中华鳖爆发性传染病研究——Ⅳ.不同生化类型嗜水气单胞菌aer基因的PCR比较

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不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析葛慕湘;张艳英;靳晓敏;房海;陈翠珍【摘要】Forty - two pathogenicity Aeromonas hydrophila strains isolated from Whitmania pigra, Rana temporaria chens-inensis, Paralkhthys olivaceus, Ctenopharyngodon idellua, Mylopharyngodon piceus and Cyprinus carpio were investigated for the presence of outer membrane protein (OMP) genes using PCR methods in this study, and the homology of OMP genes from diverse representative A. hydrophila strains were compared with available sequences in the NCBI GenBank including four strains of A. hydrophila ( FJ437030. 1, AF183931. 1, AF276639. 2 andCP000462. 1 ) and one strains of A. sobria (FJ437029. 1) using the soft - ware DNAStar. The results show that all the detective strains contain the OMP gene, the carrier rate is 100% . The OMP genes of seven A. hydrophila strains which were sequenced share 86. 0% ~ 99. 2% nucleotide sequence homology with the reference strains. There is higher homology (98. 3% ~ 100% ) within seven A. hydrophila strains which were isolated from different hosts. Among them, the strain HTQ010505 - 1 isolated from W. pigra display the highest nucleotide (100% ) homology with strainsHL060811 -4 isolated from M. piceus.%采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测；将代表菌株的外膜蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和l株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析.结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100％；所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0％～ 99.2％之间.所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3％～100％,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100％.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2013(043)002【总页数】5页(P75-79)【关键词】嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);外膜蛋白基因;序列分析【作者】葛慕湘;张艳英;靳晓敏;房海;陈翠珍【作者单位】河北科技师范学院,河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066600【正文语种】中文【中图分类】S917.4;Q789嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是危害鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物的一种革兰氏阴性条件致病菌，可引起细菌性败血症、腹水病、腐皮病等多种疾病，给多种淡水养殖动物带来严重威胁［1］。

嗜水气单胞菌毒力因子及病害控制技术研究进展

嗜水气单胞菌毒力因子及病害控制技术研究进展嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是革兰氏阴性杆菌，隶属于弧菌科气单胞菌属，广泛存在于淡水、污水及土壤中[1]。

其能引发多种水生动物的传染病，导致水产动物出现出血症，给养殖业造成的经济损失尤为严重，是我国淡水养殖鱼类暴发性传染病的主要病原[2]。

此外，嗜水气单胞菌还是人、畜、鱼共患的致病微生物，不仅能引起动物的全身性败血症或局部感染，而且也能引起人的急性胃肠炎、败血症及伤口感染、中耳炎、腹膜炎等，因而受到水产学界、兽医学界和医学界的广泛重视[3]。

目前，国内外学者在对嗜水气单胞菌毒力因子及病害控制技术方面已取得了一定研究进展，该文对其研究现状进行综述。

1致病因子嗜水气单胞菌产生危害的毒力因子主要有外毒素（exotoxin）、胞外蛋白酶（extracelluar protease）、S层蛋白（S-layer protein）、菌毛（fimbriae）、外膜蛋白（out-membrane pro-teins，OMPs）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等[4]。

该文将这些毒力因子归纳为外毒素、胞外产物和粘附因子3类，现逐一论述如下。

1.1外毒素（exotoxin）1.1.1溶血素（hemolysin）。

出血是变温动物感染嗜水气单胞菌的普遍症状[5]。

由于在被感染鱼类的体内、体外均可检测到溶血活性，所以溶血素被认为是嗜水气单胞菌的主要毒力因子之一。

龚晖等[6]用纯化溶血素分别与1%欧洲鳗鲡血红细胞、1%兔血红细胞、1%羊血红细胞进行溶血特性分析，并利用单克隆抗体进行溶血抑制试验，结果表明嗜水气单胞菌溶血素在单因子条件下与嗜水气单胞菌ECPs的溶血特性存在一定的差异。

嗜水气单胞菌ZN1-ECPs中存在多种溶血性毒素，这些毒素对不同宿主的溶血能力存在差异，同一嗜水气单胞菌菌株对不同的宿主起主要作用的溶血性毒素也不同。

Goswami et al[7]首次报道致病菌暴露在砷外源物质的情况下会抑制嗜水气单胞菌的溶血性和细胞毒性。

循环水养殖系统中高毒力嗜水气单胞菌的鉴定与药敏试验

收稿日期：2021-10-04修回日期：2023-02-02基金项目：浙江省“十四五”育种专项水产协作组项目（编号：2021C02069）；浙江省“三农六方”科技协作计划项目（编号：2021SN-LF026）。

作者简介：焦锦彪，1998年生，男，硕士研究生，研究方向为水产动物病害防治。

E-mail:****************通信作者：张海琪，1977年生，男，教授级高级工程师，主要从事水产育种和病害防治教研工作。

E-mail:**************循环水养殖系统中高毒力嗜水气单胞菌的鉴定与药敏试验焦锦彪1,2，黄雷2，林锋2，姚嘉赟2，袁雪梅2，苏胜齐1，张海琪2（1.西南大学水产学院，农业农村部长江上游水生生物多样性保护研究中心，渔业资源环境研究中心，重庆北碚400715；2.浙江省淡水水产研究所，农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江省鱼类健康与营养重点实验室，湖州市渔业环境与水产品质量安全重点实验室，浙江湖州313001）摘要：为探究中华鳖（Pelodiscus sinensis ）循环水养殖过程中出现体表穿孔和溃疡的病因，对患病中华鳖的肝、脾、肺和肾等部位取样并进行病原菌分离及革兰氏染色，利用16S rRNA 测序和生化鉴定相结合进行细菌鉴定，通过毒力基因PCR 检测和人工回感试验评估细菌的致病性，以纸片扩散法评估几种抗生素的抑菌效果，利用琼脂打孔法评估中药提取物的抑菌效果。

结果显示，从病鳖的脏器中分离到一株优势菌AH0421，该菌为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状；菌株AH0421与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ）模式菌株ATCC 7966的16S rRNA 序列相似性高达99.66%。

菌株AH0421能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，具有O/129耐受性，其携带act 、aerA 、aha 、ahh 、ahp 、ahpA 、alt 、ast 、hlyA 、lip 、ompA 毒力基因。

