优良菌种选育

第三章工业微生物优良菌种选育从自然界分离所得的野生菌种，不论在产量上或质量上均不适应微生物工程的要求，因此从自然界存在的产生某种代谢产物的菌种，经筛选分离和优良菌选育，已成为微生物工程菌种管理上的必要程序。

故优良菌种的选育是为生产提供各种类型的突变株，大幅度提高菌种产生利用价值代谢产物特别是基因工程，细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展，促进菌种选育技术不断更新，进而研制出众多有价值的微生物工程产品。

微生物工程优良菌种的选育方法包含自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交选育、原生质体融合技术、基因工程技术等等。

微生物工程评价生产菌种优劣的标准和菌种选育工作的研究目标是实现工业化生产。

也就是说，选育的菌种特性能否满足工业化生产的实际需要，是否具有工业化生产价值和实际利用价值。

因此，一株优良的生产菌种应该具备如下的特性：
①菌种的生长繁殖能力强，具较强的生长速率，产生孢子的菌种应具有较强的产孢子能力。

这样有利于缩短发酵培养周期，减少种子罐的级数，最终得以减少设备投资和运转费用。

同时，还可以减少菌种在扩大生产过程中可能发生的生产下降，或杂菌污染的可能性。

②菌种的培养基和发酵原料来源广泛、价格便宜、尤其对发酵原料成分的波动敏感性较小。

③对需要添加的前体物质具有耐受能力，且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。

④菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力，高产菌株的应用，可以在不增加投资的情况下，大幅度提高企业的生产能力。

⑤能高效地将原料转化为产品，这样可以降低生产成本，提高产品的市场竟争力。

⑥在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其它产物，这样不但可以提高营养物质的有效转化率，还会减少分离纯化的难度，降低成本，提高产品质量。

⑦在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数，提高单罐产量，降低成本具有重要意义。

⑧具有抗噬菌体感染的能力。

⑨菌株遗传特性稳定，以保证发酵能长期、稳定地进行，有利于实施最佳的工艺控制。

⑩菌种纯粹，不易变异退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。

这些都是对优良菌株特性的基本要求，也是菌种选育工作研究和需要解决的问题。

微生物菌种改良是微生物资源利用的关键步骤。

为生产目的产物，一般对所筛选出来的菌种都要进行菌种改良以提高其产率和改善其工艺性能。

推动工业菌株改良的主要动力是经济原因，发酵工程力求采用最经济、最有效的方式来取得最大的效益。

微生物工程菌种选育、改良的目的：
⑴提高产量
对微生物菌种进行选育改良，以过量生产（overproduction）或超量生产（super - production , hyper-production）目的产物。

产量效益是一切商业发酵过程所追求的首要目标，经济是菌种选育的主要推动力，是菌种选育不变的目的。

表征菌种经济性能的重要指标包括：
①浓度（concentration) ，指发酵终了产物的浓度，单位是g/L ，得率越高，产品越浓，带来的好处是下游处理也相对容易；
②转化率（yield) ，指每单位质量的底物转化为目的产物的质量数值，单位是g/g ，或者以百分率（%）表示，这一数值越高，表示菌种对原料的利用越有效，底物效率（Substrate efficiency）就越高；
③生产强度（发酵强度、生产率、生产能力，productivity) ，单位是g/(L·h) , 表示每升发酵液中每小时所得产物的质量（g）。

生产强度越大，达到相同产量所花费的发酵时间就越短。

要求目的产物的产量尽可能接近理论转化率。

通过菌种改良计划（可能需要几年时间）一般均可以明显提高产量，有时甚至可成百倍地提高。

⑵提高性能
除了产量以外，优异的服务性能也在考虑之列，如对用于杀虫和防腐作用的农业微生物菌种来说，则是毒力效价的提高、杀虫毒力的快速发挥、毒力的持久性、防治对象范围的扩大等。

