酶法提取海参脏器多糖条件优化研究
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Abstract: Papain was used to extract the polysaccharide from the holothurian harslet. The optimal extracting conditions obtained by the orthogonal experiment design were as follows: pH8.0, the ration of stuff to solvent was 1 ∶30 （g/mL）, 55 ℃ , 4 h and 3.0 % of papain. With these conditions, the extraction rate of polysaccharides reached to 14.76 %. Key words: holothurian harslet; enzyme method; polysaccharide
如图 3 所示，多糖得率随酶解温度的升高而升 高，到达 55 ℃后，随温度的升高，多糖得率开始下降。 这可能是因为随着温度的逐渐增加，反应物的能量随 之升高，反应速度加快，有利于酶解的快速进行；当超 过一定温度后，酶的活力降低，甚至完全失去活性，从 而导致多糖得率下降。因此，最适酶解温度在 55 ℃ 左右。 2.1.4 加酶量对多糖得率的影响
11.567
k3
12.040 10.860 11.580
11.390
பைடு நூலகம்
R
3.207 1.427 0.860
0.177
最优水平 A2
B2
C2
D2
正交试验的结果如表 1 所示，各因素的影响次序 为：酶解温度>pH 值 >加酶量>酶解时间。由表 1 中可 以看出，最佳组合因素为 A2B2C3D1，即温度为 55 ℃，pH 为 8.0，加酶量为 3.5 %，酶解时间为 4 h，试验结果多 糖得率为 13.67 %；根据因素指标趋势图（图 6），最佳 因素组合为 A2B2C2D2，即温度为 55 ℃，pH 值为 8.0，加 酶量为 3.0 %，酶解时间为 4 h，试验结果多糖得率为 14.76 %。因此 ,确定海参脏器多糖提取的最佳工艺条 件为 A2B2C2D2。
Study on the Extracrion of Polysaccharide from Holothurian Harslet by Enzyme Method XU Jing1,2, ZHOU Feng-mei1 , PENG Fang1 ,WANG Huai-hui1，FU Feng-hua1,*
海参（Holothurians， sea cucumbers）属于棘皮动物 门海参纲，不但营养丰富，而且还是一种海洋动物性药 材，清代《本草纲目拾遗》中将其列为补益药物。近年 来，随着对海参的生物活性物质研究的不断深入，人们 从海参体壁中提取分离得到了海参多糖。研究表明， 海参多糖具有抗凝血、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老、降 血脂等多种生物学活性[1-3]。 山东省是我国海参的主产 区，目前年产海参已达 3 万 t，在海参加工过程中，大量 内脏抛弃处理，造成极大的资源浪费和环境污染。目 前对于海参脏器多糖的研究鲜见报道, 本文研究了从 海参脏器中提取多糖的适宜方法，以期为海参脏器资 源的开发提供参考，提高海参的附加值，促进海参养殖 产业的发展。
6
2
3
1
2
11.79
7
3（60） 1
3
2
12.04
8
3
2
1
3
12.32
9
3
3
2
1
11.76
K1
28.66 33.62 32.37
34.19
K2
37.28 36.86 35.45
34.70
K3
36.12 32.58 34.74
34.17
k1
9.553 11.207 10.957
11.397
k2
12.760 12.287 11.817
如图 2 所示，多糖提取率受 pH 值的影响较为显 著。当 pH 值从 6.5 升至 8.0 时，多糖得率逐渐提高，pH 值大于 8.0，多糖得率显著下降。结果表明，pH 值过低 时酶的活性较小，当 pH 值在 8.0 左右时，酶的活性最 高，与底物的亲和力最强，催化速度快，多糖得率最高。 因此，最佳酶解 pH 值为 8.0。
（1. School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264003, Shandong, China; 2. School of Ocean, Harbin Institute of Technology at Weihai, Weihai 264209，Shandong, China）