一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治

一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治周秀娟１，梁倩蓉２，朱凝瑜２，丁雪燕２，朱斐１∗㊀（１．浙江农林大学动物科技学院㊃动物医学院／浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室／动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室，浙江杭州３１１３００；２．浙江省水产技术推广总站／浙江省渔业检验检测与疫病防控中心，浙江杭州３１００２３）摘要㊀２０２１年５月，浙江诸暨某中华鳖养殖场中华鳖脖子肿胀㊁伸长，底板出现多处血点，并伴随大量死亡，经解剖可见腮部糜烂㊁充血明显，内脏呈现不同程度病变㊂从病鳖腮㊁肝㊁脾㊁肾㊁肠等组织分离纯化病原菌，经形态观察㊁生化鉴定确定其种属，并采用微量肉汤连续稀释法确定８种国标渔药对其最低抑菌浓度；同时，利用ＰＣＲ方法检验是否存在病毒感染㊂结果显示：自有典型临床症状的中华鳖组织中分离到嗜水气单胞菌㊂药敏试验结果表明，该菌对恩诺沙星㊁硫酸新霉素和盐酸多西环素３种抗菌药物敏感㊂同时，在患病中华鳖内脏中检测到一种病毒，通过测序与构建系统进化树发现该病毒与中华鳖出血性综合征病毒同源性最高且聚为一支㊂病原回归感染试验结果表明，分离的嗜水气单胞菌与病毒均可引起中华鳖不同程度死亡㊂该例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与出血性综合征病毒混合感染所致㊂该研究可为中华鳖腮腺炎的科学诊断与防控提供理论依据㊂关键词㊀中华鳖；腮腺炎；出血性综合征病毒；嗜水气单胞菌中图分类号㊀Ｓ９４７．１㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）１８－００８２－０５ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．１８．０１９㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎｆｏｒａＣａｓｅｏｆＰａｒｏｔｉｄｉｔｉｓｉｎＴｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓＺＨＯＵＸｉｕ⁃ｊｕａｎ１，ＬＩＡＮＧＱｉａｎ⁃ｒｏｎｇ２，ＺＨＵＮｉｎｇ⁃ｙｕ２ｅｔａｌ㊀（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｐｐｌｉｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｎＧｒｅｅｎ⁃Ｅｃｏ⁃ＨｅａｌｔｈｙＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ／ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊃ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒ⁃ｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ３１１３００；２．ＺｈｅｊｉａｎｇＦｉｓｈｅｒｉｅｓＴｅｃｈｎｉｃａｌＥｘｔｅｎｓｉｏｎＣｅｎｔｅｒ／ＺｈｅｊｉａｎｇＦｉｓｈｅｒｉｅｓＴｅｓｔａｎｄＡｑｕａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ３１００２３）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎＭａｙ２０２１，ＴｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓｉｎａｂｒｅｅｄｉｎｇｆａｒｍｏｆＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓｉｎＺｈｕｊｉｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｈａｄｔｈｅｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｓｗｏｌｌｅｎａｎｄｅｌｏｎ⁃ｇａｔｅｄｎｅｃｋ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｂｌｏｏｄｓｐｏｔｓｏｎｔｈｅａｂｄｏｍｅｎａｎｄｈｉｇｈｌｙｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ａｆｔｅｒａｕｔｏｐｓｙ，ｏｂｖｉｏｕｓｅｒｏｓｉｏｎａｎｄｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎｉｎｐａｒｏｔｉｄａｎｄｓｅｖｅｒａｌｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｖｉｓｃｅｒａｗｅｒｅｆｏｕｎｄ．Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｉｓｓｕｅｓｏｆｐａｒｏｔｉｄ，ｌｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎ，ｋｉｄｎｅｙａｎｄｉｎｔｅｓ⁃ｔｉｎｅｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｄＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ，ａｎｄｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎ⁃ｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｅｉｇｈｔｋｉｎｄｓｏｆｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｆｉｓｈｅｒｙａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｍｉｃｒｏ⁃ｂｒｏｔｈｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．ＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｉｓｓｕｅｓｏｆＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓｗｉｔｈｔｙｐｉｃａｌｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ．Ｔｈｅｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｅｎ⁃ｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｎｅｏｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅａｎｄｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｖｉｒｕｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｓｅｖｅｒａｌｏｒｇａｎｓｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｄｔｕｒｔｌｅｓ．Ｂｙｓｅ⁃ｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｖｉｒｕｓｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓａｎｄｃｌｕｓ⁃ｔｅｒｅｄｉｎｔｏａｂｒａｎｃｈ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｏｔｈＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｏｒｔｈｅｖｉｒｕｓｃｏｕｌｄｃａｕｓｅｔｈｅｄｅａｔｈｏｆＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ．ＴｈｅｐａｒｏｔｉｄｉｔｉｓｉｎｔｈｉｓｃａｓｅｗａｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｍｉｘｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓａｎｄＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐａｒｏｔｉｄｉｔｉｓｉｎＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｔｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓ；Ｐａｒｏｔｉｄｉｔｉｓ；Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ；Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ基金项目㊀浙江省基本公益研究项目（ＬＹ２０Ｃ１９０００１）；浙江农林大学科研发展基金项目（２０２０ＦＲ０４１）㊂作者简介㊀周秀娟（１９９２），女，山东滨州人，讲师，博士，从事水产动物病害与免疫研究㊂∗通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事水产动物病害与免疫研究㊂收稿日期㊀２０２２－０８－１２㊀㊀中华鳖因其具有较高的经济价值而成为我国重要的淡水养殖品种之一㊂中华鳖营养丰富㊁肉味鲜美，具有较高的食用与药用价值［１－４］，养殖分布广泛，湖南㊁湖北㊁江西㊁安徽㊁江苏㊁浙江等省份产量较高［５－６］㊂浙江省中华鳖养殖品系众多，包括中华鳖日本品系㊁清溪乌鳖等，并自主繁育了中华鳖浙新花鳖（ＧＳ－０２－００５－２０１５）等㊂然而，近年来中华鳖病害发生较多，导致养殖损失惨重㊂目前已报道的中华鳖病害包括病毒病㊁细菌病㊁真菌病和寄生虫病，其中病毒病和细菌病较为严重［７－９］㊂目前已知的中华鳖病毒主要有动脉炎病毒㊁黄病毒㊁虹彩病毒等［１０－１１］，细菌病病原主要为气单胞菌和弧菌［１２－１３］㊂２０２１年５月，浙江省诸暨市某养殖场出现中华鳖大量死亡病例㊂笔者实地采集该养殖场患病中华鳖，进行组织解剖㊁平板划线分离优势菌，并通过细菌生理生化试验和病毒分子生物学分析的方法进行分类鉴定，再通过药敏试验筛选出能有效抑制病原菌的抗菌药物，最后提出合理防控建议，旨在为中华鳖腮腺炎的科学诊断和防控提供基础支撑㊂１㊀材料与方法１．１㊀材料与仪器１．１．１㊀试验动物㊂浙江诸暨某中华鳖养殖场出现连续性死亡，病鳖行动迟缓，脖颈肿大且无法缩回壳内，底板发白，底板和四肢病鳖行动迟缓㊁少食厌食，脖颈肿大㊁无法缩回壳内，底板和四肢有明显出血点或斑块㊂取该养殖场５只患病中华鳖作为试验动物㊂１．１．２㊀主要试剂㊂营养琼脂培养基㊁脑心浸出液购自青岛海博生物技术有限公司；９６孔药敏板购自南京菲恩医疗科技有限公司；ＲＮＡ提取试剂盒㊁ＤＮＡ提取试剂盒㊁ＰＣＲ相关试剂均购自上海捷瑞生物工程有限公司；特异性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成㊂１．１．３㊀主要仪器㊂全自动细菌生理生化鉴定仪（ＶＩＴＥＫ２Ｃｏｍｐａｃｔ，法国梅里埃）；ＰＣＲ仪（Ａｒｋｔｉｋ９６，美国Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈ⁃ｅｒ）；多功能电泳仪（ＰｏｗｅｒＰａｃＨＣ，美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ）；低温冷冻离心机（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ２０Ｒ，美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）等㊂㊀㊀㊀安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（１８）：８２－８６１．２㊀病鳖解剖与病原分离㊀选取症状典型的濒死病鳖，无菌条件下使用接种环从其腮腺㊁肝㊁脾㊁肾㊁肠等病灶部位蘸取划线接种于营养琼脂培养基，２８ħ下培养过夜，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌（编号为ＳＲ１），保存在含２０％甘油的脑心浸出液中，置于－８０ħ冰箱中保存㊂取肝㊁肾㊁脾等内脏组织保存于ＤＮＡ／ＲＮＡ保护液中，用于病毒检测㊂１．