2006AA02Z168), National Science Supporting Program (No.2006BAI23B01-3) and Beijing Science Projects (No.Z0006303041231)]作者简介：滕艳(1976−), 女, 吉林人, 博士, 研究方向：发育和分子遗传学。
E-mail: tengyan0919@通讯作者：杨晓(1967−), 女, 四川都江堰人, 研究员, 博士生导师, 研究方向：发育和分子遗传学。
E-mail: yangx@DOI: 10.1360/yc-007-1291基因打靶技术：开启遗传学新纪元滕艳, 杨晓军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室, 北京 100071摘要: 基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥着重要的作用。
基因打靶技术
三、打靶载体的构建
• 基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和 突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中 同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶 载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基 因置换型载体(Gene—replacement vector)。插入型 载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位 点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复， 从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线 性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线 性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体 序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载 体进行基因打靶。
常用的选择标记基因
• 正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶 （neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄 嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤 磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk） 及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。
• 负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶 激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、 tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB 等。
• 负选择基因在靶基因同源区之外，位于载 体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重 组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机 整合时，所有的序列均保留（包括tk）。胸 苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷 （GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细
胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合
的细胞株。故同源重组时，G418和 GANC 都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但 对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将 被G418杀死。
• ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持 未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞 类型的细胞。自从1981年美国的Gail和英国 的Evans等 分别成功地从发育中的小鼠囊胚 的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎 干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种 最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中
转基因生物和基因打靶
精子载体法：
经电穿孔等方法把外源基因导入精子，令其与卵
子结合，受精。
•12
6、接受外源基因的个体的产生 1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假