取 6 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于 1∶30（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值为 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，加入 2.5 % 木瓜蛋白酶，55 ℃水浴酶解 4 h，比较不同 pH 值的多 糖得率。
取 5 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于 1∶30 （g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的HCl 调节 pH 值 8.0，加入 3.0 %木瓜蛋白酶，分别于 55℃酶解 2、3、4、5、6 h，比较不同酶解时间的多糖得率。
表 1 多糖提取正交试验结果 Table 1 The results of the orthogonal test for extracting
FW100 高速万能粉碎机：上海胜启仪器有限公 司；TDL-60 低速离心机：上海安亭科学仪器厂；FD-1D 冷冻真空干燥机：上海精密仪器仪表有限公司；UV-2000 紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司； HH-4 数显恒温水浴锅：常州华普达教学仪器有限 公司。 1.3 提取方法
称取一定量干燥的海参脏器粉，加入蒸馏水匀 浆，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值， 加入木瓜蛋白酶[4]，以酶解温度、酶解时间、pH 值、料液 比、加酶量为可变因素，在不同条件下酶解进行提取。 酶解后迅速加热至 90 ℃10 min 灭酶活，4 000 r/min 离 心 5 min，取上清，加入 3 倍体积的 95 %乙醇 4 ℃静置 过夜，取出，4 000 r/min 离心 5 min，弃上清，先后以丙 酮和无水乙醇洗涤沉淀，真空冷冻干燥得海参脏器多
2010 年 8 月
28
第 31 卷第 8 期
食品研究与开发
基础研究
酶法提取海参脏器多糖条件优化研究
许静 1,2，周凤梅 1，彭芳 1，王怀卉 1，傅风华 1,* （1.烟台大学 药学院，山东 烟台 264003；2.哈尔滨工业大学（威海）海洋学院，山东 威海 264209）
摘 要：利用木瓜蛋白酶酶解海参脏器提取多糖，探讨酶解温度、酶解时间、pH 值、料液比、加酶量等对海参脏器多糖 得率的影响，确定最适提取条件为：酶解温度 55 ℃，pH 8.0，加酶量 3.0 %，料液比 1∶30（g/mL），酶解时间 4 h，在此条件 下，海参脏器多糖的得率为 14.76 %。 关键词：海参脏器；酶解；多糖
如图 1 所示，多糖提取率随料液比的增加而增 加，达到 1∶30（g/mL）时提取率最高，然后随料液比的提 高，提取率反而下降。试验结果表明，料液比过高或过 低对多糖的提取都会产生不利影响。料液比过低时底 物浓度较大，会对酶的催化作用起到一定的抑制作用； 当料液比过高时底物浓度过低，酶的浓度也会随之降 低，酶解反应不够充分，导致多糖得率降低。综合考虑， 料液比为 1∶30（g/mL）较为理想。 2.1.2 pH 值对多糖得率的影响
3 结论 木瓜蛋白酶酶解海参脏器提取多糖的最佳工艺
条件为∶料液比 1∶30（g/mL），温度 55 ℃，酶解时间 4 h， 加酶量 3.0 %，pH8.0，在此条件下，海参脏器多糖得率
基础研究
食品研究与开发
2010 年 8 月
第 31 卷第 8 期
31
花生衣红色素的提取及其稳定性研究
钟世荣，吴平，冯治平 （四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）
取 5 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于 1∶30（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的HCl 调节 pH 值 8.0，分别加入 1.5 %、2.0 %、2.5 %、 3.0 ％、3.5 %的木瓜蛋白酶，于 55 ℃水浴酶解 4 h，比较 不同加酶量的多糖得率。
如图 5 所示，酶解时间由 2 h 增加到 4 h，多糖得 率显著提高。酶解时间超过 4 h 后，多糖的提取率随时 间的延长反而呈下降趋势。这可能是因为提取时间过 长，多糖发生降解以及酶液腐败造成的，因此，最佳酶 解时间应在 4 h 左右。 2.2 多糖提取工艺的优化
在上述试验的基础上，对海参脏器多糖提取率的 主要因素（酶解温度、pH 值、加酶量、酶解时间）进行 L（9 34）正交试验，料液比为 1∶30（g/mL），以获取最佳试
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
海参脏器：威海金源海参养殖场提供，洗去内容
作者简介：许静（1973—），女（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：天 然产物分离纯化。 * 通信作者