３㊀细菌鉴定㊀将纯化的细菌进行革兰氏染色，根据染色结果选择相应鉴定卡，用无菌生理盐水将细菌浓度调至１０７１０８ＣＦＵ／ｍＬ，插上鉴定卡，放入全自动细菌生理生化鉴定仪中培养鉴定㊂１．４㊀病毒检测㊀利用ＲＮＡ㊁ＤＮＡ提取试剂盒分别提取病鳖肝㊁脾㊁肾组织ＲＮＡ和ＤＮＡ，利用中华鳖出血性综合征病毒（ＴＳＨＳＶ）㊁虹彩病毒（ＳＴＩＶ）和黄病毒（ＦＬＶ）３种已知中华鳖病毒特异性引物（引物见表１，引物参考Ｌｉｕ等［１４］㊁范万红等［１５］报道以及经ＮＣＢＩ网站序列信息设计），进行ＰＣＲ扩增㊂经１％的琼脂糖凝胶电泳初步判定扩增产物为目的条带大小附近的单一条带后，胶回收产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序㊂表１㊀病毒特异性引物对Ｔａｂｌｅ１㊀Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列（５ᶄ ３ᶄ）Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５ᶄｔｏ３ᶄ）基因库登录号ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＴＳＨＳＶ－ＦＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＴＴＭＨ４４７９８７．１ＴＳＨＳＶ－ＲＡＡＧＡＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＳＴＩＶ－ＦＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＦ＿００１４４８３７５．１ＳＴＩＶ－ＲＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＦＬＶ－ＦＣＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＣＭＷ０３２２６４．１ＦＬＶ－ＲＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴ㊀㊀将测序所得的病毒序列在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行Ｂｌａｓｔ比对，选取相似度高的序列，使用ＣｌｕｓｔａｌＸ进行多重序列同源性比对，使用ＭＥＧＡ８．０软件采用邻接法（ＮＪ法）构建系统进化树㊂１．５㊀药敏试验㊀采用微量肉汤连续稀释法进行药敏试验㊂纯化的菌落用无菌生理盐水将浓度调至１０７１０８ＣＦＵ／ｍＬ，稀释后加入９６孔药敏板，２８ħ下培养２４２８ｈ后读板㊂根据培养后９６孔药敏板的浊度，确定恩诺沙星㊁硫酸新霉素㊁甲砜霉素㊁氟苯尼考㊁盐酸多西环素㊁氟甲喹㊁磺胺间甲氧嘧啶钠㊁磺胺甲噁唑／甲氧苄啶８种渔用抗菌药物对菌株的最低抑菌浓度（ＭＩＣ值），统计８种抗菌药物对病原菌的ＭＩＣ５０和ＭＩＣ９０㊂１．６回归感染试验１．６．１㊀出血性综合征病毒人工感染㊂按照Ｌｉｕ等［９］的方法，取病鳖肝㊁脾㊁肾等组织加入无菌生理盐水（质量体积比１ʒ１０）充分研磨后１２０００ｒ／ｍｉｎ㊁４ħ下离心１０ｍｉｎ，取上清液经０．２２μｍ滤膜过滤，并将其作为病毒粗提液进行攻毒㊂在（２５ʃ１）ħ水温条件下，对２０只平均质量３００ｇ的健康中华鳖进行腹腔注射，每只鳖注射２００μＬ病毒粗提液（试验组），以等体积无菌生理盐水注射２０只相同规格的中华鳖作为对照组，观察记录２组中华鳖的死亡数量，并统计累计死亡率㊂取感染中华鳖肝㊁脾㊁肾等组织提取核酸，进行ＰＣＲ扩增，方法同１．４㊂１．６．２㊀嗜水气单胞菌人工感染㊂取分离菌株接种于脑心浸出液，３０ħ下培养２４ｈ，５０００ｒ／ｍｉｎ离心并去除培养液后，无菌生理盐水重悬并调节浓度至１０７ＣＦＵ／ｍＬ㊂在（２５ʃ１）ħ水温条件下，对２０只平均质量３００ｇ的健康中华鳖进行腹腔注射，每只鳖注射２００μＬ细菌悬液（试验组），用等体积无菌生理盐水注射２０只相同规格的中华鳖作为对照组，观察记录２组中华鳖的死亡数量，并统计累计死亡率㊂从感染中华鳖腮腺㊁肝㊁脾㊁肾等部位蘸取划线培养并鉴定，方法同１．２和１．３㊂２㊀结果与分析２．１㊀病鳖临床症状和剖检结果㊀病鳖行动迟缓㊁少食厌食，脖颈肿大㊁无法缩回壳内，发白的底板和四肢有明显出血点或斑块㊂经解剖可见，病鳖腮部出现糜烂及出血，肝脏肿胀，肠道充血明显，伴有腹水（图１）㊂注：Ａ．脖颈浮肿，底板有血斑；Ｂ．肠道充血；Ｃ．腮部糜烂及出血；Ｄ．腹水㊂Ｎｏｔｅ：Ａ．Ｐｕｆｆｙｎｅｃｋ，ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎｓｏｎｔｈｅａｂｄｏｍｅｎ；Ｂ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅｈｙｐｅｒｅｍｉａ；Ｃ．Ｐａｒｏｔｉｄｅｒｏｓｉｏｎａｎｄｂｌｅｅｄｉｎｇ；Ｄ．Ａｓｃｉｔｅｓ．图１㊀病鳖临床症状及病理变化Ｆｉｇ．１㊀ＴｈｅｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｄＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ２．２㊀细菌分离与生化鉴定㊀从患病中华鳖腮腺㊁肝㊁脾㊁肾㊁肠组织中均分离到一种主要优势菌，菌落呈圆形，边缘完整，３８５１卷１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀周秀娟等㊀一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治中央有突起，表面光滑，浅黄色，半透明，革兰氏染色呈阴性（图２）㊂基于全自动细菌生理生化鉴定仪鉴定结果，该优势菌为嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ），菌株相似性为９９％㊂该优势菌生理生化特性见表２㊂２．３㊀病毒分子生物学鉴定㊀利用３种中华鳖常见病毒特异性引物进行病毒检测，其中ＳＴＩＶ㊁ＦＬＶ特异性引物未扩增到条带；ＴＳＨＳＶ引物扩增获得长度约３０８ｂｐ的片段（图３）㊂产物切胶回收测序，序列经Ｂｌａｓｔ比对分析发现其与中华鳖出血性综合征病毒（ＴＳＨＳＶ）同源性为９６．８４％㊂从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中下载动脉炎属病毒和中华鳖其他病毒序列，构建系统进化树㊂结果显示，此次分离病毒与ＴＳＨＳＶ聚为一支（图４）㊂２．４㊀药敏试验㊀９６孔药敏板试验结果（表３）显示，病鳖体内分离的嗜水气单胞菌对恩诺沙星㊁硫酸新霉素和盐酸多西环素３种抗菌药物敏感（ＭＩＣ５０ɤ２μｇ／ｍＬ，ＭＩＣ９０ɤ４μｇ／ｍＬ），而对氟苯尼考㊁甲砜霉素㊁磺胺间甲氧嘧啶钠和磺胺甲噁唑／甲氧苄啶４种抗菌药物耐受（ＭＩＣ５０ȡ１２８μｇ／ｍＬ，ＭＩＣ９０ȡ１２８μｇ／ｍＬ）㊂图２㊀病鳖优势菌的分离与纯化Ｆｉｇ．２㊀ＴｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｃｏｌｏｎｉｅｓｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ表２㊀病原菌生理生化特性Ｔａｂｌｅ２㊀Ｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａ序号Ｎｏ．理化项目Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｔｅｍｓ结果Ｒｅｓｕｌｔｓ序号Ｎｏ．理化项目Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｔｅｍｓ结果Ｒｅｓｕｌｔｓ１丙氨酸－苯丙氨酸－脯氨酸芳胺酶＋２５蔗糖＋２侧金盏花醇－２６Ｄ－塔格糖－３吡咯烷基芳胺酶－２７Ｄ－海藻糖＋４Ｌ－阿拉伯醇－２８柠檬酸盐－５Ｄ－纤维二糖－２９丙二酸盐－６β－半乳糖苷酶＋３０５－酮－葡萄糖苷－７硫化氢产生－３１乳酸盐产碱＋８β－Ｎ－乙酰葡萄糖苷酶＋３２α－葡萄糖－９谷氨酰芳胺酶－３３琥珀酸盐产碱＋１０Ｄ－葡萄糖＋３４Ｎ－乙酰－β－半乳糖胺酶－１１γ－谷氨酰转移酶－３５α－半乳糖苷酶－１２葡萄糖发酵＋３６磷酸酶－１３β－葡萄糖苷酶－３７氨基乙酰芳胺酶－１４Ｄ－麦芽糖＋３８鸟氨酸脱羧酶－１５Ｄ－甘露醇＋３９赖氨酸脱羧酶－１６Ｄ－甘露糖＋４０组氨酸同化－１７β－木糖苷酶－４１香豆酸＋１８β－丙氨酸芳胺酶－４２β－葡糖苷酸酶－１９Ｌ－脯氨酸芳胺酶＋４３Ｏ／１２９耐受＋２０脂酶＋４４谷氨酸－甘氨酸－精氨酸芳胺酶＋２１古老糖＋４５Ｌ－苹果酸盐同化－２２酪氨酸芳胺酶＋４６埃尔曼反应＋２３尿素酶－４７Ｌ－乳酸盐同化－２４Ｄ－山梨醇－２．５㊀回归感染后中华鳖累计死亡率㊀从图５可以看出，出血性综合征病毒人工感染中华鳖２ｄ内未出现明显死亡，３ｄ后死亡率明显增加，感染第６天试验组中华鳖全部死亡，对照组中华鳖均未死亡㊂经解剖发现，试验组中华鳖出现腹腔血水㊁腮出血㊁肝脏发黑㊁肠道红肿等症状㊂感染后中华鳖肝㊁脾㊁肾等组织ＴＳＨＳＶ检测呈阳性㊂㊀㊀嗜水气单胞菌人工感染中华鳖第２天开始出现死亡，此后死亡率明显增加，感染第６天试验组中华鳖累计死亡率高达６０％，对照组中华鳖均未出现死亡（图６）㊂经解剖发现，试验组中华鳖出现肝脏发黑㊁肠道红肿㊁腹腔血水等主要症状㊂从感染中华鳖腮腺㊁肝㊁脾㊁肾分离的细菌经鉴定为嗜水气单胞菌㊂４８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年注：Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｌ１．肝；Ｌ２．肾；Ｌ３．脾㊂Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｌ１．Ｌｉｖｅｒ；Ｌ２．Ｋｉｄｎｅｙ；Ｌ３．Ｓｐｌｅｅｎ．图３㊀患病中华鳖不同组织病毒ＰＣＲ扩增片段琼脂糖凝胶电泳结果Ｆｉｇ．３㊀ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｄＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ３㊀讨论中华鳖出血性综合征病毒（ＴＳＨＳＶ）能引起中华鳖腮腺红肿㊁内脏器官病变和全身性出血，是一种感染性强㊁致死率高的动脉炎病毒［１６］㊂其典型临床症状为腮腺糜烂红肿，肝脏组织肿大质脆㊁点状严重充血，肠道红肿出血㊂２０１５年，中华鳖出血性综合征病毒序列首次被浙江省淡水水产研究所刘莉团队报道［１４］，随后感染该病毒中华鳖的组织病理学特征［１７］㊁组织差异蛋白质组学和腮腺差异转录组学被逐一分析研究［７，９］㊂同时，丁军等［１８］利用光镜和电子显微镜观察海龟肝脏和肾脏的组织病理学特征，结果与中华鳖出血性综合征病毒感染相似，说明海龟也存在被该病毒感染的潜在可能㊂上述报道为中华鳖出血性综合征病毒感染特性研究提供了有力参考，近年来学者们对该病毒的关注度有所提高㊂㊀㊀气单胞菌属是一类革兰氏阴性条件致病菌，广泛存在于自然界中，可引起水生动物出现溃疡㊁疥疮㊁败血等病症，并能在一定条件下导致人急性肠炎乃至严重的腹膜炎以及骨髓炎等［１９］㊂常见致病气单胞菌包括嗜水气单胞菌㊁温和气图４㊀患病中华鳖病毒分离株系统进化树分析Ｆｉｇ．４㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｖｉｒｕｓｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ表３㊀８种渔用抗菌药物对中华鳖嗜水气单胞菌的ＭＩＣ值Ｔａｂｌｅ３㊀ＭＩＣｖａｌｕｅｓｏｆｅｉｇｈｔｋｉｎｄｓｏｆａｑｕａｔｉｃａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｄｒｕｇｓｆｏｒｆｉｓｈｅｒｉｅｓｏｎＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｆｒｏｍＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ单位：μｇ／ｍＬ组织Ｔｉｓｓｕｅｓ恩诺沙星Ｅｎｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ硫酸新霉素Ｎｅｏｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅ甲砜霉素Ｔｈｉａｍｐｈｅｎｉｎｅ氟苯尼考Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ盐酸多西环素Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ氟甲喹Ｆｌｕｍｅｑｕｉｎｅ磺胺间甲氧嘧啶钠Ｓｕｌｆａｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｉｎｅｓｏｄｉｕｍ磺胺甲噁唑／甲氧苄啶Ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ／ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ腮腺Ｐａｒｏｔｉｄ０．