利用环介导等温扩增技术对人工感染弓形虫小鼠早期诊断的研究

利用环介导等温扩增技术对人工感染

弓形虫小鼠早期诊断的研究

刘　朗1,2,贺　光1,索　勋1

(1.中国农业大学动物医学院国家动物原虫实验室,北京海淀100193;2.北京伴侣动物医院,北京西城100035)

中图分类号:S852.72 文献标识码:B 文章编号:052926005(2009)1020029203

弓形虫病是由细胞内寄生龚地弓形虫(Tox o2 pl asm a gondii)引起的一种人畜共患病。目前本病的诊断主要依靠血清学方法检测特异性抗体。但是在急性感染期由于抗体没有产生,无法对该病做出及时诊断;在免疫力低下和免疫缺陷病人血清中则可能检测不到抗体,往往延误治疗的最佳时机[1]。对弓形虫感染早期确诊的需要,使得分子生物学技术PCR被应用于弓形虫病的诊断[2]。2000年Not2 omi等[3]报道了一种新的核酸扩增技术2环介导等温扩增技术(1oop2mediated isot hermal amplifica2 tion,L AM P),L AM P与PCR相比较有很多优点,目前该技术已被用于多种病原的检测[426]。本试验研究利用试验建立的弓形虫L AM P检测法和文献[7]报道的PCR检测体系,以弓形虫特异基因A F146527为靶基因,以人工感染弓形虫的小鼠血液为样本,检测了不同弓形虫接种剂量下能够检出弓形虫感染的最短时间。通过与PCR的直接比较,评价了所建立的弓形虫LAM P检测法对弓形虫病早期诊断的效果,为探索进一步开发弓形虫L AM P 检测试剂盒提供了基础数据。

1　材料与方法

1.1　实验动物与虫种　昆明系小鼠,雌雄各半,体重20g左右,购自北京大学医学部实验动物部;龚地弓形虫R H株(Tox opl asm a gondii R H st rain),国家动物原虫实验室保存。

收稿日期:2009203223

作者简介:刘朗(19632),男,博士,主要从事小动物临床研究, E2mail:liulangbj@

通讯作者:索勋,E2mail:suoxun@ 1.2　试剂与试剂盒　Bst DNA聚合酶大片段, New England Biolabs;10×Thermal Buffer,New England Biolabs;甜菜碱(Betaine),Sigma公司; dN TPs(each2.5mmol/L),T a K aRa公司;均购自北京吉普腾生物技术有限公司。DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司。DNA Marker,2x Taq mix,购自北京全式金生物技术有限公司。G old2 view核酸染料,购自北京赛百盛基因技术有限公司。

1.3　弓形虫接种　将在昆明系小鼠体内已经连续传代3次复苏后的弓形虫收集后,在40倍倒置显微镜下用血细胞计数板计数,按照接种量为104、103、102个/只腹腔接种昆明系小鼠,每个接种剂量接种5只小鼠,攻虫前与攻虫期间自由给水、采食。

1.4　全血的采集　在弓形虫接种后的24、48、72、96、120、144h(144h后小鼠已全部死亡)分别对小鼠进行眼底静脉丛采血,每只小鼠采血200μL,将相同接种剂量组、相同采集时间的全血收集到一只已加入适量抗凝剂ACD的1.5mL离心管中,制成抗凝血,-20℃保存备用。

1.5　血液DNA的提取　取出采集的抗凝血样本,提取全血DNA,每个样本取200μL抗凝血,严格按照TIANamp Genomic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒使用说明提取抗凝血DNA,提取完毕,用60μL TE溶解DNA,-20℃保存备用。1.6　PCR反应　引物如下:

Up p rimer:5′2C GCT GCA GGGA GGAA GA2 C GAAA GT T G23′;

Down p rimer:5′2C GCT GCA GACACA GT G2 CA TC T GGA T T23′。

关。本试验仅对紫杉醇抑制犬乳腺肿瘤细胞做了初步的研究,有关紫杉醇抗犬乳腺肿瘤机制还有待进一步的研究。

参考文献:

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sis may occur wit hout a prior G2/M2phase arrest[J].Anti2 cancer Res,2004,24(1):27236.

