荧光光谱法研究蒜头果蛋白与金属离子的相互作用

第３４卷，第１２期 光谱学与光谱分析Vol .３４，No .１２，pp ３２９７-３３００２０１４年１２月 Spectroscopy and Spectral Analysis December ，２０１４　荧光光谱法研究蒜头果蛋白与金属离子的相互作用袁　燕１，张　薇１，戴建辉１，刘晓芳１，王红斌１，Colin J Barrow ２，杨文荣２１．云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南昆明　６５０５００ ２．Center for Chemistry and Biotechnology ，School of Life and Environmental Sciences ，Deakin U niversity ，Geelong ，VIC ３２１６，Australia摘　要　蒜头果蛋白（malanin ）是从云南、广西特有植物蒜头果中分离纯化出的一种新的、具有抗肿瘤活性的糖蛋白。

用荧光光谱法研究了Cu ２＋，Ag ＋和Ca ２＋对malanin 和apo -malanin 溶液（经EDT A 透析脱去金属离子后的脱金属蛋白）荧光强度的影响。

结果表明，Cu ２＋对malanin 和apo -malanin 荧光均有明显的静态猝灭现象，其离解常数K d 分别为２.３７×１０－４和２.６６×１０－４mol ・L －１；Ag ＋对malanin 的荧光强度变化不大，但对apo -malanin 荧光强度却有明显的静态猝灭现象，其离解常数K d 为２.３７×１０－４mol ・L －１；而Ca ２＋对malanin 和apo -malanin 荧光强度均无明显变化，说明Ca ２＋对维持malanin 分子天然构象具有重要作用。

关键词　荧光光谱；蒜头果蛋白；金属离子；荧光猝灭中图分类号：O ６５７.３ 文献标识码：A DOI ：１０.３９６４／j .issn .１０００-０５９３（２０１４）１２-３２９７-０４　收稿日期：２０１３-０９-１１，修订日期：２０１３-１２-１５　基金项目：国家自然科学基金项目（８１２６０５００），云南省教育厅重点项目（２０１１Z ０４７），教育国际化平台建设项目（２１８-０２００１００１００２１２９）和云南省《无机化学精品课程》项目（２０１２HX ０８，２０１２HX １２）资助　作者简介：袁　燕，１９７５年生，云南民族大学化学与生物技术学院副教授 e -mail ：５４９８８３６３＠qq .com引　言 蒜头果蛋白（malanin ）是从广西、云南特有植物———蒜头果（M alania olei f era ）中分离纯化出一种新的、具有抗肿瘤活性的糖蛋白［１-３］。

体外抗肿瘤活性筛选结果表明，malanin 具有明显抑制人宫颈癌HeLa 、神经瘤PC -１２、人乳腺癌MCF -７和人白血病K ５６２等肿瘤细胞体外增殖的能力，其半致死浓度IC ５０值分别为１.５４×１０－１０，７.７１×１０－９，１.１２×１０－８和１.５８×１０－８mol ・L －１［４］，说明malanin 具有非常强的抗肿瘤活性，可作为抗癌药物的先导分子，具有用于免疫毒素治疗癌症的应用前景。

由于malanin 的一级结构还未知，为更清楚地了解其结构与功能的关系，采用荧光光谱法探索Cu ２＋，Ag ＋和Ca ２＋对malanin 和apo -malanin （经EDT A 透析脱去金属离子后的脱金属蛋白）溶液的作用与影响，研究随着Cu ２＋，Ag ＋和Ca ２＋浓度的增加，Malanin 和apo -malanin 溶液的荧光强度的变化，得到了一些有意义的结果，为进一步探索malanin 的结构与抗肿瘤活性功能间的关系奠定基础。

１　实验部分1.1　仪器与试剂Milli -Q 纯水机（Millipore ），日立F -４５００荧光分光光度计（Hitachi ），微量移液器（Eppendorf ），万分之一电子天平（Sartorius ）。

蒜头果蛋白样品由云南大学教育部自然资源药物化学重点实验室制备，化学试剂均为国产分析纯。

1.2　方法用p H ７.２的T ris -HCl 缓冲液配制１mg ・mL －１（约为１.６２×１０－５mol ・L －１）malanin 和apo -malanin 溶液（内含０.１mol ・L －１氯化钠），在一系列的试管中加入３mL 样品，分别向溶液中滴入７.５×１０－３mol ・L －１硫酸铜、硝酸银和氯化钙溶液１，３，５，９，１２滴（１０μL ・滴－１），配成Cu ２＋，Ag ＋和Ca ２＋浓度为一倍至数倍于１.５×１０－５mol ・L －１的溶液，于日立F -４５００荧光分光光度计上测定每个样品的荧光光谱（光径为１cm 的荧光池，激发和发射狭缝均为５nm ）。

1.3　动态荧光猝灭与静态荧光猝灭原理［5，6］１.３.１　动态荧光猝灭荧光物质的激发态分子通过与猝灭剂分子的碰撞作用，以能量转移或电荷转移的机制丧失其激发能而返回基态，这种现象称为动态猝灭。

