第八章 电泳分离技术.
合集下载
第八章 电化学分离法
又如，一些天然放射性元素，按其标准电极 电势由小到大的次序是：Ra、Ｔh、Ｕ、Ｐb、 Ｂi、Po。若在含有这些天然放射性元素的酸性溶 液中加入银片，由于Ａg＋／Ａg的标准电极电势 （+0.7996V）不仅比Ra、Ｔh、Ｕ大，而且比Ｐb、 Ｂi、Po也大，因此在银片上似乎不可能发生任何 上述金属离子的电沉积。但是，210Po实验证明， 可以自发电沉积在银片上，而且产量很高。这是 因为这些金属中只有Po的标准电极电势 （+0.765V）比较接近Ａg。
电化学极化是由于电极反应迟缓所引起的。 一般情况下，在电极上进行的反应是分步进行的， 其中某一步反应速率比较缓慢，它对整个电极反 应起着决定性作用，这一步反应需要相当高的活 化能才能进行。对于阴极反应，必须使阴极电势 比可逆电极电势更负一些；对于阳极反应，必须 使其电势比可逆电极电势更正一些，增加其活化 能才能使电极反应进行。这种由于电极反应迟缓 所引起的极化称为电化学极化，与之相应的超电 势称为电化学超电势。
假定[Ag+]降低到10-7mol/l时，认为已经 完全析出，此时阴极的电势为
E Ag 0.799 0.0592lg10 0.385(V )
溶液中铜开始析出的电势为
0.0592 0.0592 lg[Cu 2 ] 0.337 lg1 0.337 (V ) 2 2
7
ECu E (Cu 2 / Cu )
电泳分离的基本原理
电泳分离的基本原理
电泳分离是一种常见的分离技术，其基本原理是利用电场力将带电粒子在介质中移动，从而实现分离。电泳分离通常用于分离蛋白质、核酸、细胞等生物大分子。
在电泳分离中，带电粒子在电场力的作用下，沿着电场方向移动。由于不同粒子的电荷量、大小、形状等特性不同，因此它们在电场力下的迁移速度也不同，从而实现了不同粒子的分离。
电泳分离通常需要将样品溶液注入到电泳槽中，然后在槽中施加电场。常用的电泳介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等。
电泳分离具有分离效率高、分离速度快、操作简单等优点，因此在生物学、化学等领域得到了广泛应用。
- 1 -
《电泳技术》PPT课件
浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加 速移动→P压缩成层 样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测）， CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P， P 在均一的电位梯度和pH条件下分离
SDS-凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移 率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。
测定蛋白质等电点？
结束
交联剂对孔径有影响：5％最小
根据要分离物质的相对分子质量选择合适 的单体浓度。
2 不连续电泳中样品压缩成层的原理
不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝 胶，用不同pH值的缓冲液：
样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓 冲液
浓缩胶：与样品胶相同
分离胶：小孔径，pH8.8～8.9 Tris-HCl缓 冲液
电泳技术思考题
1名词解释 电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电 泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？ 3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？ 4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？ 5 不连续电泳样品压缩成层原理。 6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何
加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键 还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P 分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷， 形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于 P分子量。
SDS-凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移 率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。
测定蛋白质等电点？
结束
交联剂对孔径有影响：5％最小
根据要分离物质的相对分子质量选择合适 的单体浓度。
2 不连续电泳中样品压缩成层的原理
不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝 胶，用不同pH值的缓冲液：
样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓 冲液
浓缩胶：与样品胶相同
分离胶：小孔径，pH8.8～8.9 Tris-HCl缓 冲液
电泳技术思考题