物及泥沙，室温晾干，粉碎机粉碎至 20 目过筛，浸泡于 丙酮中 4 ℃过夜脱脂，晾干备用；木瓜蛋白酶：sigma 公 司 ，酶活力为 25 U/mg；硫酸、苯酚、乙醇、丙酮、氢氧化 钠、盐酸等所有试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备
基础研究
食品研究与开发
糖。采用苯酚-硫酸法检测多糖含量[5]，根据单因素试 验结果选取因素水平进行正交试验，获得提取多糖的 最佳条件。
2010 年 8 月
第 31 卷第 8 期
29
2 结果与分析 2.1 单因素试验 2.1.1 料液比对多糖得率的影响
取 5 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，分别置于 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值 7.0，加入 2.5 % 木瓜蛋白酶，于 55 ℃酶解 4 h，比较不同料液比的多糖 得率。
如图 4 所示，当加酶量从 1.5 %增加到 3.0 %时，
2010 年 8 月
30
第 31 卷第 8 期
食品研究与开发
验条件。试验结果见表 1。
基础研究
多糖得率增加较迅速；从 3.0 %增加到 3.5 %，多糖得 率增加不明显。这可能是因为随着酶浓度的上升,酶与 底物的接触机会增加, 蛋白质水解速度提高，导致多糖 更快地分离出来。达到饱和后，蛋白被水解的速度趋于 稳定，再增大加酶量也难以显著提高多糖得率。因此最 适加酶量应在 3.0 %左右。 2.1.5 酶解时间对多糖得率的影响
polysaccharide
序号 A 温度/℃ B pH C 加酶量/% D 酶解时间/h 多糖得率%
1
1（50） 1（7.5） 1(2.5)
1(3)
8.76
2
1 2（8.0） 2(3.0)
2(4)
10.87
3
1 3（8.5） 3(3.5)
3(5)
9.03
4
2（55） 1
2
3
12.82
5
2
2
3
1
13.67
摘 要: 通过 L（9 34）正交试验确定花生衣红色素的最佳提取工艺，同时对其稳定性进行研究。结果表明:色素最佳提 取工艺条件为：提取剂 50 %乙醇，浸提温度 40 ℃，浸提时间 80 min，料液比 1∶25(g/mL)。花生衣红色素的特征吸收峰 为 495 nm；该色素对 pH、温度、光照、以及 VC、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Na2SO3 稳定性较好,对柠檬酸、H2O2、Fe3+稳定 性较差。 关键词: 花生衣；红衣色素；提取工艺；稳定性
2.1.3 酶解温度比对多糖得率的影响 取 6 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于
1∶30（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值 8.0，加入 2.5 %木瓜蛋白酶，分别在 45、50、55、60、65、70 ℃水浴酶解 4 h，比较不同酶解温 度下的多糖得率。
如图 3 所示，多糖得率随酶解温度的升高而升 高，到达 55 ℃后，随温度的升高，多糖得率开始下降。 这可能是因为随着温度的逐渐增加，反应物的能量随 之升高，反应速度加快，有利于酶解的快速进行；当超 过一定温度后，酶的活力降低，甚至完全失去活性，从 而导致多糖得率下降。因此，最适酶解温度在 55 ℃ 左右。 2.1.4 加酶量对多糖得率的影响
11.567
k3
12.040 10.860 11.580
11.390
பைடு நூலகம்
R
3.207 1.427 0.860
0.177
最优水平 A2
B2
C2
D2
正交试验的结果如表 1 所示，各因素的影响次序 为：酶解温度>pH 值 >加酶量>酶解时间。由表 1 中可 以看出，最佳组合因素为 A2B2C3D1，即温度为 55 ℃，pH 为 8.0，加酶量为 3.5 %，酶解时间为 4 h，试验结果多 糖得率为 13.67 %；根据因素指标趋势图（图 6），最佳 因素组合为 A2B2C2D2，即温度为 55 ℃，pH 值为 8.0，加 酶量为 3.0 %，酶解时间为 4 h，试验结果多糖得率为 14.76 %。因此 ,确定海参脏器多糖提取的最佳工艺条 件为 A2B2C2D2。
Study on the Extracrion of Polysaccharide from Holothurian Harslet by Enzyme Method XU Jing1,2, ZHOU Feng-mei1 , PENG Fang1 ,WANG Huai-hui1，FU Feng-hua1,*