孕动物子宫→胚胎→个体。 2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中 分离多功能胚胎干细胞 →基因操作→注 射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合 个体
•13
•29
•同源重组 •随机整合
•30
3 、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌 合胚胎。
4 、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。
5 、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠 。常有的方法有：Southern印记、 Northern印记
•把细胞注入胚泡
•把胚胎注入 假孕小鼠
•Southern印 记
•31
可作为器官移植的供体
•19
第二节 转基因植物
概念 :指用人工方法将外源基因导入或整合 到基因组内，并能稳定传代的一类植物。
方法：获取目的基因→受体细胞培养→将目 的基因导入受体细胞（载体直接转化或先转 化农杆菌，后者再转化受体细胞）→培养转 化细胞→筛选阳性细胞→培植阳性植株→转 基因植株的鉴定
6、杂和小鼠（+/-）间杂交，获得子二代 小鼠（+/+、-/-、+/-）。
7、筛选的-/-、+/-子二代小鼠。
•（•（++/-/））
••（（++//-））
•）（•）（++/+/+
•（•（+/--/-） •（+/-•（+/- •（-/-）
）
））
•32
三 、基因打靶在医学中的应用
1、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的 疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分 子机制。
基因打靶 育出克隆荧光兔 世界首例胎兔体细胞克隆实验在我国获得成功
顺利进 入成年 期 。 该 中心 主 任 杜立 新 说 ，培 育 出克 隆 兔 ，
个是 发绿 的。据 悉 ，法 国也 培 育 过 荧 光兔 ， 但是偶 然培育 出来 的 ，不 可复制 。
验证 ，完善克隆技术后 ， “ 我们将要培育转
“ 我们正在 试验基 因打靶 技术 。 杜 立新 ”
悉 ，该 所 国家畜禽 分子 遗传 育种 中心 已经用 转基 因技术 培育 出全身 可 以发 出绿色 荧 光 的 兔子 ，标志 着世界 首例 胎兔 体细 胞 克隆 实验 在我 国获得 成功 。一 旦顺 利成 活 ，将 证 明 中
国农科 院 掌 握 的 “ 因打 靶 ” 技 术 完 全 成 基
司从 今年初 开始依靠 乳 品质 量保 证 模块 检测 技术 检测原 料乳 ，检 测 中心 每天 给 公 司发检 测 结果 的电子 邮件 ，这 项技 术 准确 率 高 ，体 现 了公平 、公正 的原则 。天 津市 东 兴奶 牛 养 殖有限公 司是天津奶 牛养殖 大户 ，拥有 １０ ６０
头奶牛 ，公司 总经理李 景轩 说 ，这 项先 进 技
一
据介 绍，荧光兔 有 两个妈 妈 ，没有 爸
３０ —
维普资讯
四 川 奶 业
２０ ０７年第 ４期
爸 ，性别可 以事 先决 定 。兔 子生 下来 后 就
且 同样具 有 生殖能 力 ，它可 以 和家兔 交 配产
跟普通兔子一样养。克隆兔在生理习性上和
家兔没 什么 区别 ，同样爱 吃 青菜 、萝 ｂ，而
下后代。据 （ 新京报）
转 基 因奶 牛 胚 胎 移植 获得 成功
北京 奶牛 中心 与 中国农 业 大学 合作 ， 自 ２０ ０６年 ６月在奶 牛 中心 良种场 开展 了转基 因 牛胚 胎移植 试验并 获 得成 功 。研究 人 员利 用 中国农业 大 学 培 育 的转基 因母 牛作 为 供 体 ， 进行 超数排 卵 和体 内胚胎 生 产 ，将 获 得 的胚 胎移 植 给 荷 斯 坦 青 年 母 牛受 体 。 截 止 ２０ ０７ 已产犊 １ ，存 活 ８头 。其 中 ２０ １头 ０ ７年 ３月 第 一批 出生 的 ５头 犊 牛 ，生 长 发 育 状 况 良 好 ，经 中国农业 大 学研 究 人 员 检测 ，其 中 ３ 头犊 牛携带转 基 因。该 试验 研究 的成 功 ，为 今后快 速扩 繁转 基 因奶 牛和 实现 产业 化 生产 奠定 了基础 。转 基 因牛所 产 牛奶 含有 丰富 的
基因打靶技术及其应用2
应用实例：
Add Your Title
实验一
VBS（可见洞穴系统）实验：
Add Your Title
Approach: front and back（approach to the front or back of another animal ） Self-grooming： lick or rub self Allo-grooming： lick or rub with paws, another animal Huddle Alone
HSV-tk 胸苷激酶 标记基因 ← gangcyclovir （GCV） neor 新霉素抗性 基因→G418
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞
基因打靶的结局有如下可能：
(1)基因敲除(gene knock-out):靶基因被灭活 (2)基因替代:靶基因被导入的基因替代，可以是 以正常基因替代突变的基因。 (3)基因敲入(gene knock-in)：在受体细胞基因 组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因
Wu R，Hendrix Lucas N. Cancer Cell，2007，1l(4)：321-333．