1名词解释 电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电 泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？ 3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？ 4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？ 5 不连续电泳样品压缩成层原理。 6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何
加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键 还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P 分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷， 形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于 P分子量。
分离科学---第八章高效毛细管电泳
第八章 高效毛细管电泳
（6）检测器
峰的宽度或区带宽度为时间宽度（Wt），实际 长度相等的区带产生时间宽度不等的峰，需校正， 否则会给计算柱效和定量分析带来误差。
l Ws Wt tm
检测器的空间宽度（ Wd ）不同，紫外检测器几百 微米，电导检测器小于50微米，需校正
l W W s W t d tm
一般情况下，如果满足下述方程，那么焦耳热热就 不会引起太严重的谱带展宽 Ed(c)1/3<1500 E 为 电 场 强 度 ， 单 位 KV/m ， c 是 介 质 浓 度 ， 单 位 mol/L，d为管径，单位m。
第八章 高效毛细管电泳
控制焦耳热和温度梯度的方法：
降低电场强度
减小毛细管内径
第八章 高效毛细管电泳
以球形粒子为例
q ( ) q E r e v ' E E( ) 6 6 r 6
荷质比不同是CZE分离的基础。
a. 样品分子本身荷质比不同（pH调控）
a p v' E
绝对淌度（absolute mobility,mab）
无限稀释条件下单位电场强度下离子的平均 迁移速度。它是该离子在一定溶液中的一个特征 物理常数。在手册中可以查到一些离子的绝对淌 度。
第八章 高效毛细管电泳
有效淌度（effective mobility,ef）
第八章电泳
二维电泳同时利用分子的大小和等 电点这两种性质的差别进行蛋白质等生 物大分子的分离，即普通凝胶电泳和IEF 结合，因此分离效率更高。
第一相： 等电聚焦 第二相： SDS－PAGE
优点：分辨率高,可分离出5000个不同的 蛋白质组分，是单向电泳无法比拟的。 缺点：费时，处理量小。 目的：为了获得更详细的组分信息 目前已经广泛应用于蛋白质组研究中
等速电泳原理 定义：等速电泳是根据分子电荷的差别而不是分 子大小差别来进行物质分离的。仅适用于同种 电荷的分离。 原理:在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子 为前导离子（Cl-)，迁移率最小的阴离子为末 尾离子（甘氨酸离子），以阳离子为反离子， 电泳开始时，将含有目标蛋白质的料液加入到 前导离子和末尾离子之间。
等速电泳特点 1)等速电泳中扩散的影响很小，可以忽 略不计。 2)提高前导离子的浓度，可使溶质得到 浓缩。 3)采用适当的低分子两性电解质，在目 标蛋白质前后作用间隔物,可使目标蛋白 与其他蛋白质完全分离，得到高度纯化。
分离特性 利用不连续电泳分离蛋白质，可改 变各种操作参数优化分离过程。例如， 调节pH值可改变荷电量Z，调节凝胶浓 度可改变迁移率，调节电压可改变电泳 速度等。因此，选择适当的操作条件， 可进行各种蛋白质的分离。
分离操作
不连续的凝胶层上部和下部分别使用pH值不同的缓冲 液。以分离蛋白质为目的时，上部缓冲液根据待分离蛋白 质的等电点选定。例如，如果蛋白质的等电点小于8－9.5 时，可采用pH8.3的甘氨酸-Tris－HCl缓冲液。浓缩层用 pH6.8的缓冲液平衡。此时，Cl－为前导离子，阴离子甘氨 酸为末尾离子，Tris为反离子，，料液中的蛋白质夹在前 导离子和末尾离子间在浓缩层内泳动，最后达到等速电泳 状态进入下层分离凝胶。在下层凝胶中，蛋白质受到高浓 度凝胶的分子筛作用，不能继续保持等速泳动，被末尾离 子甘氨酸超过，因而在分离区带前面显示甘氨酸区带的pH 值，蛋白质之间根据荷电量和分子大小，进行一般的凝胶 电泳，得到分离。
电泳分离技术
11
区带电泳1
按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为: (1)滤纸为支持物的纸电泳; (2)粉末电泳: 如纤维素粉,淀粉,玻璃粉电泳; (3)凝胶电泳:如琼脂,琼脂糖,硅胶,淀粉胶,聚
丙烯酰胺凝胶电泳; (4)丝线电泳:如尼龙丝,人造丝电泳 。
12
区带电泳2
按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为:
电泳分离技术
2020年4月23日星期四
前言
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳 仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70 年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节 ，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
(1) 平板式电泳:支持物水平放置,是最常用的 电泳方式;
(2) 垂直板电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直 板式电泳.
(3) 柱状(管状)电泳:聚丙烯酰胺凝胶可灌入适 当的电泳管中做成管状电泳.