５００１．０５１２６４０．５１６．０００１０２４３０４／１６肝Ｌｉｖｅｒ０．０３００．５５１２１２８２．００．１２５１０２４３０４／１６脾Ｓｐｌｅｅｎ０．０６００．５５１２１２８２．００．１２５１０２４１９／１肾Ｋｉｄｎｅｙ０．１２５０．５５１２１２８１．００．１２５１６７６／４肠Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ０．１２５０．５５１２１２８４．００．１２５１０２４３０４／１６ＭＩＣ５００．１２５０．５５１２１２８２．００．１２５１０２４３０４／１６ＭＩＣ９００．５００１．０５１２１２８４．０１６．０００１０２４３０４／１６单胞菌㊁维氏气单胞菌等，可感染草鱼㊁鲆鲽类㊁中华绒螯蟹等多种常见水产经济品种［２０－２２］，也能引起中华鳖多种病症，包括鳖红脖子病㊁腮腺炎㊁白底板㊁红底板㊁出血性肠道坏死症㊁腐皮病等［２３］㊂根据疾病流行病学特征，笔者对此次患病中华鳖分别开展病毒和细菌检测，结果同时鉴定到中华鳖出血性综合征病毒和嗜水气单胞菌，并分别进行了回归感染试验，由此确定此例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与中华鳖出血性综合征５８５１卷１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀周秀娟等㊀一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治病毒混合感染所引起㊂此病例发病时间为５月底至６月，也是中华鳖腮腺炎的主要流行季节［２４］，此时养殖水温为２６３０ħ，适宜病毒和病原菌的快速生长㊂过高的养殖密度和不适宜的饲料投喂量引起水体中饵料残渣和粪便的过度富集，势必导致水质变差，另外也会营造病原滋生的温床㊂加上高温状态下中华鳖机体免疫力也会下降，会致使感染加剧㊂因此，病毒和细菌的混合感染往往是造成养殖动物高致死率的主要原因㊂图５㊀出血性综合征病毒人工回归感染中华鳖累计死亡率Ｆｉｇ．５㊀ＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｏｆＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＴＳＨＳＶ图６㊀嗜水气单胞菌人工回归感染中华鳖累计死亡率Ｆｉｇ．６㊀ＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｏｆＴ．ｓｉｎｅｎｓｉｓａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ㊀㊀目前，未有针对中华鳖出血性综合征的特效治疗药物，该病防控的核心原则仍是防重于治㊂必须从优质苗种㊁水质调控㊁合理密度㊁日常管理等方面做到防病于未然，在疾病高发季节，合理使用国家批准使用的含氯石灰等消毒药物对水体定时消杀；同时也可从推广稻鳖共生虾鳖混养［２５－２６］等生态养殖模式㊁优化中华鳖养殖环境方面入手，减少病毒病的暴发㊂一旦发病，应首先确诊病原，及时捞出病死鳖㊁彻底消毒；若发现伴有细菌感染，应严格依据药敏试验结果，选择抗菌效果好的抗菌药物进行治疗，使用国家批准的中草药和维生素Ｃ等制剂拌饲投喂，对患病动物进行免疫调理，以降低死亡率㊁减少损失㊂参考文献［１］ＣＨＥＮＪ，ＺＨＵＮＹ，ＫＯＮＧＬ，ｅｔａｌ．ＦｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｅｄｆａｔａｌＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ⁃ｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＣｈｉｎｅｓｅｓｏｆｔ⁃ｓｈｅｌｌｅｄｔｕｒｔｌｅｓ（Ｔｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓ）［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌ⁃ｔｕｒｅ，２０１４，４２８／４２９：１６－２０．［２］王培潮．中国的龟鳖［Ｍ］．上海：华东师范大学出版社，２０００．［３］占秀安，许梓荣，钱利纯．中华鳖肉脂品质的研究［Ｊ］．浙江大学学报（农业与生命科学版），２０００，２６（４）：４５７－４６０．［４］张丹，王锡昌，刘源．中华鳖营养㊁风味及功能特性研究进展［Ｊ］．食品工业科技，２０１３，３４（２４）：３９２－３９５．［５］赵春光．浙江省甲鱼产业发展现状和前景［Ｊ］．科学养鱼，２０１５（１）：１－２．［６］丁晓明．中华鳖养殖生产形势及对策［Ｊ］．中国水产，２０００（１）：１２．［７］ＬＹＵＳＪ，ＹＵＡＮＸＭ，ＺＨＡＮＧＨＱ，ｅｔａｌ．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅｓｏｆｔ⁃ｓｈｅｌｌｔｕｒｔｌｅｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＴｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓＨｅｍ⁃ｏｒｒｈａｇｉｃＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２０，９８：６５３－６６０．［８］ＣＨＥＮＭＪ，ＬＩＤＦ，ＦＡＮＧＪ，ｅｔａｌ．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｍｅｄｉａｔｅｓｓｏｆｔ⁃ｓｈｅｌｌｅｄｔｕｒ⁃ｔｌｅｓｙｓｔｅｍｉｃｓｅｐｔｉｃｅｍｉａｓｐｈｅｒｉｃａｌｖｉｒｕｓ（ＳＴＳＳＳＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌ⁃ｔｕｒｅ，２０１７，４７３：５０１－５０７．［９］ＬＩＵＬ，ＣＡＯＺ，ＬＩＮＦ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｃａｕｓｅｄｂｙＴｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＴＳＨＳＶ）ａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏ⁃ｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｉｎＴＳＨＳＶ⁃ｉｎｆｅｃｔｅｄＣｈｉｎｅｓｅｓｏｆｔ⁃ｓｈｅｌｌｅｄｔｕｒ⁃ｔｌｅｓ（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１７，６０（１／２）：１９－２７．［１０］张奇亚，李正秋，江育林，等．中华鳖病毒病原的发现［Ｊ］．科学通报，１９９６，４１（２１）：１９８７－１９９０．［１１］张奇正，李正秋，胡峻．中华鳖病毒的血清学检测［Ｊ］．水生生物学报，２０００，２４（４）：３５６－３６１．［１２］林锋，刘莉，曹铮，等．鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定［Ｊ］．湖北农业科学，２０１４，５３（２２）：５４８７－５４８９．［１３］孙佩芳，蔡完其．中华鳖温和气单胞菌病的病原研究［Ｊ］．淡水渔业，１９９８，２８（４）：３－５．［１４］ＬＩＵＬ，ＣＡＯＺ，ＬＩＮＦ，ｅｔａｌ．ＰａｒｔｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎｏｖｅｌｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＰｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１５，５８（４）：１９７－２０４．［１５］范万红，刘荭，吕建强，等．蛙病毒属ＰＣＲ检测方法的建立及其在甲鱼红脖子病病原鉴定中的应用［Ｊ］．检验检疫科学，２００７，１７（Ｚ１）：６－９．［１６］ＬＹＵＳＪ，ＹＵＡＮＸＭ，ＺＨＡＮＧＨＱ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｅｗｌｅｔｈａｌａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ，Ｔｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＴＳＨＳＶ），ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍａｎｉｎｆｅｃｔｅｄＣｈｉｎｅｓｅｓｏｆｔｓｈｅｌｌｔｕｒｔｌｅ［Ｊ］．Ａｒ⁃ｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１９，１６４（１０）：２５９３－２５９７．［１７］陈铭，潘延乐，伍洋，等．中华鳖虹彩病毒感染的临床病理学观察［Ｊ］．畜牧兽医科学，２０１８（１）：１９－２０．［１８］丁军，覃辉．海龟常见疾病救治方法探讨［Ｃ］／／首届两岸三地水族馆发展论坛论文集．北京：中国野生动物保护协会，２０１４：２２７－２３０．［１９］ＳＴＲＡＴＥＶＤ，ＯＤＥＹＥＭＩＯＡ．ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙ⁃ｄｒｏｐｈｉｌａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｏｏｄｓｏｕｒｃｅｓ：Ａｍｉｎｉ⁃ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ，２０１６，９（５）：５３５－５４４．［２０］ＳＡＬＥＨＡ，ＥＬＫＥＮＡＮＹＲ，ＹＯＵＮＩＳＧ．Ｖｉｒｕｌｅｎｔａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉ⁃ａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄｎｉｌｅｔｉｌａｐｉａｆｉｓｈ（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）ｉｎＥｇｙｐｔｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｓｏｍｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅ⁃ａｓｓｏ⁃ｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｓｃｉｅｎｃｅ，２０２１，２６（３）：１６７－１７６．［２１］ＮＡＹＡＫＳＫ．Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｓｐｅｃｔｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｆｉｓｈｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐ⁃ｍｅｎｔｉｎＩｎｄｉａｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｔｏＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２０，１００：２８３－２９９．［２２］ＪＵＮＩＯＲＧＢ，ＤＥＦＲＥＩＴＡＳＳＯＵＺＡＣ，ＤＥＳＣＯＶＩＳＮ，ｅｔａｌ．Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｓｉｌｖｅｒｃａｔｆｉｓｈｃａｕｓｅｓｈｙｐｅｒｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｔｏｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０１９，１３２：２６１－２６５．［２３］梁倩蓉，朱凝瑜，郑晓叶，等．２０１９年浙江省水生动物病原菌耐药情况分析［Ｊ］．安徽农业科学，２０２１，４９（３）：９５－９９．［２４］陈爱平，江育林，钱冬，等．鳖腮腺炎病［Ｊ］．中国水产，２０１２（４）：５３－５４．［２５］中华人民共和国农业农村部．稻渔综合种养技术规范第５部分稻鳖：ＳＣ／Ｔ１１３５．５２０２０［Ｓ］．北京：中国农业出版社，２０２０．［２６］张希根，陆立刚，陈明方．南美白对虾㊁中华鳖生态混养模式试验示范与推广［Ｊ］．科学养鱼，２０１５（８）：２５－２６．６８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年。