海参（Holothurians， sea cucumbers）属于棘皮动物 门海参纲，不但营养丰富，而且还是一种海洋动物性药 材，清代《本草纲目拾遗》中将其列为补益药物。近年 来，随着对海参的生物活性物质研究的不断深入，人们 从海参体壁中提取分离得到了海参多糖。研究表明， 海参多糖具有抗凝血、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老、降 血脂等多种生物学活性[1-3]。 山东省是我国海参的主产 区，目前年产海参已达 3 万 t，在海参加工过程中，大量 内脏抛弃处理，造成极大的资源浪费和环境污染。目 前对于海参脏器多糖的研究鲜见报道, 本文研究了从 海参脏器中提取多糖的适宜方法，以期为海参脏器资 源的开发提供参考，提高海参的附加值，促进海参养殖 产业的发展。
6
2
3
1
2
11.79
7
3（60） 1
3
2
12.04
8
3
2
1
3
12.32
9
3
3
2
1
11.76
K1
28.66 33.62 32.37
34.19
K2
37.28 36.86 35.45
34.70
K3
36.12 32.58 34.74
34.17
k1
9.553 11.207 10.957
11.397
k2
12.760 12.287 11.817
如图 2 所示，多糖提取率受 pH 值的影响较为显 著。当 pH 值从 6.5 升至 8.0 时，多糖得率逐渐提高，pH 值大于 8.0，多糖得率显著下降。结果表明，pH 值过低 时酶的活性较小，当 pH 值在 8.0 左右时，酶的活性最 高，与底物的亲和力最强，催化速度快，多糖得率最高。 因此，最佳酶解 pH 值为 8.0。
（1. School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264003, Shandong, China; 2. School of Ocean, Harbin Institute of Technology at Weihai, Weihai 264209，Shandong, China）
取 6 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于 1∶30（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值为 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，加入 2.5 % 木瓜蛋白酶，55 ℃水浴酶解 4 h，比较不同 pH 值的多 糖得率。
取 5 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于 1∶30 （g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的HCl 调节 pH 值 8.0，加入 3.0 %木瓜蛋白酶，分别于 55℃酶解 2、3、4、5、6 h，比较不同酶解时间的多糖得率。
表 1 多糖提取正交试验结果 Table 1 The results of the orthogonal test for extracting
FW100 高速万能粉碎机：上海胜启仪器有限公 司；TDL-60 低速离心机：上海安亭科学仪器厂；FD-1D 冷冻真空干燥机：上海精密仪器仪表有限公司；UV-2000 紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司； HH-4 数显恒温水浴锅：常州华普达教学仪器有限 公司。 1.3 提取方法
称取一定量干燥的海参脏器粉，加入蒸馏水匀 浆，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值， 加入木瓜蛋白酶[4]，以酶解温度、酶解时间、pH 值、料液 比、加酶量为可变因素，在不同条件下酶解进行提取。 酶解后迅速加热至 90 ℃10 min 灭酶活，4 000 r/min 离 心 5 min，取上清，加入 3 倍体积的 95 %乙醇 4 ℃静置 过夜，取出，4 000 r/min 离心 5 min，弃上清，先后以丙 酮和无水乙醇洗涤沉淀，真空冷冻干燥得海参脏器多
2010 年 8 月
28
第 31 卷第 8 期
食品研究与开发
基础研究
酶法提取海参脏器多糖条件优化研究
许静 1,2，周凤梅 1，彭芳 1，王怀卉 1，傅风华 1,* （1.烟台大学 药学院，山东 烟台 264003；2.哈尔滨工业大学（威海）海洋学院，山东 威海 264209）
摘 要：利用木瓜蛋白酶酶解海参脏器提取多糖，探讨酶解温度、酶解时间、pH 值、料液比、加酶量等对海参脏器多糖 得率的影响，确定最适提取条件为：酶解温度 55 ℃，pH 8.0，加酶量 3.0 %，料液比 1∶30（g/mL），酶解时间 4 h，在此条件 下，海参脏器多糖的得率为 14.76 %。 关键词：海参脏器；酶解；多糖
如图 1 所示，多糖提取率随料液比的增加而增 加，达到 1∶30（g/mL）时提取率最高，然后随料液比的提 高，提取率反而下降。试验结果表明，料液比过高或过 低对多糖的提取都会产生不利影响。料液比过低时底 物浓度较大，会对酶的催化作用起到一定的抑制作用； 当料液比过高时底物浓度过低，酶的浓度也会随之降 低，酶解反应不够充分，导致多糖得率降低。综合考虑， 料液比为 1∶30（g/mL）较为理想。 2.1.2 pH 值对多糖得率的影响