13
区带电泳3
按pH的连续性不同,区带电泳可分为: (1)连续pH电泳:电泳的全部过程中缓冲液pH保
非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子 ，带负电荷。
因此，在电泳实验中，氢氧化铁胶体微粒向阴极移动 ，三硫化二砷胶体微粒向阳极移动。利用电泳可以分 离带不同电荷的溶胶。
7
应用领域
区带电泳1
按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为: (1)滤纸为支持物的纸电泳; (2)粉末电泳: 如纤维素粉,淀粉,玻璃粉电泳; (3)凝胶电泳:如琼脂,琼脂糖,硅胶,淀粉胶,聚
丙烯酰胺凝胶电泳; (4)丝线电泳:如尼龙丝,人造丝电泳 。
12
区带电泳2
按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为:
电泳分离技术
2020年4月23日星期四
前言
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳 仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70 年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节 ，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
(1) 平板式电泳:支持物水平放置,是最常用的 电泳方式;
(2) 垂直板电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直 板式电泳.
(3) 柱状(管状)电泳:聚丙烯酰胺凝胶可灌入适 当的电泳管中做成管状电泳.
13
区带电泳3
按pH的连续性不同,区带电泳可分为: (1)连续pH电泳:电泳的全部过程中缓冲液pH保
非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子 ，带负电荷。
因此，在电泳实验中，氢氧化铁胶体微粒向阴极移动 ，三硫化二砷胶体微粒向阳极移动。利用电泳可以分 离带不同电荷的溶胶。
7
应用领域
电泳分离技术
分离速度等优点。
输标02入题
在电泳分离过程中，带电粒子在电场的作用下产生迁 移，迁移速度与粒子的电荷量和质量有关，因此可以 根据粒子的电荷量和质量差异进行分离。
01
03
电泳分离技术的效果受到多种因素的影响，如电场强 度、电场梯度、溶液pH值、缓冲液组成等，因此需要
根据实验条件进行优化。
04
电泳分离技术可以应用于蛋白质、核酸、多糖等生物 分子的分离分析，为生物科学研究提供了重要的工具。
02
它利用带电粒子在电场中的迁移 率不同，从而实现不同粒子在电 场中的分离。
技术发展历程
19世纪末
最早的电泳技术出现，主要用于蛋白质的分离。
20世纪初
电泳技术开始应用于医学和生物学领域，如血清蛋白的分离和DNA的 分离。
20世纪中叶
随着电泳技术的不断改进和发展，出现了多种电泳方法，如等电聚焦 电泳、凝胶电泳等。
谢谢
THANKS
21世纪
随着生物技术的快速发展，电泳分离技术在基因组学、蛋白质组学等 领域的应用越来越广泛，成为生命科学研究的重要手段之一。
02 电泳分离技术的基本原理
CHAPTER
电泳现象
定义
电泳现象是指带电粒子在电场中受到电场力的作用而发生迁移的 现象。
原理
带电粒子在电场中受到电场力的作用，产生定向移动，使得粒子在 电场中分布不均，从而实现分离。
输标02入题
在电泳分离过程中，带电粒子在电场的作用下产生迁 移，迁移速度与粒子的电荷量和质量有关，因此可以 根据粒子的电荷量和质量差异进行分离。
01
03
电泳分离技术的效果受到多种因素的影响，如电场强 度、电场梯度、溶液pH值、缓冲液组成等，因此需要
根据实验条件进行优化。
04
电泳分离技术可以应用于蛋白质、核酸、多糖等生物 分子的分离分析，为生物科学研究提供了重要的工具。
02
它利用带电粒子在电场中的迁移 率不同，从而实现不同粒子在电 场中的分离。
技术发展历程
19世纪末
最早的电泳技术出现，主要用于蛋白质的分离。
20世纪初
电泳技术开始应用于医学和生物学领域，如血清蛋白的分离和DNA的 分离。
20世纪中叶
随着电泳技术的不断改进和发展，出现了多种电泳方法，如等电聚焦 电泳、凝胶电泳等。
谢谢
THANKS
21世纪
随着生物技术的快速发展，电泳分离技术在基因组学、蛋白质组学等 领域的应用越来越广泛，成为生命科学研究的重要手段之一。
02 电泳分离技术的基本原理
CHAPTER
电泳现象
定义
电泳现象是指带电粒子在电场中受到电场力的作用而发生迁移的 现象。
原理
带电粒子在电场中受到电场力的作用，产生定向移动，使得粒子在 电场中分布不均，从而实现分离。
电泳分离原理
电泳分离原理
电泳分离原理是一种基于不同物质在电场中迁移速率不同而实现的分离技术。其基本原理是利用物质在电场作用下的带电性及不同荷质比的差异，通过在一个带电场中对含有混合物的溶液或凝胶进行处理，使其中的成分在电场作用下沿着一定方向迁移，从而实现它们的分离。
电泳分离根据具体的物质性质和条件可以采用不同的方法，常见的有毛细管电泳、凝胶电泳、平板电泳等。这些方法在电场中运用不同的介质，如液体或凝胶，将需要分离的混合物分散其中，然后通过施加电场，使带电的物质在介质中发生迁移。迁移的速率取决于物质的特性，如电荷量、荷质比、形状、大小等。
在毛细管电泳中，将待分离的物质溶解在背景电解液中，然后将其注入至两端通电的毛细管中。施加电场后，带电的溶液分子会在电场力的作用下在毛细管内迁移，迁移速率与物质的荷质比有关。由于不同物质的荷质比不同，它们在电场中的迁移速度也不同，从而实现分离。
凝胶电泳则是将待分离的物质溶解在凝胶中，通过施加电场使其在凝胶内迁移。凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，其主要作用是形成孔隙结构，以便分子在其中迁移。由于不同物质在凝胶中的迁移速率不同，它们会在电场作用下逐渐分离开来。
总之，电泳分离原理是基于物质在电场中的迁移速率差异实现
的分离技术。通过控制电场和选择合适的分离介质，可以实现对具有不同特性的物质的高效分离。
第八章电泳分离技术
• 8 .3电泳技术分类 • 8.3.1影响电泳迁移率的因素 • ①电场强度。电场强度是指单位长度 (cm)的电位降，也称电势梯度。
• 当电压在500V以下，电场强度在2-10V/cm时 为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在 20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带 电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生 大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。
②聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是亚甲基双丙烯酰 胺交联制备得到的聚合物，具有三维空 间网络结构，结合其对不同大小分子的 筛分效应，可被用来从已知分子量的标 准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准 曲线中测得供试品的分子量。
③琼脂糖凝胶电泳设备与试剂。琼脂糖凝胶 电泳分为垂直型及水平型两种。其中水平型 可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样 都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一 般 用 连 续 缓 冲 体 系 ， 常 用 的 有 TBE ( 0.08mol/L. Tris. HC1, pH8.5 , 0.08mol/L 硼 酸 ， 0.0024mo1/L EDTA) 和 THE(0.04mol/L. Tris. HC1 ， pH7.8 ， 0.2mol/L.醋酸钠，0 .0018mol/L EDTA)。
• 洗脱法 • 将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试 品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于 1.6%的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗 脱完全，于一定波长下测定吸收度。同时 剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同 法操作作为对照。先计算吸收值总和，再 计算各蛋白组分所占百分含量。
8-1 新型分离技术简介(一)
1、毛细管电泳的简介
1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75um 内 径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细 管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力 学色谱。1987年Cohen和Karger提出了毛细管凝胶 电泳。1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品 仪器。
毛细管电泳法已经广泛应用到中药有效成分的分离 和含量测定中，如生物碱、黄酮类、有机酸类、酚类、 苷类、蒽醌类、香豆素类等。
生物样本中的药物及其代谢产物分析
生物体内药物及其代谢物的随时间与位置分布 研究，即药物动力学分析，在临床医学中有重要意 义。近年来，用毛细管电泳法进行生物样本中的药 物及其代谢产物的分析已成为研究热点。已有文献 报导用CE法监测腺昔及其代谢物含量变化；用CE 法测定人血浆中的优降糖、甲福明二甲双肌、苯乙 双肌含量；用CE一化学发光法检测人尿中儿茶酚胺 的含量；CE法测定血浆中蛋氨酸的含量；用CE-电 导法检测血清中的丙戊酸含量。
第八章、新型分离技术简介
2023最新整理收集 do something
1、电泳分离 2、膜分离 3、磁分离 4、手性分离技术 5、分子烙印技术 6、气浮分离法 7、新型萃取技术
一、毛细管电泳分离法 （capillary electrophoresis, CE）
1、简介 2、基本原理（与HPLC的比较） 3、仪器结构 4、分离机理及分类 5、应用
常规电泳分离技术凝胶电泳
常规电泳分离技术（凝胶电泳）
学生：陈瑶
学号：10101550121 内容摘要：
关键词：电泳分离技术的原理、特点、分类、凝胶电泳的应用范围、应用实例。
一、概念
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。
凝胶电泳：以凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等)为支撑物的区带电泳。
1.主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶
（1）琼脂糖——筛分作用小，适于大分子物质
（2）聚丙烯酰胺——分离效果好，分辨率高，适于小分子物质
二、常规电泳分析的原理
1.基本原理：在确定的条件下，在电解质溶液中，带电粒子在单位电场强度作
用下，带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。
2.这里结合有支持的区带电泳讨论带电的样品颗粒，在饱和缓冲溶液的支持物
中，在电场中的运动状态：用Q表示样品颗粒本身所带的电量，用E表示电场强度，V为样品颗粒的移动速度，K表示摩擦系数。则这时颗粒在电场中所受到拉力（泳动力）为QE，KV彼岸时相反方向的摩擦力，当两种力相等时，可用下式表示：
QE=KV ①
移动等式①得：
V=QE/K ②
从②可以得出，颗粒在电场中的移动速度与它的带电量及电场强度的乘积成正比，与摩擦系数成反比。即颗粒本身携带的电荷越多、电场强度越大，颗粒移动的越快；反之越慢。
再变动一下等式②，即把电场强度移到等式的左边来，得：
V/E=Q/K ③
式③中的V/E的含义为：在单位电场强度下，颗粒的移动速度，此处称为该颗粒的电泳迁移率，用µ表示，即：
第八章 电泳分离技术培训课件
8
在医院临床检验中，利用电泳技术分析血 清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、 心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、 恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病； 分析血色素组份，可以判定血细胞的正常 与异常
9
一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用 电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药----胰岛 素β细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了福 音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价 百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在 冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离 的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激 酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价 可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有 一百多万，只此一项即可节约几亿美元。
5