建立人类疾病的动物模型
基于基因同源重组原理的基因打靶技术的出现， 使转基因在体内的定点整合成为现实，因而产生 了去除特定基因的动物模型。 利用基因打靶技术建立了人类癌症、心血管疾病、 骨质疏松、神经退行性病变、免疫缺陷等疾病小 鼠模型，为疾病机理研究、新药研发和治疗方案 提供了宝贵的遗传资源。
实验结论
催产素受体基 因敲除的小鼠
社会交际 能力下降
VS 正常小鼠
展望
发展趋势： 通过条件基因打靶技术在时间和空间上对基因 剔除进行调控； 发展满足大规模基因功能研究需要的随机基因打 靶技术； 通过定位引入技术在基因组上引入精细突变以研 制精确模仿人类疾病的动物模型。
基因打靶技术
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术最早是20世纪70年代在酵母细胞中发展起来的。对 于酵母来说，大多数的外源DNA 片段通过同源重组整合到基因组内， 随机插入仅占小部分，多为同源位点整合， 后来基因打靶技术逐渐应
用于哺乳动物细胞，并得到进一步的发展和改进。
80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行模式试验，
基因打靶的基本环节
4 检测：
观察被击中细胞的生物学特性，并进行分子生物学检 测。可以用特异PCR 方法鉴定， PCR 引物一端以基因组 DNA 的特定基因座为模板，另一端以导入的外源基因为模 板，这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。 对经PCR 鉴定的克隆用Southern 杂交产生特殊带谱的方法 来进一步确定同源重组克隆。
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究 (2) 建立人类疾病的动物模型 (3) 用于疾病的基因治疗 (4) 用于改造生物和培育新的生物品种
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究
后基因组时代主要任务就是研究大量新基因的功能。用体细胞 基因打靶技术通过定点改造基因组中的特定基因，有可能在细胞水平 上研究某一基因的功能及调控机制；从定点突变的干细胞获得基因突 变型个体，可在生物体整体水平上了解某些基因在体内的具体作用。 另外，胚胎发育是非常复杂的生命现象，在这一过程中包含着许多生 理、生化的复杂变化，尤其是要考察某一基因对某一组织器官发育的 影响，用传统的研究方法很难进行观察研究。基因打靶为这一领域的 研究提供了理想的方法
变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是 同源重组效率的关键因素，基因打靶载体的同源重组序目标的DNA 序列进行扩增得到。
7 8 neo 8
6
78
遗传学
林木 比较基 因组 学研 究进 展＝Ｐ ｇｅｓｎｒｓａｃ ｎｆｒｓ ｔ ｅ ｏ ｒ ｒｓ ｅｒｈｏ ｅｔ ｅ ｉ ｅ ｏ ｒ ｃｍｐ ａ ｖ ｅ ｏ ｃ 刊 ，中］ 王源秀（ ｏ ａ ｔ ｅｇｎ ｍｉｓ［ ｒ ｉ ／ 南京林业大学国家林业 局江苏省林木遗传 与基 因工程 重点实验 室，南 京 ２０ ３） １０ ７，徐 立安 ，黄敏仁 ，许远 ∥遗传 ． ２ ０ ，２（０． １９ ～１０ 一 ０ ７ ９１）一 １９ ２ ６ 比较基 因组学是基 因组学 研究 的重要 内容 ． 比较基 因组 学研 究结 果表 明，有可能将近缘种统一起来建立超越物种界限的大 遗传系统 ，这对于林木而言具有更重要的意义．有关林木 比较 基 因组学研究主要集 中在杨柳科 、松科、蔷薇科 、壳斗科 和金 缕梅 科 的一些树种 中．研 究发现 林木近缘 种基 因组 中存在广 泛 的共线性或 同线性及微共线性 ，在进化过程 中呈现高度 保守 性 ； 过双 向比对发现：杨树和拟南芥基因组中有 １ １ 通 ３０ ９对同 源基 因的序列一致性平均达 ９ ％， ３ 其中 １ ５ １ ４对同源 基因的序 ６ 列 一 致 性 超 过 基 因 长 度 的 ９ ％． 概 述 了林 木 比 较 基 因组 学 研 ０ 究 的进 展 状 况 ，探 讨 了 该领 域 的 发 展趋 势 ，以 期 为 我 国林 木 基
展 ． ２ ０ ，３ （ １． １ ３ ～ １ ４ 一 ０ ７ ４ １ ）一 １ ６ １ １
内质网是 细胞 内重要 的细胞器 ，内质 网功能 的损伤 引起 Ｅ Ｒ应 激 （ＲＳ． 内质 网通过激活未折叠 蛋白质反应 （ Ｒ Ｅ ） ＵＰ ）以保护 由内质网应激所 引起 的细胞损伤 ，恢 复细胞功 能，包括暂停早 期蛋白质合成 、内质 网分子伴侣和折 叠酶 的转录激活 、内质 网 相关性降解（Ｒ ） Ｅ ＡＤ 的诱导． 长期过强 的内质网应激诱 导 内质 网相 关性 细 胞凋 亡 ，清 除 受损 细 胞 ，包 括 内质 网应激 诱 导 Ｃ Ｐ Ｇ Ｄ１ ３表达 、Ｊ Ｋ 的激活 以及 ｃｓ ａｅ１ 白水解 ＨＯ ／ ＡＤ ５ Ｎ ａｐ ｓ．２蛋 酶的活化等一 系列生物学效应． 图 １参 ２ ４ 关键词 ：内质 网应激 ；未折叠蛋 白响应 ；细胞凋亡
基因打靶技术在构建人源体细胞基因敲除或敲入细胞系中的应用
基因打靶技术在构建人源体细胞基因敲除或敲入细胞系中的应用时文涛;邵荣光【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2008(003)004【摘要】基因打靶技术能够帮助人们认识某些动物个体或细胞表型异常的遗传基础，利用该技术构建的模式生物（例如基因敲除小鼠）已经广泛地应用于人类基因的研究，截至1999年就已经报道了800多个模式小鼠种系。