中华鳖不同地理群体遗传多样性研究的开题报告

中华鳖不同地理群体遗传多样性研究的开题报告一、研究背景中华鳖是中国特有的淡水龟种类，广泛分布于中国南方及东南亚地区。

中华鳖是重要的经济作物，也是重要的宠物和动物实验材料。

然而，受到生境破坏、过度捕捞和非法贸易等多因素影响，中华鳖已被列为濒危物种。

针对中华鳖的保护和管理工作，需要深入了解中华鳖不同地理群体的遗传多样性及遗传结构，以指导科学合理地进行中华鳖的保护和管理策略。

因此，本研究拟开展中华鳖不同地理群体遗传多样性研究。

二、研究目的本研究旨在通过分析中华鳖不同地理群体遗传多样性和遗传结构，探究中华鳖种群演化和地理分布格局，提供科学依据和参考，为中华鳖的保护和管理工作提供支持。

三、研究内容和方法1.采样和数据处理从中国南方及东南亚地区采样中华鳖不同地理群体，收集其血液样本进行DNA分析。

利用PCR扩增部分线粒体DNA和微卫星DNA，获取分子标记数据。

随后，利用基因分型技术确定其基因型。

2.遗传多样性和遗传结构分析通过计算和比较中华鳖的遗传多样性参数，例如遗传多样性指数、等位基因丰富度、群体遗传分化指数和基因流指数等，分析中华鳖不同地理群体之间的遗传多样性和遗传差异。

利用聚类分析、主成分分析和遗传分化分析等方法，揭示中华鳖种群的遗传结构和演化关系，探讨不同地理群体的遗传联系和地理分布格局。

四、研究意义本研究对于加深对中华鳖种群的认识，了解其种群演化、地理分布和遗传多样性具有重要的理论和现实意义，有助于：1）为中华鳖的保护和管理提供科学依据和参考；2）丰富中华鳖的生物学知识，促进其资源的合理利用和可持续发展；3）提供中华鳖物种保护和人类社会可持续发展的科学理论和实践案例。