1959年Raymond和Weintraub利用人工 合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯 酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的 分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多 年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学 和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等 生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分 析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度： 即"电泳纯"（一维电泳一条带或二维电泳 一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被 人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的 最后、最准确的手段，即"Last Check"
2
电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电
在医院临床检验中，利用电泳技术分析血 清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、 心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、 恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病； 分析血色素组份，可以判定血细胞的正常 与异常
9
一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用 电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药----胰岛 素β细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了福 音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价 百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在 冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离 的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激 酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价 可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有 一百多万，只此一项即可节约几亿美元。
5
1959年Raymond和Weintraub利用人工 合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯 酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的 分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多 年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学 和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等 生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分 析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度： 即"电泳纯"（一维电泳一条带或二维电泳 一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被 人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的 最后、最准确的手段，即"Last Check"
2
电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电
第八章 电泳分离技术
3.2 SDS-PAGE的操作步骤
1.安装膜具
（1）
（2）
（3）
（4）
（5）
2. 配制凝胶溶液
凝胶配方 储存液 凝胶终浓度T(C=3%) 3% 5% 10% 15% 20% 单体储液ml 3.4 5 10 15 20 浓缩胶缓冲液 2.4 分离胶缓冲液 7.5 7.5 7.5 7.5 10%SDS 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 双蒸水 14 17.2 12.2 7.2 2.2 10%过硫酸铵ul 10 10 10 10 10 TEMED ul 10 10 10 10 10
1.2 电泳的理论基础
QE f
EQ eZE 6 r 6 r
d u tE E
f 6 r
Q eZ u 6 r 6 r
1.2.1 影响电泳速度的因素
①电场强度： 泳动速度与电场强度成正比； ②溶液的pH值： pH距待分离物质的pI越远， 泳动速度越大； ③溶液离子强度： 离子强度越小,电动势越大, 泳动速度越快； ④溶液的黏度：泳动速度与溶液的黏度成反比； ⑤电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物 的相对移动。 ⑥颗粒的性质：一般所带电荷量越大、直径越 小或其形状越接近于球形，迁移率就越大。
表 分离蛋白质选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值
分子量范围 <104 1-4×104 4104-1×105 105-5×105 >5×105
_电泳分离
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位
自由，重现性好，可测定蛋白质或多肽的等电 点。 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶 解或发生变性的组分，PH梯度稳定性不高且价 格较高。 为此已开发了固定化PH梯度（IPG）的等 电聚集法，将具有缓冲能力的化合物共价偶联 到凝胶上，形成更稳定的PH梯度，可进一步提 高IEF的分离性能。
以醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持 物的电泳技术。
优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于 定量、便于保存 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析 操作 （1） 薄膜的处理与放置 （2 ）点样 平衡 （3 ）电泳：E 10~25V/cm，0.5～2h （4 ）显色