动态荧光猝灭服从Stern -Volmer 方程F ０／F ＝１＋K q τ０［Q ］＝１＋K D ［Q ］（１）K D ＝K q τ０（２）式中，F 为加入猝灭体后的荧光强度，F ０为猝灭体不存在时荧光体的荧光强度，K q 为双分子猝灭常数，τ０为猝灭体不存在时荧光体的荧光寿命，［Q ］为猝灭体浓度，K D 为Stern -Volmer 常数。

１.３.２　静态荧光猝灭荧光分子和猝灭剂之间形成不发光的基态配合物，或者激发态的荧光分子形成有效的猝灭球模型，这种现象称为静态猝灭。

静态猝灭服从的关系为F ０／F ＝１＋K s ［Q ］（３） 静态荧光猝灭通常采用Lineweaver -Burk 双倒数函数关系，即由式（３）变形可得F ０／（F ０－F ）＝１＋K d （１／［Q ］）（４）K d ＝１／K s （５）式中，K s 为荧光体与猝灭体之间的结合常数，K d 为离解常数。

２　结果与讨论2.1　EDTA 对malanin 荧光光谱的影响测定不同浓度的EDTA 与malanin 和游离T rp 作用的荧光光谱。

结果表明，malanin 在２８０nm 处有最大激发峰，荧光发射峰在３３６nm 处，该发光特征是由于malanin 中T rp 残基的发光所致。

由图１可以看出，EDTA 对游离T rp 的荧光强度几乎没有影响；Malanin 荧光发射峰位始终为３３６nm ，但荧光强度却随EDT A 浓度的增加而逐渐下降。

可能是由于EDT A 的加入络合了malanin 中的金属离子，改变了该蛋白质分子原有的构象及其T rp 残基的微环境，从而使其荧光强度减弱［７］。

Fig .1　Effects of EDTA on the fluorescenceintensities of Trp and malanin2.2　Cu 2＋对malanin 的荧光作用Malanin 和经EDT A 透析脱去金属离子后的脱金属蛋白（apo -malanin ，用“*”表示其相应的各特征量）均在２８０nm 处有最大激发峰，荧光发射峰在３３６nm 处，当Cu ２＋的浓度逐渐增大时，激发峰和发射峰没有移位，但发射峰强度明显减弱，出现典型的荧光猝灭现象（如图２）。

根据（１）式，将F ０／F 对所加入的Cu ２＋总浓度［Cu ］作图，其Stern -Volmer 曲线如图３，可以算出K D ＝１.６２×１０４L ・mol －１，K *D ＝５.５７×１０３L ・mol －１，由于生物分子的荧光寿命τ０约为１０ns 数量级［８］，由式（２）可得Cu ２＋的表观猝灭常数K q ＝１.６２×１０１３L ・mol －１・s －１，K *q ＝５.５７×１０１２L ・mol －１・s －１。

由于各种猝灭剂对生物分子的最大扩散碰撞猝灭常数约为２.０×１０１０L ・mol －１・s －１［９］，显然Cu ２＋的K q 和K *q 远远大于２.０×１０１０L ・mol －１・s －１，故Cu ２＋对malanin 和apo -malanin 溶液的猝灭过程不是因为分子扩散和碰撞所引起的动态猝灭，而是分子之间结合形成了化合物所引起的静态猝灭［１０］。

Fig .2　The fluorescence of malanin andapo-malanin quenched by Cu ionFig .3　The Stern -volmer curve of malaninand apo -malanin by Cu ion 根据静态猝灭（４）式，将F ０／（F ０－F ）对所加入Cu ２＋总浓度的倒数１／［Cu ］作图，其Lineweaver -Burk 曲线如图４，可以算出离解常数K d ＝２.３７×１０－４mol ・L －１，K *d ＝２.６６×１０－４mol ・L －１，结合常数K s ＝４.２２×１０３L ・mol －１，K *s ＝３.７７×１０３L ・mol －１。

Fig .4　The Lineweaver -Burk curve of malaninand apo -malanin by Cu ion2.3　Ag ＋对malanin 的荧光作用在相同条件下向malanin 和apo -malanin 溶液中分别滴加AgNO ４，结果发现，随着Ag ＋浓度逐渐增大，malanin 荧光强度几乎不变，不出现荧光猝灭现象，而apo -malanin 荧光８９２３光谱学与光谱分析 第３４卷强度逐渐减弱，出现明显的荧光猝灭现象（如图５）。

根据（１）式，将F *０／F *对所加入的Ag ＋总浓度［Ag ］*作图，其Stern -Volmer 曲线如图６所示，可以算出K *D ＝１.１４×１０４L ・mol －１，由式（２）可得Ag ＋的K *q ＝１.１４×１０１３L ・mol －１・s －１，显然Ag ＋的K *q 也远远大于扩散控制的猝灭常数２.０×１０１０L ・mol －１・s －１，故Ag ＋对apo -malanin 溶液的猝灭过程也是静态猝灭［１１］。

Fig .5　Effects of Ag ion on the fluorescence intensities of mala -nin and apo -malanin by Ag ion Malanin 用EDT A 透析脱去金属离子后，加入的Ag ＋可能与apo -malanin 分子的其他部位结合，微扰了malanin 的活性部位，使其局部构象发生变化［１２］。