中华鳖常见疾病的综合防治技术—传染性鳖病的综合防治技术

Ø 主要危害稚、幼鳖。
02 鳃腺炎
4. 综合防治技术
（1）预防措施 ① 改有沙养殖为无沙养殖。 ② 投喂新鲜饵料，增强免疫力。 ③ 隔离发病鳖后，用10mg/L的漂白粉彻底清池
。
02 鳃腺炎
4. 综合防治技术
（2）治疗方法
①用50~100毫克/升的福尔马林进行浸浴，两小时后换水，再用水体浓度为2毫克/升的漂白粉或1毫克 /升的强氯精遍洒。
03 赤斑病
3. 流行与危害
（1）流行该病常在20℃以上时流行，四月中下旬发作，5月
到6月为高峰期。（2）危害
主要危害亲鳖、成鳖及幼鳖为主要患病群体，发病率较高，死亡率可以达到30%以上。成鳖，幼鳖较少。
03 赤斑病
4. 综合防治技术
1. 预防措施
水体定期消毒，溶氧充足，避免鳖体受伤，维生素补充及时。
（2）治疗
①用3~4%食盐水浸浴病鳖5分钟。 ②每用于 4~5 亩鳖池用200mL水霉净全池泼洒，每天泼洒 1 次，连用2~3 次。
01 红脖子病
4. 综合防治技术
（2）治疗方法
①隔离病鳖。选用庆大霉素、卡那霉素、链霉素等，注射量为20万单位/千克鳖重，轻者1次可治愈；重者需注射2~3次。
②用3~4mg/L的漂白粉泼洒，连续2次，隔天1次。 ③投喂药饲。可采用土霉素或磺胺类药物，按每千克鳖体重0.2克投喂，第2~6天减半。
04 水霉病
3. 流行与危害
（1）一年四季均可发生，尤其在春末夏初或秋季最为流行，适宜发病水温为13~19℃ 。
（2）主要危害受伤的鳖。
04 水霉病
4. 综合防治技术
（1）防治措施 ①操作规范
在放养和分池时操作要规范，轻抓轻放；运输时要对成鳖采用成鳖布袋装运，稚鳖和种鳖采用内装浮萍或水草的竹篓或塑料筐装运，防止鳖体受伤。

鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定作者：林锋，刘莉，曹铮，等来源：《湖北农业科学》 2014年第22期林锋，刘莉，曹铮，叶雪平，郝贵杰，盛鹏程（浙江省淡水水产研究所／农业部淡水健康养殖重点实验室，浙江湖州３１３００１）摘要：从患病中华鳖（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）肺组织中分离到优势菌１株，进行了表型特征分析和１６ＳｒＤＮＡ序列测定。

结果表明，该菌为气单胞菌属的嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ），通过对健康中华鳖进行人工感染，发现该菌具有致病性；选取２０种常规药敏试纸进行药敏试验，结果表明，该嗜水气单胞菌对庆大霉素、头孢他啶、头孢西丁、链霉素、呋喃妥因敏感，对诺氟沙星、红霉素、阿米卡星、环丙沙星中敏，对其他１１种抗生素具有耐药性。

关键词：鳖（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）；嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）；１６ＳｒＤＮＡ；药敏试验中图分类号：Ｓ９４３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０14）22－5487-03ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１４．２２．０40收稿日期：２０１４－０５－２９基金项目：浙江省科技厅项目（２００９Ｃ１２０５６）；浙江省淡水养殖科技创新团队项目（２０１２Ｒ１００２６－１１）作者简介：林锋（１９８０－），男，安徽宁国人，助理研究员，硕士，主要从事水产病原微生物研究，（电话）０５７２－２０４１４０３（电子信箱）ｗｗｌｉｎｆｅｎｇ＠１６３．ｃｏｍ；通讯作者，刘莉，副研究员，主要从事水产动物病害防治研究，（电子信箱）ｌｉｕｌｉ６６５５＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。

嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）属于弧菌科气单胞菌属，是一种条件性致病菌，广泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，对水产动物、畜禽和人类均有致病性［１］。

嗜水气单胞菌作为淡水养殖动物重要的病原菌之一，目前已确定淡水鱼类细菌性败血症、鳖“红底板”病等多种病害是由其所导致的［２，３］，给水产养殖业造成极大的经济损失。

一株中华鳖源维氏气单胞菌的分离鉴定及抗性研究

一株中华鳖源维氏气单胞菌的分离鉴定及抗性研究作者：刘晓丽王恬畅蒋红艳殷蕊宫春光来源：《河北渔业》2023年第11期摘要：自保定阜平患病中华鳖（Pelodiscus sinensis）体内分离获得一株革兰氏阴性菌，对其形态特征、生理生化特性及１６ＳｒＤＮＡ序列进行分析，鉴定其为维氏气单胞菌（Aeromonas veroni）；对分离菌株进行了29种抗菌药的药敏试验和15株益生菌的拮抗实验，得出此分离菌株对阿米卡星、头孢呋辛钠、左氧氟沙星、诺氟沙星、头孢曲松、头孢哌酮、环丙沙星和头孢他啶等8种药物高度敏感，对青霉素、苯唑西林、庆大霉素、万古霉素、氨苄西林等其它17种药物表现为不同程度的耐药性；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2种益生菌在一定浓度下对其具有拮抗作用。

关键词：中华鳖（Pelodiscus sinensis）；维氏气单胞菌（Aeromonas veroni）；分离鉴定；药敏试验；拮抗试验中华鳖（Pelodiscus sinensis）又名水鱼、甲鱼、团鱼，因其味道鲜美，蛋白质含量丰富，而且又有很高的药用价值，是自古以来受到人们青睐的滋补佳品。

中华鳖自上世纪七十年代末开始进行人工养殖，是一种经济价值很高的淡水养殖品种。

随着居民消费升级，中华鳖的需求逐年增加，集约化养殖规模也在不断扩大，随之而来的病害问题也越发严重，其中细菌性疾病尤为严重。

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）隶属于气单胞菌属（Aeromonas），是一种能引起人-畜-水生动物共患病的病原菌[1-3]。

本研究对一例患病的中华鳖进行了病原菌的分离鉴定，并对分离菌株进行了29种抗菌药的药敏试验和15株益生菌的拮抗试验，旨在为中华鳖细菌性疾病的研究和防控提供参考。

1材料与方法1.1病鳖患病中华鳖来自保定市阜平县某甲鱼养殖场，体重340～500 g。

主要症状：腹部出现大小不一的红色斑块，颈部溃烂，背甲前部有小溃疡口；解剖发现有异味。

中华鳖嗜水气单胞菌微球缓释疫苗的研制及免疫效果

ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｗａｙｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ｓｕｓｔａｉｎｅｄ — ｒｅｌｅａｓｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｖａｃｃｉｎｅｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｅｍｕｌｓｉｏｎ — ｓｏｌｖｅｎｔｄｉｆｆｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｆｔｅｒｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ
，
（河北大学生命科学学院，河北保定
０７１００２）
摘要：为通过免疫防治途径控制嗜水气单胞茵引起的多种中华鳖疾病，采用复乳化一溶剂挥发法制备
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
缓释微球疫苗，通过灌胃方式免疫中华鳖（体质量１５Ｏ～２００ｇ），每只灌胃０．０５ｇ或０．１ｇ，微球含灭活菌约
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｓｕｓｔａｉｎｅｄｒｅｌｅａｓｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｖａｃｃｉｎｅａｎｄｉｔｓｉｍｍｕｎｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ
为６．７５ ×１０／ｇ．免疫应答反应结果显示，缓释微球疫苗体外释放可持续近４０ｄ，血清抗体效价、白细胞吞噬率、白细胞吞噬指数及淋巴细胞转化率最高分别可达５１２，７１．２５，１．５１和７７．２５．结果表明：中华鳖嗜水气单胞菌微球缓释疫苗可以达到注射灭活菌液疫苗的水平，且持续性略优于注射免疫．通过灌胃方式