凝胶电泳（ electrophoresis）。 4、 凝胶电泳（gel electrophoresis）。
以凝胶为电泳介质进行的电泳分离方法称凝 胶电泳 。 支持物：多孔凝胶 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高 在酶工程中主要用于酶分子量的测定，酶蛋白 和酶RNA顺序测定以及酶的分离检测等。 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因： 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作 用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
(3)等电聚焦操作关键是调配稳定的、连续的PH梯度。 等电聚焦操作关键是调配稳定的、连续的 梯度 梯度。 等电聚焦操作关键是调配稳定的 氨基酸混合物或 一般用氨基酸混合物 聚氨基羧酸（多氨基、 一般用氨基酸混合物或聚氨基羧酸（多氨基、多 梯度。 羧基）的缓冲溶液调配PH梯度 羧基）的缓冲溶液调配 梯度。 (4)PH梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶最常用， (4)PH梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶最常用，其次 梯度支持介质 最常用 是琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶。
简述电泳分离不同大小的dna片段的原理
简述电泳分离不同大小的dna片段的原理
《电泳分离不同大小的DNA片段》
DNA电泳分离是一种常用的分离DNA片段的方法。它基于DNA片段在电场作用下，根据其
大小和电荷差异而在电泳凝胶中移动的原理。该方法广泛应用于分子生物学、遗传学、医学等领域中的DNA分析和研究。
电泳分离DNA的基本原理如下：首先，将待分离的DNA片段溶解在电泳缓冲液中，形成
DNA样品。然后，将DNA样品加载到含有聚丙烯酰胺或琼脂糖等成分的凝胶中，这种凝胶被
称为电泳凝胶。
接下来，将一个正极和一个负极连接到凝胶两端，建立一个电场。DNA片段带有负电荷，因
此在电场中会向阳极移动。因为凝胶具有筛选作用，较长的DNA片段会在凝胶中移动的速度
较慢，而较短的DNA片段则会移动得更远。
在电泳过程中，DNA片段逐渐在凝胶中分离开来，形成一个DNA条带图案，该图案可通过染料（如乙溴品）或放射性标记物（如放射性核素）来观察。不同的DNA片段形成不同的条带，条带的位置和密度反映了DNA的长度和含量。通过与已知长度的DNA片段进行比较，可以
确定未知DNA片段的大小。
为了更精确地分离和测量DNA片段，可以利用两种主要类型的电泳分离技术：琼脂糖凝胶电
泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶适用于较大的DNA片段（数千到数十万碱基对），而
聚丙烯酰胺凝胶适用于较小的DNA片段（数十到数百碱基对）。
总而言之，电泳分离不同大小的DNA片段是通过在电场中利用凝胶的筛选作用，使DNA片
段根据其大小和电荷差异移动的原理实现的。该方法广泛应用于DNA的分析与研究，为我们
电泳分离技术
精品课件
11
电泳分离：是利用带电粒子在电场中泳
动速度的差别进行分离的方法。
I. 实验室中强有力的分析、鉴定和分离技 术——更大规模的制备应用。
II. 与HPLC相比在可靠性、分辨率、使用的 难易度和成本上具优势。
III. 在生物技术研究和产物分离纯化应用的 是区带电泳。
精品课件
12
电泳分类
按分离的原理区分： 区带电泳 移界电泳 等速电泳 等电聚焦
精品课件
17
二、电泳技术原理
生物技术研究对象：主要是核酸和蛋白质
蛋白分子带电荷的基团：正电荷（氨基、亚氨
基、酰氨基）、负电荷（羧基、苯酚基、巯
基）；
基团所带ຫໍສະໝຸດ Baidu荷的性质和数量随溶液环境（如
pH和离子强度）变化。
蛋白分子在电场内迁移所受到的力（F）与
电场强度（E）及蛋白分子的净电荷成正比
关系。
精品课件
精品课件
4
1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电 泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪， 建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法， 并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、 γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技 术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年 的诺贝尔化学奖。
精品课件
18
另一种表示方法：
μ
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
缓冲液
浓缩胶 分离胶
表 分离蛋白质选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值
分子量范围 <104 1-4×104 4104-1×105 105-5×105 >5×105
适宜凝胶浓度T% 20~30 15~20 10~15 5~10 2~5
在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分 离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品， 常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的 凝胶浓度。
（2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。
（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金 属等可抑制聚合反应。
2.1.2 凝胶用量计算
聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于凝胶总浓度 （T% ）和交联度（C%）。
T% = C% =
a+b × 100% m a a+b ×100%
式中a代表单体Arc的重量(g)，b代表交联剂Bis的 重量(g) ，m代表溶液的体积(mL)
第八章 电泳分离技术
主要内容
第一节 概述
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 等电聚焦电泳 第五节 双向凝胶电泳
第六节 毛细管电泳
1.1 电泳的基本概念
电泳：带电物质在电场中向相反电极