同源重组介导的基因打靶技术（基因敲除或敲入）是判定基因功能的强有力工具。
与基因敲除小鼠相比，人类体细胞基因敲除或敲入细胞系构建的报道相对较少，但该项技术在细胞水平上对某些人源基因参与的生化或生理途径的分析是不可替代的。
基因打靶技术最常见的应用是通过使所有等位基因连续失活建立基因敲除细胞系；【总页数】4页(P297-300)【作者】时文涛;邵荣光【作者单位】100050,北京,中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所;100050,北京,中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.CRISPR/Cas9系统介导的EZH2基因定点敲入Hut78细胞系的构建 [J], 鲁卓林;杨冰;赵秀娟;王青松;韩春勇;张玲;孙琰;熊显佳;吴云丹;周慧;贾军;王双林;武莉莉;刘艺洁;乔阳2.应用改良体细胞基因敲入技术内源标记跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1的研究 [J], 宋伟;李尚泽;张慧慧;缪时英;王琳芳;张晓东;杜润蕾3.猴源cathepsin基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建 [J], 魏宇双;杨国宇;刘姣扬;韩莹倩;郭珍珍;刘晓贺;巴根;韩立强;王江;褚贝贝4.稳定表达敲入增强绿色荧光蛋白标记的干扰素γ受体2基因Ifngr2的黑素瘤细胞系的构建与鉴定 [J], 樊浩;周涛;李卫华5.利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠 [J], 高睿;郑祥建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用
基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用时文涛，邵荣光（中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京100050）摘要：同源重组介导的基因打靶技术是一项判定哺乳动物基因功能的强有力工具。
在过去的十几年中，应用于转基因小鼠的基因敲除∕敲入技术经过必要的完善后进一步被应用于人源细胞。
本文介绍了在人源细胞系中基因打靶技术应用的优势与局限性、可应用细胞系的选择、基因打靶的基本方法，并比较系统地讲解了重组腺相关病毒介导的基因打靶的实验设计，以使读者对这项技术的应用有一个基本的了解。
关键词：基因打靶；基因敲除∕敲入；重组腺相关病毒The Application of G ene T argeting T echnology in C onstructionstructing ng G eneK nockout and K nockin C ell L inesWen-tao Shi，Rong-guang Shao（Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Beijing100050,China）Abstract：Homologous recombination-mediated gene targeting technology is the most powerful technique available for analysis of mammalian gene function.Over the past decade years,the methods used to generate knockout and knockin mice have been modified for use in cultured human cells.In this paper,the advantages and limitations of gene targeting technology,suitable cell lines for gene targeting and the basic method for generating knockout/knockin cell lines are introduced.Moreover,we also systematically describe the experimental design of rAAV-mediated gene targeting to enable readers to basically understand the application of this technology. Key words：Gene targeting；Knockout；Knockin；rAAV基金项目：教育部博士点基金（No:20070023017）同源重组介导的基因敲除（knockout）∕敲入（knockin）技术是一项判定基因功能的强有力工具，这种基因打靶技术已经帮助人们在一定程度上认识了某些细胞或动物个体异常表型的遗传基础。
基因打靶技术:开启遗传学新纪元
基因打靶技术：开启遗传学新纪元
滕艳;杨晓
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2007(29)11
【摘要】基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥着重要的作用.近年来,随着条件基因打靶技术的发展使基因失活可以限制在特定时段特定组织或细胞内.文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在其他模式动物中的应用.