⑶提高产物纯度
通过提高产物纯度，最大限度减少不需要的副产物的产生。

对抗生素而言，是提高有效组分的比例，减少产物类似物的产量。

例如，对于黑曲霉柠檬酸发酵，是防止草酸的生成，减少或消除色素，以有利于目的产物柠檬酸的分离、提取。

⑷改变菌种的性状以改善发酵过程
通过改变菌种的性状，可以改善发酵过程，主要涉及到以下方面：
①改变和扩大菌种所利用的原料结构，使之适应不同的原料，适应成分简单、来源广泛易得、价格低廉的培养基，以降低生产成本；
②改善菌种的生长速度，提高斜面孢子化程度，使生产菌种能产生大量有活力的繁殖体―细胞、芽孢、分生孢子等；
③以菌丝体形态发酵的真菌和放线菌，宜采用微小的球状菌丝体（penet form) , 以增加菌丝体表面积，大大降低丝状菌丝体对发酵搅拌剪切力的敏感性，并降低发酵液翻性，少用消泡剂以及耐合成消泡剂；
④改善对氧的摄取条件，降低需氧量及能耗等；
⑤菌种要能耐不良培养条件，如抗噬菌体、耐高温、耐酸碱、耐自身代谢产物等；
⑥改变细胞产物分泌能力，使目的产物尽可能分泌到细胞外，降低产物抑制作用及有利于产物分离；
⑦菌种的遗传性状，特别是涉及生产的遗传性状稳定。

⑸改变生物合成途径以获得新产品
通过诱变，筛选代谢途径显著改变的突变体，使产生菌合成与原来分子结构有差异的代谢产物。

如从诱变产生柔红霉素（daunomycin ，又名柔毛霉素，一种抗肿瘤抗生素）的波西链霉菌（Streptomyces peucetiu s）菌种，得到一种新的产物阿霉素（adria mycin，也称亚德里亚霉素），用于白血病、恶性淋巴病和一些肉瘤的治疗。

诱变紫苏霉素（sisomicin）产生菌伊钮小单孢菌（从Micromonospora inyoensis) ，得到结构不同的突变霉素（mutamycin) ，既扩大了抗生素的抗菌范围，又解决了耐紫苏霉素耐药菌所带来的问题。

组合生化（combinatorial biochemistry）技术以已知有用化合物或已知骨架的化合物分别与不同的微生物共同培养，在不同培养时间化合物的结构及其活性发生变化（发生修饰或转化），组成新型分子，从而极大地增加了化合物的多样性，相应增加了获得理想化合物的可能性。

这一技术已崭露头角，发展迅速。

3-1 自然选育
不经人工处理，利用微生物的自然突变（spontaneous mutation）进行菌种选育的过程称为自然选育（spontamtous selection）。

如图3-1所示。

自然选育在微生物的菌种选育中占很重要的地位，它是诱变育种的基础，而且贯穿于诱变育种的全过程。

所谓自然突变是指某些微生物在没有人工参与下所发生的某些突变现象，称它为自然突变决不意味着这种突变是没有原因的，一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。

多因素低剂量的诱变效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线，各种短波辐射，低剂
量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。

互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错记。

例如，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现；胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。

平衡是倾向于酮式或氨基式的，因此DNA双链中以AT和GC碱基配对为主。

但在偶然的情况下，当下以烯醇式出现时的一瞬间，DNA链正好合成到这一位置上，与T配对的就不是A、而是G；同样，若C以亚氨基式出现时的一瞬间，新合成的DNA链这一位置上，与C配对的就不是G，而是A，在DNA复制过程中发生的这种错误配对，应有可能引起自然突变，这种互变异构现象是无法预测的，对这种偶然事件作了大量的统计分析后，发现并掌握其中之规律，据统计，这种碱基对错误配对引起自然突变的几率为10-8~10-9。

调查研究（包括资料查阅）
↓
试验方案设计
↓
采样
↓
增殖条件摸索—→第一次增殖培养
↓
第一次平板分离——→第一次原种斜面
↓
第二次增殖培养
↓
第二次平板分离
↓
定性或半是量测定——→初筛（1株八瓶）
↓
第三次平板分离
↓
第三次原种斜面
↓
复筛（1株3~5瓶）——→第三次原种株
（不纯）↓
第四次平板分离
↓
第四次原种斜面
↓
初步工艺条件摸索———→再复筛←——种子培养
↓
较优菌株1~3棵
保藏及进一步做生产性能试验某些必要试验和
或作为育种的出发菌株毒性试验等
图3-1 微生物工程自然选育菌种操作程序图
自然突变可能会产生两种截然不同的效果，一种是菌种退化导致目标产物产量或质量下降；另一种是对生产有益的方向发展。