移动的现象。 电泳迁移率：在单位电位梯度的作用下， 单位时间内质点所移动的距离。 电泳分离技术：利用带电物质在电场中 泳动速度的差别而进行分离的方法。
垂直或平板状电泳
CH2=CH C=O NH2
Baidu Nhomakorabea丙烯酰胺(Acr)
-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis) NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O 聚丙烯酰胺 NH NH2
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel
electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作
为支持介质的一种电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透 明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附 和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。
PAGE按凝胶的形状可分为：圆盘状电泳
显微 电泳
等电聚 焦电泳
等速 电泳
淀粉凝 胶电泳
聚丙烯 酰胺凝 胶电泳
琼脂 糖凝胶 电泳
纸电泳
醋酸纤 维薄 膜电泳
薄层 电泳
薄层电泳
根据支持介质形状不同
分析电泳
板电泳
柱电泳。
用途不同 制备电泳
定量、免疫电泳。
电泳的方向不同
水平电泳 垂直电泳 连续电泳 不连续电泳
电泳系统的连续性
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.2.2 两种离子型物质A和B的混合物的分离
dB / t dA / t uA 和 uB E E
dA dB Et (uA uB)
dA dB t E (uA uB )
1.3 电泳技术分类
是否用支持物 用支持物区带电泳 不用支持物电泳
凝胶支 持物区 带电泳
非凝胶 支持 物电泳
样品 浓缩胶 分离胶 缓冲液
缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓 缩效应示意图
快离子 慢离子 蛋白质样品
解离度 ：Cl> 蛋> mclcl>m蛋蛋>m
Gly
Gly
Gly
凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样 品被夹在中间。
凝胶层的不连续性
缓冲液
样品进入浓缩胶有一个 堆积浓缩效应(缓冲液 pH8.3) 蛋白质从“－”极向 “＋”极移动，从浓缩胶 进入分离胶，速度变慢， 堆积浓缩。
1.2 电泳的理论基础
QE f
EQ eZE 6 r 6 r
d u tE E
f 6 r
Q eZ u 6 r 6 r
1.2.1 影响电泳速度的因素
①电场强度： 泳动速度与电场强度成正比； ②溶液的pH值： pH距待分离物质的pI越远， 泳动速度越大； ③溶液离子强度： 离子强度越小,电动势越大, 泳动速度越快； ④溶液的黏度：泳动速度与溶液的黏度成反比； ⑤电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物 的相对移动。 ⑥颗粒的性质：一般所带电荷量越大、直径越 小或其形状越接近于球形，迁移率就越大。
样品 浓缩胶
分离胶
电位梯度的不连续性
E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动 率最大，在快离子后面形成一 个离子浓度低的低电导区，产 生较高的电位梯度，使蛋白质 和慢离子加速移动，蛋白质样 品被进一步浓缩。
B. 电荷效应
蛋白质样品进入分离胶后， pH增大(pH 8.9)，Gly－解离 度增大，不存在快、慢离子之 分，蛋白质样品在均一电场强 度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载 有效电荷不同，因此质点的有 效迁移率不同，形成不同区带。
2)光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照 形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚 合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增 加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除 去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层 水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。
2.1 基本原理
2.1.1聚丙烯酰胺凝胶的聚合 1)化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵，此外还需 要加速剂TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二 胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的 加入，可使过硫酸铵形成自由基： S2O822SO4-
这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙 . 烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的 聚丙烯酰胺。
2.1.3 分离效应
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为:
连续性电泳
不连续性电泳:凝胶层的不连续性 缓冲液离子成分的不连续性
pH值的不连续性
电位梯度的不连续性
电泳时产生的 3种物理效应: 浓缩效应
电荷效应 分子筛效应
A. 样品的浓缩效应
缓冲液成分及pH的不连续性
浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液 Tris-Gly
浓缩胶 分离胶
表 分离蛋白质选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值
分子量范围 <104 1-4×104 4104-1×105 105-5×105 >5×105
适宜凝胶浓度T% 20~30 15~20 10~15 5~10 2~5
在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分 离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品， 常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的 凝胶浓度。
（2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。