【总页数】8页(P1291-1298)
【作者】滕艳;杨晓
【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室,北
京,100071;军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室,北京,100071【正文语种】中文
【中图分类】Q3
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1.DP系列产品光芒上市,开启球栅数显新纪元——走进英国Newall中国销售技术服务中心航天科工惯性技术有限公司 [J], 赵宇龙;张淼
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HEREDITAS (Beijing) 2007年11月, 29(11): 1291―1298 ISSN 0253-9772 综 述收稿日期：2007-10-16; 修回日期：2007-10-19基金项目：国家重点基础研究发展规划(973计划)项目(编号：2005CB522506; 2006CB943501)、国家自然科学基金重点项目(编号：30430350)、国家高技术研究发展计划项目(863计划)(编号：2006AA02Z168)、国家支撑计划(编号：2006BAI23B01-3)和北京市平台计划(编号： Z0006303041231)[Supported by National Basic Research Program of China(973 Program) (No.2005CB522506; 2006CB943501), Chinese National Natural Science Foundation (No.30430350), Hi-Tech Research and Development Program of China (863 Program) (No.2006AA02Z168), National Science Supporting Program (No.2006BAI23B01-3) and Beijing Science Projects (No.Z0006303041231)]作者简介：滕艳(1976−), 女, 吉林人, 博士, 研究方向：发育和分子遗传学。
E-mail: tengyan0919@通讯作者：杨晓(1967−), 女, 四川都江堰人, 研究员, 博士生导师, 研究方向：发育和分子遗传学。
E-mail: yangx@DOI: 10.1360/yc-007-1291基因打靶技术：开启遗传学新纪元滕艳, 杨晓军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室, 北京 100071摘要: 基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥着重要的作用。
近年来, 随着条件基因打靶技术的发展使基因失活可以限制在特定时段特定组织或细胞内。
文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在其他模式动物中的应用。
关键词: 基因打靶; 小鼠; 条件基因打靶; 基因敲除Gene targeting: the beginning of a new era in geneticsTENG Yan, YANG XiaoGenetic Laboratory of Development and Diseases , Beijing Institute of Biotechnology , Beijing 100071, ChinaAbstract : Gene targeting, which allows the efficient modification of specific murine genes, plays important roles in eluci-dating physiological function of genes in vivo , dissecting the genetic mechanisms of human disease and identifying poten-tial targets for drug development. In recent years, the development of conditional gene targeting has provided novel oppor-tunities for gene inactivation in specific cells or organs, and at specific time points, both during development and in the adult animals. In this review, we introduce the history of gene targeting and recent progress of gene targeting technology and its applications in other model organisms.Keywords: gene targeting; mouse; conditional gene targeting; gene knockout在历经近20年的推广和应用后, 基因打靶技术终于获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。
2007年10月8日, 美国科学家Mario R. Capecchi 和Oliver Smithies [1]、英国科学家Martin J. Evans 因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
他们的这些发现直接催生了基因打靶技术, 使得对哺乳动物基因组进行修饰和改造并使之通过生殖系遗传称为可能。
