1基因工程发展史

实践证明，利用重组DNA技术，可以对不同生物的基因进行新的组合，得到性状发生改变的新生物。

这意味着人类可以根据自己的意愿设计新的生物，并把它构建出来。

人的创造性有一次性得到生动的体现。

从此，生物科学完全超越了经验科学的阶段，第一次具备了工程学科的性质，以至于我们今天把基于重组DNA技术的新的学科分支，称为目前众所周知的“基因工程”。

第一节基因工程的诞生与发展一、基因工程的定义基因工程（Gene engineering）原称遗传工程（Genetic engineering）。

从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状甚至创造新的物种。

因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因。

除了少数RNA病毒外，几乎所有生物的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程亦称为重组DNA技术（DNA recombination technique）。

另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖（Molecular cloning）。

广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。

因此，广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。

二、基因工程诞生的理论基础（一）DNA是遗传物质1944年，Avery进行的肺炎双球菌转化实验，证明了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质；1952年，Alfred Hershy和Marsha Chase通过噬菌体转染实验证明了遗传物质是DNA。

（二）DNA双螺旋结构和半保留复制1953年，James D. Watson和Francis H.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。

（三）中心法则和遗传密码1957，Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”；1964年，Marshall Nirenberg和Gobind Khorana破译了64个遗传密码子。

（四）不同基因具有相同的物质基础所有生物的DNA的基本结构是相同的。

因此，不同生物的基因（染色体上具有遗传功能的特定核苷酸序列或DNA片段）是可以重组互换的。

少数RNA病毒的RNA可通过反转录产生cDNA，不影响基因的重组和互换。

（五）基因是可以切割的除少数基因重叠排列外，大多数基因之间有间隔序列，可以从DNA分子上切割下来。

重叠排列的基因也可以切割，只不过是破坏了其它基因。

（六）基因是可以转移和重组的生物体内的某些基因可以移动，甚至可以在不同的染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子中去。

（七）遗传密码是通用的（八）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代三、基因工程诞生的技术突破（一）琼脂糖凝胶电泳1960s，发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。

(二)DNA连接酶（ligase）1967年，有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。

（三）限制性核酸内切酶（restriction enzymes）的发现和应用1970年，H．O．Smith等人分离出第一种限制性核酸内切酶。

（四）载体1972年前后，使用小分子量的细菌质粒和λ噬菌体作载体。

四、基因工程的诞生1972年，美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40 DNA、l 噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。

翌年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。

正如Cohen在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有可能使大肠杆菌具备其它生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能，如光合反应和抗生素合成等。

出人意料的是，当时科学界对这项新技术诞生的第一个反应便是应当禁止有关实验的继续开展，其严厉程度远大于今天人们对人体克隆的关注。

包括Cohen 本人在内的分子生物学家们都担心，两种不同生物的基因重组有可能为自然界创造出一个不可预知的危险物种，致使人类遭受灭顶之灾。

于是，1975年西欧几个国家签署公约，限制基因重组的实验规模。

第二年美国政府也制订了相应的法规。

至今世界上仍有少数国家坚持对基因重组技术的使用范围进行严格的限制。

然而，分子生物学家们毕竟不愿看到先进的科学技术葬送在自己手中。

从1972年到1976年短短的四年里，人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包括噬菌体DNA载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，同时还建立了一套严格的DNA重组实验室设计与操作规范。

众多安全可靠的相关技术支撑以及巨大的潜在诱惑力，终于使DNA重组技术走出困境并迅速发展起来。

五、基因工程的成熟早在基因工程发展的初期，人们就已开始探讨将该技术应用于大规模生产与人类健康水平密切相关的生物大分子，这些物质在人体内含量极小，但却具有非常重要的生理功能。

1977年，日本的Tfahura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。

几个月后，美国的Ullvich随即克隆表达了人的胰岛素基因。

1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕。

六、基因工程的腾飞上世纪八十年代以来，基因工程已开始朝着高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基因治疗等方向发展。

1982年，美国科学家将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，培育出具有大鼠雄健体魄的转基因小鼠及其子代。

1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组Ti质粒转化植物细胞获得成功，高等植物转基因技术问世。

1990年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功，从而开创了分子医学的新纪元。

1991年，美国倡导在全球范围内实施雄心勃勃的人类基因组计划，用15年时间斥资30亿美元，完成十二万五千个人类基因的全部测序工作。

2001年底，一张覆盖整个基因组的人类遗传图谱已经完成，而高质量的物理图谱也已覆盖了95%的基因组。

1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利”绵羊，如果借助于某种限制巧妙地避开伦理道德方面的社会学问题，那么人类在实验室里复制自身的尝试必将会产生无法估量的社会经济价值。

七、基因工程的特征（一）跨物种性外源基因在另一种不同的生物细胞内进行繁殖。

（二）无性繁殖外源DNA在寄主细胞内大量扩增和高水平表达。

第二节基因工程的主要操作内容一、基因工程的基本原理作为现代生物工程的关键技术，基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。

为达到此目的，可从以下四个方面考虑：（1）利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平。

这里涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理；（2）筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平；（3）选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。

上述两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理；（4）基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程学的基本理论体系。

因此，分子遗传学、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。

二、基因工程的基本过程依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。

前者主要在实验室里进行，其操作过程如下：（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）；（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简称接）；（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称转）；（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增）；（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。

由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检。

第三节基因工程的安全性一、基因工程的安全隐患（一）对环境的影响重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。

（二）新型病毒的出现制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。

（三）癌症扩散将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。

（四）人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。

二、重组DNA研究的安全准则（一）公众的担忧1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。

（二）专家的态度1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。

这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。

（三）制定安全规则1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。

规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。

1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。

（四）基因工程的安全措施1．实验室的物理安全分4级：P1—P4级。

①P1级实验室：一般装备良好的普通微生物实验室。

②P2 级实验室；在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。

③P3级实验室：全负压的实验室，同时装备安全操作柜。