中华鳖源粘质沙雷氏菌分离、鉴定及药敏特性研究

中华鳖源粘质沙雷氏菌分离、鉴定及药敏特性研究杨移斌;艾晓辉;曹海鹏;杨先乐;姚嘉赟;沈锦玉【摘要】This study was aimed at isolation, identification and antibiotic sensitivity of pathogen from sicked Trionyx sinen-sis.The pathogenic bacteria were isolated and purified from liver, kidney, spleen and ascites of T.sinensis.And the identi-fication of the strain HD01 was conducted, using the biochemical identification and 16S rRNA gene sequence determina-tion, the artificial infection test was performed, antimicrobial susceptibility test was conducted by K-B method.The re-sults showed that strain HD01 was the pathogen of T.sinensis, the LD50of the isolated was counted to 4.48 ×106CFU/g.According to morphological and biochemical characteristics as well as the result of 16S rRNA gene sequence analysis, the isolated strain HD01 was identified as Serratia marcescens.Strain HD01 was susceptible to florfenicol, doxycycline, gentamicin and oxacillin and other 10 kinds of antibiotics.Meanwhile, it showed resistance to penicillin, cefadroxil, neo-mycin and other 4 kinds of antibiotics.The isolated strain HD01 was the pathogenic bacteria to T.sinensis, and the disease can preventing by administering drugs such as florfenicol, gentamicin and doxycycline in fisheries farming.%对患病中华鳖 (Trionyn sinensis) 进行病原分离、鉴定及药敏实验.从患病中华鳖肝、肾、脾及腹水分离纯化病原菌,经理化特性测定及16S rRNA 序列分析对其进行鉴定,开展人工感染试验,并利用K-B进行药敏特性分析.结果显示分离菌株HD01为本次引发中华鳖病害的病原菌,其对中华鳖的LD50为4.48×106CFU/g.HD01株理化特性与粘质沙雷氏菌一致,16S rRNA序列与粘质沙雷氏菌同源性为99%,综合判定分离菌株为粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens).HD01株对氟苯尼考、多西环素、庆大霉素及苯唑西林等14种抗生素高度敏感;对青霉素、头孢拉定、新霉素等7种抗生素耐药.分离菌株HD01是中华鳖病原菌,养殖时可选用氟苯尼考、庆大霉素及多西环素等药物进行防控.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2018(048)001【总页数】6页(P41-46)【关键词】粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens);中华鳖(Trionynsinensis);鉴定;人工感染;药敏特性【作者】杨移斌;艾晓辉;曹海鹏;杨先乐;姚嘉赟;沈锦玉【作者单位】中国水产科学研究院长江水产研究所,武汉430223;中国水产科学研究院长江水产研究所,武汉430223;上海海洋大学,上海201306;上海海洋大学,上海201306;农业部淡水渔业健康养殖重点实验室,浙江省鱼类健康与营养重点实验室,浙江省淡水水产研究所,浙江湖州313001;农业部淡水渔业健康养殖重点实验室,浙江省鱼类健康与营养重点实验室,浙江省淡水水产研究所,浙江湖州313001【正文语种】中文【中图分类】S947中华鳖(Trionyx sinensis)又名甲鱼、水鱼、团鱼等，其分类地位为龟鳖目(Testudines)鳖科(Trionychidae)，鳖属(Trionyx)。

中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验

中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验
沈文英;李卫芬;高研
【期刊名称】《水生生物学报》
【年(卷),期】2010(034)005
【摘要】@@ 中华鳖(Trionyx sinensis)是我国主要淡水养殖名优品种之一.但随着中华鳖养殖规模的扩大和集约化程度的提高,导致鳖病爆发流行,阻碍了养鳖业的进一步发展.迄今为止,研究发现的鳖病共约40余种,其中以中华鳖(兯)疮穿孔病、腐皮病、白底板病、肠道坏死症及细菌性肝水肿病为主要病害[1,2],主要由嗜水气单胞菌属于弧菌科气单胞菌感染引起[3-5].
【总页数】5页(P1060-1064)
【作者】沈文英;李卫芬;高研
【作者单位】绍兴文理学院生命科学学院,绍兴312000;浙江大学动物科学学院饲料研究所,杭州310029;浙江大学动物科学学院饲料研究所,杭州310029;浙江大学动物科学学院饲料研究所,杭州310029
【正文语种】中文
【中图分类】S947.1
【相关文献】
1.鲟病原性温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验 [J], 肖艳翼;王斌;夏永涛;胡利静;胡鲲;杨先乐;
2.鲟病原性温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验 [J], 肖艳翼;王斌;夏永涛;胡利静;
胡鲲;杨先乐
3.中华绒螯蟹点状产气单胞菌的分离鉴定与药敏试验 [J], 曹海鹏;温乐夫;白金尊;张帆;何珊
4.中华鳖致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验 [J], 冷闯;邓舜洲;张文波;蒋新华;李露;余根莲
5.中华条颈龟致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验 [J], 方振华; 曾玉梅; 洪美玲; 丁利
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中华鳖的性别决定机制

取性成熟雄性中华鳖 2 只 ,解剖取出睾丸. 精母细胞联会复合体的制备参考文献[12 ] , 硝酸银染色 ,在清水中漂浮带有细胞的 Falcon 膜. 将膜置于光学显微镜下观察 ,寻找 SC 形态清晰的区域. 放上铜网 ,置电镜下观察 (电压 750 kV) ,拍照. 1. 5 中华鳖 S ox 基因的 PCR 扩增
应用与环境生物学报 2001 ,7 (3) :258～261 Chin J Appl Envi ron Biol = ISSN 1006 - 687X
2001206225
பைடு நூலகம்
中华鳖的性别决定机制 3
聂刘旺 3 3 郭超文汪鸣王千
(安徽师范大学生命科学学院芜湖 241000)
CLC Q959. 630. 8
SEX DETERMINATION MECHANISM OF TRION YX SIN ENSIS 3
N IE Liuwang 3 3 , GUO Chaowen , WAN G Ming & WAN G Qian
( L if e Science College of A nhui Norm al university , Wuhu 241000 ,China)
水 ,维持沙中含水量. 孵化的温度设置为 35 ℃±0. 5 ℃,
33 ℃±0. 5 ℃,31 ℃±0. 5 ℃,29 ℃±0. 5 ℃,27 ℃±0. 5 ℃ 2 结果
和 24 ℃±0. 5 ℃等 6 个条件 ,恒温孵化至仔鳖出壳.
2. 1 中华鳖卵不同温度孵化结果
仔鳖出生后 ,立即转移至 25 ℃恒温生化培养箱中饲养 ,3～4 个月后 ,仔鳖体重达 20～40 g ,此时进行性别观察. 性别判断依据第二性征和解剖学特征确定[8 ] . 1. 3 中华鳖染色体 G2带研究

中华鳖“腐皮病”的病原菌研究_维罗纳气单胞菌温和生物变种论文-By_gnksguybb

中华鳖“腐皮病”的病原菌研究_维罗纳气单胞菌温和生物变种
论文摘要：对浙江某养殖场患“腐皮病”的中华鳖进行了病原菌分离，分离到2株细菌（编号为040908-1和040908-2）。经人工感染试验证明，这2株细菌都是引起该病的病原菌。分别采取传统细菌生理生化鉴定方法以及全自动细菌鉴定仪VITEK-32对这2株细菌进行了鉴定，结果均表明菌株040908-1为普通变形菌（Proteus vulgaris），而菌株040908-2为维罗纳气单胞菌温和生物变种[U1] (Aeromonas veronii biovar sobria)。研究了27种药物对这2株细菌的药敏试验，结果显示，妥布霉素、新霉素、奥复欣、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素等6种药物对这2株细菌均有良好的抑制作用，氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素等4种药物仅能有效抑制菌株040908-1的生长，而复方新诺明仅对菌株040908-2有显著的抑制作用。论文关键词：中华鳖,腐皮病,普通变形菌,维罗纳气单胞菌温和生物变种中华鳖是浙江省四大水产养殖主导品种之一，据统计，2008年全省养殖鳖产量达到103960吨。随着浙江省中华鳖养殖的快速发展和集约化程度的不断提高，中华鳖发病日趋增多，给养殖业带来巨大的经济损失。“腐皮病”是中华鳖养殖过程中的主要病害之一，[U3]发病范围广，持续时间长，对浙江省中华鳖养殖产业造成了严重的损失。本文对我省中华鳖“腐皮病”的病原进行了初步分离研究。 1材料与方法 1.1材料病鳖取自浙江德清某养殖场，活力差，四肢、颈部、背甲及裙边均有皮肤溃烂病灶；健康鳖取自浙江萧山某养殖场。 1.2病原菌分离取症状典型的病鳖，无菌条件下从病鳖肝、肾、脾等组织取样，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28C恒温培养24h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行克隆培养，共分离到040908-1、040908-2两株细菌，转接斜面保存备用