因此，为保证生产水平和稳定和逐步提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的选育优良的菌种。

自然选育的目的和意义在于：
⑴提高生产能力。

由于各种条件因素的影响，自然突变的经常发生，造成生产水平的波动，因此从高生产水平的批次中，分离出生产能力高菌种再用生产。

⑵纯化菌种，稳定生产，并作为诱变育种的出发菌种。

实践证明，纯的出发菌种比用遗传性能差的异核体作为出发菌效果较好。

⑶复壮菌种。

在微生物工程中，高产菌种退化一直是很严重的问题，防止菌种退化采用自然选育是一项积极的有效措施。

其不但能保持原菌种的生产能力，有时可能选育到超过原有生产能力和质量的优育菌种。

⑷巩固变种和杂种的优良特性。

通过诱变，杂交及其遗传方法育得的突变株，其遗传特性往往不太稳定，易发生回复突变种分离现象，导致生产能力的下降。

通过自然选育，可以纯化，巩固变种和杂种的优良遗传性，有效地选择分离高性能的突变株。

自然选育的方法，常用的有两种：单菌落分离法和单孢子分离法。

单菌落分离法的操作程序是，将菌种制成菌悬液，用稀释法在团体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。

单孢子分离法的操作程序是，借助显微操作仪器，在显微镜下挑取单孢子或菌体，进行单独培养，进而选育优良菌种。

总之，自然选育是一种简单易行的选良方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。

但是，其最大缺点是选育效率低，因此经常与诱变育种交替使用，以提高育种效率。

3-2 诱变育种
目前应用于工业化的生产菌种几乎无不例外地都是经过诱变的改良菌种。

诱变育种是提高菌株生产能力，改进产品质量，扩大品种代谢，简化生产工艺，使所需要的某此特定的代谢产物过量积累的有效方法之一。

因为从自然环境中分离的菌种存在着生产能力有限，生长周期长等缺点，一般不能满足工业化生产的实际需要。

诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素、化学试剂和生物诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

表3-1例出常见的突变类型。

表3-1 常见的突变类型
3.2.1. 诱变育种的原理
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。

突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。

染色体畸变是指染色体或DNA片段发生缺失，易位、重复等。

基因突变是指DNA链中的某一部位碱基发生变化，即点突变。

根据突变发生的原因分为自然突变和诱发突变。

自然突变是指在自然条件下出现的基因突变，诱变突变是指用各种物理、化学因素人工诱变发的基因突变。

诱变因素包括物理、化学和生物三大类（表3-2）。

表3-2 常用的诱变试剂
物理诱变剂紫外线、快中子、X射线、β-射线、γ-射线、激光
化学诱变剂碱基类似物
与碱基反应的物质
在DNA分子中插入或缺失一
个或几个碱基物质
2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮乌嘌呤
硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、亚
硝基甲基脲（NMU）、亚硝基乙基脲（NEU）、亚硝酸（NA）、氮芥
（NM）、4-硝基喹啉-氧化物（4-NQO）、乙烯亚胺（EI）、羟胺
吖啶类物质、吖啶类的氮芥衍生物
生物诱变剂噬菌体、转座子（transposon）
3.2.1.1物理诱变剂
物理诱变剂种类包括紫外线、快中子、X射线、α-射线、β-射线、γ-射线、微波、超声波、电磁波、激光射线、宇宙线等各种射线，其中应用最广泛是紫外线、快中子、X射线、γ-射线。

物理辐射可分为电离辐射（ionizing radiation）和非电离辐射（nonionizing radiation），它们都是以量子为单位的可以发射能量的射线。