基因打靶技术的发明和应用革命性地改变了现代生物医学研究的面貌, 并导致了生物医学研究各个领域中的许多突破性 进展。
1 基因打靶技术的发展简史基因打靶技术是一种定向改变细胞或者生物个体遗传信息的实验手段[2]。
通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等1292 HEREDITAS(Beijing)2007第29卷修饰和改造, 并使修饰后的遗传信息通过生殖系遗传, 使遗传修饰生物个体表达突变的性状。
通过对遗传修饰生物体的表型分析和机理研究, 帮助人类理解生命现象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的有效方法。
基因打靶技术是在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术成就的基础之上产生和发展的。
同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似DNA序列间的重组。
它通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。
同源重组在进化过程中高度保守, Joshua Lederberg由于50多年前在细菌中首先证实同源基因间重组的原理而获得了1958年的诺贝尔奖。
Capecchi和Smithies 都首先预见到新的遗传物质可以通过同源重组引入哺乳动物细胞的基因组, 并对基因进行特异性修饰和改造。
同源重组技术的概念是20世纪70年代初在酵母研究中发展起来的。
与酵母系统完全不同的是, 哺乳动物细胞中同源重组的概率非常低。
1980年, Capecchi [3]报道用玻璃针将DNA直接注射入细胞核可以显著提高基因转移的效率。
该方法迅速地被改进并用于将新基因引入小鼠受精卵研制转基因小鼠。
他随后证明同源重组可以发生在外源DNA和哺乳动物细胞染色体的同源序列间。
他构建了一种携带有缺陷的新霉素抗性基因的细胞系, 并证明这种有缺陷的抗性基因可以通过与外源DNA间的同源重组得到修复[4]。
在Capecchi这些先驱性的工作进行同时期, Smithies等[5]提出了同源重组可能用于修复突变基因的概念, 并在1985年一篇里程碑论文中报道了在红白血病细胞中实现了人工打靶载体和细胞染色体上β-球蛋白基因间的同源重组。
Capecchi和Smithies的工作均证实了利用同源重组对生物体的遗传信息进行定向改造的可能性, 然而这些工作都是在体外培养的细胞中进行的。
要通过同源重组获得遗传修饰的动物,还需要另外一种重要的载体: ES细胞。
ES细胞是从着床前的哺乳类胚胎中分离的全能干细胞, 具有较强的增殖能力, 经过长期体外培养后仍然具有分化成所有3种胚层的发育潜能[6]。
对ES细胞的研究可以追溯到20世纪50年代对小鼠胚胎进行体外培养的实验。
Whitten[7]于1956年成功地使单细胞的受精卵在体外发育到囊胚阶段。
其后, Brinster[8]于1965年建立了微滴培养技术, 用于着床前小鼠胚胎的培养。
Mclaren等[9,10]对输卵管移植和子宫移植条件进行了优化, 并最终使得通过胚胎移植从体外培养的胚胎产生活的小鼠成为一种常规的技术。
十年后, Gardner[11]建立了将分离的细胞注射入宿主囊胚获得嵌合体小鼠的方法。
这一方法的成功建立使得研究者有可能系统地检测经过体外操作的胚胎细胞的分化全能性。
1970年, Stevens [12, 13]作为先驱者成功分离了小鼠畸胎瘤细胞(embryonal carcinoma, EC)并将其作为模式体系研究胚胎细胞的全能性。
几年后, Brinster [14], Mintz和Illmensee [15], 以及Papaioannou等[16] 证实胚胎瘤干细胞可以整合入宿主囊胚并分化成多种正常成年组织, 但没有胚胎瘤细胞整合入生殖系的报道。
1981年, Evans等[17]和Marin[18]分别报道从正常的小鼠囊胚中分离了ES细胞。
与大多数EC细胞不同, ES细胞具有完全正常的核型。
尤其重要的是, Evans等[19]研究小组在1984年证实通过显微注射引入囊胚的ES细胞可以分化为成体的各种组织并整合入生殖系。
小鼠ES细胞的分离和应用是ES细胞技术发展过程中的里程碑, 它与同源重组技术的结合使得在生物整体水平上定向改变和修饰哺乳类动物的遗传物质成为可能。
1987年, Evans等[20]和Monk等[21]的研究小组在小鼠胚胎干细胞中分别对次黄嘌呤磷酸转移酶基因(Hprt)的进行改造, 并获得了经生殖系遗传的突变小鼠。
Capecchi等[22]发展了一种称为“正负筛选”的策略, 使中靶胚胎干细胞克隆数增加3～10倍, 真正使得同源重组技术可以作为修饰哺乳动物基因组遗传信息的常规手段。
1989年, 真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠相继诞生[23∼25]，开启了遗传学新纪元的大门。
2 基因打靶小鼠研制的新进展2.1 利用位点特异性重组酶系统实现时空上可调节的基因敲除自从1994年第一例应用Cre-LoxP系统研制的组织特异性基因敲除小鼠问世以来[26], 条件基因敲除技术迅速取代了传统的完全基因敲除成为主流[27]。
条件基因敲除技术利用Cre-LoxP和FLP-FRT位点特异性重组酶系统使得时空特异性基因敲除变为现实。
在特定阶段特定组织或细胞中表达Cre或FLP重组酶的转基因小鼠通过与在基因组中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配, 可导致子代鼠中特定组织或细胞中的靶基因被删除。
基于Cre-LoxP系统的第二第11期滕艳等: 基因打靶技术: 开启遗传学新纪元 1293代小鼠模型可以克服重要功能基因敲除所导致的早期致死表型, 模拟人类疾病相关的体细胞突变, 并对突变进行时空上的调控, 提供了激动人心的新机会研究已知或者未知基因的在疾病的起始、发生和治疗过程中的作用及其机制。