中华鳖源奇异变形杆菌的分离鉴定与致病性研究

中华鳖源奇异变形杆菌的分离鉴定与致病性研究林亚歌;叶键;石婷婷;宋阳;王玉凤;章晓栋【摘要】One bacterium was isolated from liver and ascites of diseased Chinese soft‐shelled turtle (Pelo‐discus sinensis ) ,outbreaked in a large‐scale breeding farm in Shangyu ,and identified as Proteus mirabilis , named SX37 through API ID32E by 16S rRNA sequencing , and biochemical reactions . Healthy soft‐shelled turtle was experimentally infected with the bacterial suspension ,and then the same bacterium was recovered with different clinic sydromes .Isolate SX43 demonstrated virulence potential in mouse models , with the median lethal dose (LD50 ) of 1 × 107 .83 cfu/mL in mice .%从患典型鳃腺炎病中华鳖肝脏和腹水处进行细菌接种，分离获得一株细菌。

综合梅里埃细菌生化鉴定系统和16S rRNA序列进化分析，判断所分离菌株为奇异变形杆菌（SX37）。

动物回归试验显示，该分离菌株能够引起幼鳖发病死亡，并且能够从试验幼鳖体内再次分离到相同的病原菌。

但临床症状与病理解剖结果与自然发病症状不一致，显示该菌株不是中华鳖鳃腺炎病病原，而是继发病原。

嗜水气单胞菌分离鉴定与药敏试验

嗜水气单胞菌分离鉴定与药敏试验王帅兵;熊良伟;朱善元;徐建生;吴海波;王婧;张龙【摘要】从江苏、上海不同发病水生动物中分离细菌,经细菌形态特征、生化反应、毒力因子检测及回归感染试验鉴定,结果与标准菌株一致,获得4株致病性嗜水气单胞菌.药敏试验表明,标准菌株及4个分离菌株对阿米卡星、左氧氟沙星和氟苯尼考均表现出高度敏感性,对氨苄西林、阿莫西林、红霉素和四环素耐药,对阿奇霉素、链霉素、庆大霉素、多西环素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明的敏感性表现不尽相同,对链霉素、庆大霉素总体表现敏感,对阿奇霉素、多西环素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明存在一定的耐药性.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2017(045)024【总页数】4页(P165-168)【关键词】嗜水气单胞菌;不同来源;致病性;药敏试验【作者】王帅兵;熊良伟;朱善元;徐建生;吴海波;王婧;张龙【作者单位】江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州225300;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300【正文语种】中文【中图分类】S182嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是广泛存在于水体中的一种正常共栖菌，有致病菌和非致病菌之分。

致病性嗜水气单胞菌是水生动物细菌性疾病的主要病原之一，可引起鱼、蛙、鳖等水生动物出血性败血症[1]。

近年来，该病在我国各地广泛流行，大规模暴发，死亡率高，给水产养殖业造成巨大经济损失。

使用抗菌药是目前防治水生动物细菌性疾病的主要手段。

然而，大量研究证明，嗜水气单胞菌已对多种药物产生耐药性[2-3]，给水生动物疾病防治带来困难。

一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒[发明专利]

专利名称：一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：袁雪梅,刘莉,吕孙建,张海琪
申请号：CN202011176933.8
申请日：20201029
公开号：CN112094854A
公开日：
20201218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒，属于生物检测技术领域。

本发明通过收集病鳖组织样本，进行病原分析，证明引发该病的病原为一种病毒。

采用RACE技术获得病毒的部分序列后，针对性的设计了特异性检测该病毒的引物组、探针及试剂盒，提供了灵敏、特异、快速检测中华鳖黄病毒的方法，填补了目前尚无中华鳖黄病毒检测方法的空白，适合中华鳖黄病毒病的确诊、筛查和预防。

本发明将为苗种检疫提供技术支撑，为从源头上切断病毒传播提供工具，有利于中华鳖养殖产业的绿色可持续发展。

申请人：浙江省淡水水产研究所,浙江省农业科学院
地址：313001 浙江省湖州市吴兴区杭长桥南路999号
国籍：CN
代理机构：北京盛询知识产权代理有限公司
代理人：刘静
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嗜水气单胞菌

嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌，人，胃肠炎一、水产动物嗜水气单胞菌感染1、鱼类引起多种淡水鱼类发生相应的细菌性败血症，在不同的文献中常根据病症将其称为溶血性腹水病、爆发病、出血病、腹水病、出血性腹水病和出血性疾病等;危害鱼的年龄范围最大，流行地区最广，危害鱼水域类别最多，造成的损失最大的一种鱼类细菌性病害。

该病害在早期及急性感染时，综合病症一般表现为病鱼的上下颌、口腔、鳃盖、眼睛、鳍基及鱼类两侧轻度充血，严重时病鱼体表严重充血甚至出血、眼眶周围也充血(尤以鲢、鳙为甚)、眼球突出、肛门红肿，腹部膨大、腹腔内积有淡黄色透明或红色混浊腹水;鳃、肝脏、肾脏的颜色均较淡，且肝、肾常呈花斑状，病鱼严重贫血，肝脏、脾脏、肾脏肿大，脾脏常呈紫黑色;胆囊大、肠系膜、腹膜及肠壁充血，肠内没有食物、常有较多粘液，有的肠腔内积水或有气体、肠管被胀得较粗，有的病鱼鳞片竖起、肌肉充血、鳔壁充血、鳃丝末端腐烂。

病情严重的鱼，还出现厌食或不食，静止不动或发生阵发性乱游、乱窜，有的在池边摩擦，最后衰竭死亡。

陈翠珍等(1998、1999)分别研究报道了由嗜水气单胞菌引起的鲤体表出血感染症，由嗜水气单胞菌单独或与温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌混合感染引起的草鱼肠炎。

鲤体表出血感染症病鱼的主要病变为在鳞片上有点状或片状出血，刮取时可见出血常与体表粘液混合在一起形成红色粘胶状物、也见有充血迹象，多数鳞囊有同样的出血或充血现象亩多位于体侧散在出现;鳞囊下皮肤与肌层缺乏明显眼观病变，病变严重处在鳞囊下实质脏器无明显异常。

草鱼肠炎病例为2龄草鱼，病鱼离群独游，游动缓慢，食欲减退，有的基本不摄食，体表色泽变黑、尤以头部明显;病死鱼腹部膨胀且有红色斑块，肛门红肿突出;剖检可见病鱼腹腔积水，肠壁充血、发炎，肠内有许多淡黄色黏液。

王肇赣等(1985)报道了由嗜水气单胞菌引起的尼罗罗非鱼腐皮病，病鱼体表腐烂，可引起病鱼大量死亡。

在鳗鲡，陈会波等(1992)报道了由嗜水气单胞菌所引起的鳗鲡赤鳍病，主要症状为各鳍部明显充血，肛门红肿，体表充血(尤以腹部明显)，背部及两侧体表呈斑纹状，剖检可见胃肠红肿充血，肝脏局部淤血，部分鱼胆汁溢出胆囊;郑国兴(1999)报道了由嗜水气单胞菌引起的欧洲鳗皮肤溃疡，主要症状是厌食、反应迟钝，游动无力、偶尔窜至水面侧身作间隙性狂游，下颌处出现白色斑块、充血或溃疡穿孔，死后体僵直、头上扬、嘴张开。