电离辐射中的X射线和γ-射线都是高能量电磁波，能发射一定波长的射线。

X射线波长为0.06~136nm，γ-射线波长为0.006~1.4nm，其实就是短波的X射线，由钴、镭等产生。

快中子是不带电荷的粒子，不直接产生电离，但能从吸收中子物质的原子核中撞击出质子。

非电离辐射中的紫外线（ultraviolet radiation）是一种波长短于紫外光的肉眼看不见的“光线”，波长为136~390nm。

⑴生物学效应
物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。

物理诱变剂作用过程：物理、物理-化学、化学、生物等几个阶段（如图3-2）。

生物学效应：根据辐射种类和微生物种类不同有所差异。

由辐射引起DNA分子结构变化中最常发生的是DNA单链或双链的断裂，且单链断裂常多于双链断裂。

电离辐射主要引起DNA上基因突变和染色体畸变；非电离辐射主要导致嘧啶二聚体形成。

⑵辐射引起生物学效应的因素
辐射引起生物学效应的强弱即决定于微生物内在遗传因素，也受外界环境条件的影响。

①微生物的遗传背景
图3-2辐射作用的时相阶段
不同菌种由于遗传性状各异，对辐射的敏感性各不相同。

有研究表明不同品系的大肠杆菌对X 射线的敏感性差别很大；DNA中腺嘌呤碱基A和胸腺嘧啶碱基T的比例越高，该菌对紫外线就越敏感，但对电离辐射则相反。

②微生物的生理状态
微生物不同的细胞壁结构直接影响着对辐射的敏感程度；同一种微生物在不同的生长期（如营养体与芽孢、菌丝与孢子等），对辐射的敏感性也不同。

③可见光
在可见光下，细胞内的光修复系统，可以将紫外线辐射而产生的生物学效应予以修复，使诱变效果大大降低。

④水分
水分对辐射效应具有重要的影响作用。

研究表明，含水的酵母菌比干酵母细胞对辐射的敏感性要高；土曲霉孢子的含水量降低，对X射线的敏感度也随之下降。

⑤温度
尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作用，加速与DNA发生的化学反应，而且，在微生物生长最适的范围内，较高的温度能增强辐射生物学效应。

⑥空气或氧气
在氧气充足的条件下要比在缺氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。

⑶非电离辐射——紫外线
①紫外线的诱变机制和DNA损伤修复
a. 紫外线的诱变机制
紫外线被DNA吸收后引起突变的原因，有DNA与蛋白质的交链；胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用；DNA链的断裂；形成嘧啶二聚体。

而形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。

b. DNA损伤修复
DNA损伤的修复对突变体的形成影响很大。

DNA损伤包括任何一种不正常的DNA分子结构。

到目前为止，DNA损伤中研究较多的是由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体。

在修复系统中研究较多的
是光修复、切补修复、重组修复和SOS修复系统以及聚合酶的校正作用。

光修复在一定剂量的紫外线照射后的突变体，在可见光下照射适当时间，约90%以上被修复而存活下来。

这是由于在黑暗下嘧啶二聚体被一种光激活酶结形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体，DNA恢复成正常的构型，使突变率下降。

在一般的微生物中都存在着光复活作用，因此，用紫外线进行诱变时，照射或分离均应在红光下进行。

切补修复切补修复是在四种酶的协调作用下进行DNA损伤修复的，这四种酶都不需要可见光的激活，在黑暗中就可修复，所以也叫做“暗修复”（dark repair）。

参与切补修复的酶可以识别DNA链上嘧啶二聚体的位置。

嘧啶二聚体的5′端在限制性内切核酸酶的作用下造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。

然后在DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，以另一条完整的DNA单链作模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。

由此说明，紫外线照射引起微生物突变体形成是一个复杂的生物学过程。

切补修复分为先切后补和先补后切两种形式。

②紫外线诱变
a.紫外线的有效光谱
紫外线的光谱范围在40~390nm，而DNA可以吸收的紫外线光谱通常为260nm，因此，能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是200~300nm。

最有效的波长为253.7nm（2537A）。

这一波长的诱变效应相当于波长260nm的紫外线。

一般用来灭菌消毒的30W紫外灯管，光谱分布范围广，较平均，诱变效率较差。

而15W紫外灯管，放射出来的紫外线大约有80%波长集中在2537A，因此诱变效应比30W的好。

b 紫外线的辐射剂量
用于微生物诱变的紫外线剂量的表示方法，可分为绝对剂量和相对剂量。

绝对剂量：单位为erg/mm2表示（1erg=10-7J），需要用一种剂量仪来测定。

相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示。

紫外线处理微生物时，其吸收射线的剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照微生物的距离及照射的时间。

在灯的功率和灯管的距离都固定的情况下，剂量大小由照射的时间决定，即剂量与照射时间成正比关系，照射时间长，剂量就大。

根据育种工作者长期的研究和实践经验，一般认为杀菌率以90%~99.9%效果较好。

而70%~80%或更低的杀菌率，有利于正突变率菌株的产生。

在同样15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下照射各种微生物，使它们的杀菌率都达90%~99.9%时所需的时间随微生物种类而异。

一般芽孢菌约需10min方可杀死；照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型，需要1~3min。