3 结论 木瓜蛋白酶酶解海参脏器提取多糖的最佳工艺
条件为∶料液比 1∶30（g/mL），温度 55 ℃，酶解时间 4 h， 加酶量 3.0 %，pH8.0，在此条件下，海参脏器多糖得率
基础研究
食品研究与开发
2010 年 8 月
第 31 卷第 8 期
31
花生衣红色素的提取及其稳定性研究
钟世荣，吴平，冯治平 （四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）
取 5 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于 1∶30（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的HCl 调节 pH 值 8.0，分别加入 1.5 %、2.0 %、2.5 %、 3.0 ％、3.5 %的木瓜蛋白酶，于 55 ℃水浴酶解 4 h，比较 不同加酶量的多糖得率。
如图 5 所示，酶解时间由 2 h 增加到 4 h，多糖得 率显著提高。酶解时间超过 4 h 后，多糖的提取率随时 间的延长反而呈下降趋势。这可能是因为提取时间过 长，多糖发生降解以及酶液腐败造成的，因此，最佳酶 解时间应在 4 h 左右。 2.2 多糖提取工艺的优化
在上述试验的基础上，对海参脏器多糖提取率的 主要因素（酶解温度、pH 值、加酶量、酶解时间）进行 L（9 34）正交试验，料液比为 1∶30（g/mL），以获取最佳试
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
海参脏器：威海金源海参养殖场提供，洗去内容
作者简介：许静（1973—），女（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：天 然产物分离纯化。 * 通信作者
物及泥沙，室温晾干，粉碎机粉碎至 20 目过筛，浸泡于 丙酮中 4 ℃过夜脱脂，晾干备用；木瓜蛋白酶：sigma 公 司 ，酶活力为 25 U/mg；硫酸、苯酚、乙醇、丙酮、氢氧化 钠、盐酸等所有试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备
基础研究
食品研究与开发
糖。采用苯酚-硫酸法检测多糖含量[5]，根据单因素试 验结果选取因素水平进行正交试验，获得提取多糖的 最佳条件。
2010 年 8 月
第 31 卷第 8 期
29
2 结果与分析 2.1 单因素试验 2.1.1 料液比对多糖得率的影响
取 5 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，分别置于 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值 7.0，加入 2.5 % 木瓜蛋白酶，于 55 ℃酶解 4 h，比较不同料液比的多糖 得率。
如图 4 所示，当加酶量从 1.5 %增加到 3.0 %时，
2010 年 8 月
30
第 31 卷第 8 期
食品研究与开发
验条件。试验结果见表 1。
基础研究
多糖得率增加较迅速；从 3.0 %增加到 3.5 %，多糖得 率增加不明显。这可能是因为随着酶浓度的上升,酶与 底物的接触机会增加, 蛋白质水解速度提高，导致多糖 更快地分离出来。达到饱和后，蛋白被水解的速度趋于 稳定，再增大加酶量也难以显著提高多糖得率。因此最 适加酶量应在 3.0 %左右。 2.1.5 酶解时间对多糖得率的影响
polysaccharide
序号 A 温度/℃ B pH C 加酶量/% D 酶解时间/h 多糖得率%
1
1（50） 1（7.5） 1(2.5)
1(3)
8.76
2
1 2（8.0） 2(3.0)
2(4)
10.87
3
1 3（8.5） 3(3.5)
3(5)
9.03
4
2（55） 1
2
3
12.82
5
2
2
3
1
13.67
摘 要: 通过 L（9 34）正交试验确定花生衣红色素的最佳提取工艺，同时对其稳定性进行研究。结果表明:色素最佳提 取工艺条件为：提取剂 50 %乙醇，浸提温度 40 ℃，浸提时间 80 min，料液比 1∶25(g/mL)。花生衣红色素的特征吸收峰 为 495 nm；该色素对 pH、温度、光照、以及 VC、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Na2SO3 稳定性较好,对柠檬酸、H2O2、Fe3+稳定 性较差。 关键词: 花生衣；红衣色素；提取工艺；稳定性
2.1.3 酶解温度比对多糖得率的影响 取 6 份 20 g 脱脂干燥后的海参脏器粉，置于
1∶30（g/mL）的蒸馏水中，用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl 调节 pH 值 8.0，加入 2.5 %木瓜蛋白酶，分别在 45、50、55、60、65、70 ℃水浴酶解 4 h，比较不同酶解温 度下的多糖得率。