（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金 属等可抑制聚合反应。
2.1.2 凝胶用量计算
聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于凝胶总浓度 （T% ）和交联度（C%）。
T% = C% =
a+b × 100% m a a+b ×100%
式中a代表单体Arc的重量(g)，b代表交联剂Bis的 重量(g) ，m代表溶液的体积(mL)
第八章 电泳分离技术
主要内容
第一节 概述
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 等电聚焦电泳 第五节 双向凝胶电泳
第六节 毛细管电泳
1.1 电泳的基本概念
电泳：带电物质在电场中向相反电极
移动的现象。 电泳迁移率：在单位电位梯度的作用下， 单位时间内质点所移动的距离。 电泳分离技术：利用带电物质在电场中 泳动速度的差别而进行分离的方法。
垂直或平板状电泳
CH2=CH C=O NH2
Baidu Nhomakorabea丙烯酰胺(Acr)
-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis) NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O 聚丙烯酰胺 NH NH2
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel
electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作
为支持介质的一种电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透 明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附 和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。
PAGE按凝胶的形状可分为：圆盘状电泳
显微 电泳
等电聚 焦电泳
等速 电泳
淀粉凝 胶电泳
聚丙烯 酰胺凝 胶电泳
琼脂 糖凝胶 电泳
纸电泳
醋酸纤 维薄 膜电泳
薄层 电泳
薄层电泳
根据支持介质形状不同
分析电泳
板电泳
柱电泳。
用途不同 制备电泳
定量、免疫电泳。
电泳的方向不同
水平电泳 垂直电泳 连续电泳 不连续电泳
电泳系统的连续性
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.2.2 两种离子型物质A和B的混合物的分离
dB / t dA / t uA 和 uB E E
dA dB Et (uA uB)
dA dB t E (uA uB )
1.3 电泳技术分类
是否用支持物 用支持物区带电泳 不用支持物电泳
凝胶支 持物区 带电泳
非凝胶 支持 物电泳
样品 浓缩胶 分离胶 缓冲液
缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓 缩效应示意图
快离子 慢离子 蛋白质样品
解离度 ：Cl> 蛋> mclcl>m蛋蛋>m
Gly
Gly
Gly
凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样 品被夹在中间。
凝胶层的不连续性
缓冲液
样品进入浓缩胶有一个 堆积浓缩效应(缓冲液 pH8.3) 蛋白质从“－”极向 “＋”极移动，从浓缩胶 进入分离胶，速度变慢， 堆积浓缩。
1.2 电泳的理论基础
QE f
EQ eZE 6 r 6 r
d u tE E
f 6 r
Q eZ u 6 r 6 r
1.2.1 影响电泳速度的因素
①电场强度： 泳动速度与电场强度成正比； ②溶液的pH值： pH距待分离物质的pI越远， 泳动速度越大； ③溶液离子强度： 离子强度越小,电动势越大, 泳动速度越快； ④溶液的黏度：泳动速度与溶液的黏度成反比； ⑤电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物 的相对移动。 ⑥颗粒的性质：一般所带电荷量越大、直径越 小或其形状越接近于球形，迁移率就越大。
样品 浓缩胶
分离胶
电位梯度的不连续性
E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动 率最大，在快离子后面形成一 个离子浓度低的低电导区，产 生较高的电位梯度，使蛋白质 和慢离子加速移动，蛋白质样 品被进一步浓缩。
B. 电荷效应
蛋白质样品进入分离胶后， pH增大(pH 8.9)，Gly－解离 度增大，不存在快、慢离子之 分，蛋白质样品在均一电场强 度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载 有效电荷不同，因此质点的有 效迁移率不同，形成不同区带。
2)光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照 形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚 合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增 加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除 去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层 水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。
2.1 基本原理
2.1.1聚丙烯酰胺凝胶的聚合 1)化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵，此外还需 要加速剂TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二 胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的 加入，可使过硫酸铵形成自由基： S2O822SO4-
这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙 . 烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的 聚丙烯酰胺。
2.1.3 分离效应
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为:
连续性电泳
不连续性电泳:凝胶层的不连续性 缓冲液离子成分的不连续性
pH值的不连续性
电位梯度的不连续性
电泳时产生的 3种物理效应: 浓缩效应
电荷效应 分子筛效应
A. 样品的浓缩效应
缓冲液成分及pH的不连续性
浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液 Tris-Gly