一般微生物营养体照射3~5min即可致死，而照射无芽孢菌和革兰阳性菌只需0.5~2min就可死亡。

照射装置：低功率15W紫外灯管2支，安装在渡铬的灯罩内，使2537A光波集中到处理的微生物细胞上。

c.紫外线诱变步骤
①出发菌株：细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。

②前培养：对细菌以肉汤为主，适量加入核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养基，同时还可以抑制修复的物质，如咖啡碱或异烟肼等。

将菌体培养到最佳生理状态（对数期），约16~24h；霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。

③菌悬液的制备：离心除去培养基，用生理盐水制备菌悬液，加入玻璃珠振荡分散，以无菌滤纸或脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90%~95%。

要求菌悬液浓度：细菌约1×108mL-1，放线菌约107~108mL1、霉菌约106~107mL-1。

④紫外线照射：
a.将紫外光灯先打开预热20min，稳定光波。

b.取9cm无菌培养皿一只，加入上述菌悬液5~6 mL（3~4ml/7cm培养皿），放入无菌搅拌棒。

c.将培养皿放置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外灯下，搅拌照射3 min、
5 min、7 min、9 min、11min等不同时间。

d.照射过程必须在备有黄光或红光的暗室内进行，以免光修复。

⑤后培养：根据延迟现象的原理，照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5~2h。

⑥分离筛选：在红光下，将上述经诱变处理的菌悬液进行稀释后，取两个稀释度涂布平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释液0.1mL，用无菌玻璃棒刮涂均匀，用黑布（纸）将平板包好，置一定温度下培养适当时间。

以同样操作，但用未经紫外线处理的菌稀释液涂布平板作对照。

⑷电离辐射
①电离辐射的种类、特性和来源
常用于微生物诱发突变的电离辐射有快中子、X射线和γ射线等，其特性和来源见表3-3 。

表3-3 辐射的种类、特性和来源
辐射的种类放射源性质能量范围危险性透过组织的深度X射线X光机电离辐射通常为50~300kV 危险，有穿透力几毫米至几厘米
γ射线放射线同位
素及核反应与X射线相似的电
离辐射
达几百万eV* 危险，有穿透
力
＞1cm
中子，包括：快中子、慢种子、热中
子核反应堆或
加速器
不带电子的粒子，比氢
原子略重，只有通过它
与被它击中的原子的
作用才能观察到
从小于1eV
到几百万eV
危险性高，穿
透力强
＞1cm
β粒子，快速电子或阴极射线放射线同位
素和加速器
电子（带“+”或“-”），
比α粒子的电离密度
小得多
几百万eV 有时危险＞1cm
α粒子放射线同位素氦核，电离密度大2×106~9×106eV 内照射，很危险＞1cm *1eV（电子伏）=1.602×10-12erg（尔格），1Ci=3.7×1010次衰变/s
中子是原子核中的组成部分，是不带电荷的粒子。

快中子是由中子穿过物质的原子时把原子核中的质子撞击出来而产生的。

由于快中子能产生较大的电离密度，能更有效地导致突变和染色体畸变，因此对微生物的诱变效果较理想。

X射线和γ射线也是最常用的微生物诱变辐射源。

二者大体上具有相同的效果，但从操作简便这点来说，用60Co和137Cs射线源较为理想。

②电离辐射的剂量
快中子的剂量通常以拉德（rad）表示，指1g被照射物质吸收100erg辐射能量的射线剂量为1rad。

转换为伦琴（R）为单位，即快中子照射时产生的离子数与1R射线所产生的离子数相当的剂量为1R。

在诱变育种中，快中子照射的致死率达到50%~85%比较合适，采用的诱变剂量大约在15~30krad （千拉德）。

使用快中子更有利于产生正突变，正突变率可达50%左右。

因此，快中子作为微生物诱变剂得到较为广泛的利用。

X射线和γ射线的剂量单位通常以伦琴（R）来表示，即1㎝3干燥空气在0℃，1.013×105Pa （760mmHg气压下）产生2.08×109离子时所需的能量。

一般常用剂量掌握在杀菌率90%～99.9%为宜，切忌用高剂量进行处理。

据报道，通常以菌体生存率1/1000的剂量较为理想。

要达到这一致死率，剂量大约为1万～20万伦琴（R）。

③电离辐射的照射方法。