[3]　Perez Alenza M D,Tabanera E,Pena L.Inflammatory mam2

mary carcinoma in dogs:33cases(199521999)[J].J Am Vet Med Assoc,2001,219(8):111021114.

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Chinese Journal of Veterinary Medicine 中国兽医杂志2009年(第45卷)第10期

引物由北京奥科生物技术有限公司合成。PCR 反应扩增片段长为529bp 体系(25μL )如下:2x T aq mix ,12.5μL ;Up p rimer (20μmol/L ),1μL ;Down primer (20μmol/L ),1μL ;Template DNA ,2μL ;dd H 2O ,8.5μL 。反应条件为:94℃预变性7min ,之后94℃变性1min ,55℃退火1min ,72℃延伸1min ,共35个循环,最后72℃延伸10min 结束反应。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,G oldview 核酸染料染色,紫外灯下观察结果。1.7　L AM P 反应引物如下:

A F 2F3:5′2T GGGT T GGGAA GCGACGA 23′;A F 2B3:5′2ACA GT GCA TC T GGA T TCCT 23′;A F 2FIP :5′2TCGT GGT GA T GGC GGA GA T T 2T T TCCCT TC GTCCAA GCC 23′;

A F 2

B IP :5′2GTCT

C T T

T T TCCACCCT T T T 2T TC GGA GA GGGA GAA GA T 23′。

引物由北京奥科生物技术有限公司合成。L AM P 反应体系(25μL )如下:8U Bst DNA poly 2

merase ,20mmol/L Tris 2HCl (p H 8.8,25℃

),10mmol/L (N H 4)2SO 4,10mmol/L KCl ,4.0mmol/L MgSO 4,0.1%Triton X 2100,1.0mol/L Betaine ,A F 2F3和A F 2B3各0.2μmol/L ;A F 2FIP 和A F 2B IP 各0.8μmol/L ;1.6mmol/L dN TPs ,2.0μL Temeplate DNA ,。反应条件:恒温64℃,1h 。扩

增产物结果分析:(1)取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,G oldview 核酸染料染色,紫外灯下观察扩增结果。(2)在扩增产物中加入1μL 经3倍稀释的G oldview 核酸染料通过肉眼观察扩增产物颜色的变化,产生黄色荧光为扩增反应阳性,产生棕红色荧光为扩增反应阴性。2　结果2.1　血液采集　在弓形虫接种后的24、48、72、96、120、144h 分别对小鼠进行眼底静脉丛采血。在抗凝血采集过程中,不断有小鼠死亡,接种第144小时后所有实验小鼠全部死亡。具体情况见表1。

表1　接种不同剂量弓形虫的小鼠血液采集后存活情况

接种后采血时间(h )

各接种剂量组采血后小鼠存活数量(只)

10410310224555485557245496344120223144

1

2

2

2.2　PCR 检测结果　以104、103、102共3个接种剂量组6d 的全血DNA 样本作为模板,采用PCR 检测法对其进行扩增。反应结束后,取5μL 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测结果见图1。

图1　PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果

1:102

接种120h 采血;2:103接种120h 采血;3:104接种120h 采血;4:102接种144h 采血;5:103接种144h 采血;6:104接种144h 采血;7:未接种健康小鼠血;8:阳性对照;M :Marker

根据电泳条带观察发现:当弓形虫接种量为103和104时,从第120小时开始可以看到弓形虫特异基因A F146527对应的529bp 条带;而当弓形虫接种量为102时,从第144小时开始可以看到弓形虫特异基因A F146527对应的529bp 条带。2.3　L AM P 检测结果　以104、103、1023个接种剂量组6d 的全血DNA 样本作为模板,采用建立的弓形虫LAM P 检测法对其进行扩增。反应结束后,取5μL 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。在反应产物中加入1μL 3倍稀释的G oldview 核酸染料,可以看到阳性反应管为黄色荧光,而阴性反应管为棕红色荧光,,其结果和L AM P 产物琼脂糖凝胶电泳结果吻合,检测结果如图2。 根据电泳条带观察发现:当弓形虫接种量为103和104时,从第96小时开始可以看到清晰的典型L AM P 梯形条带;而当弓形虫接种量为102时,从第120小时开始可以看到清晰的典型L AMP 梯形条带。3　讨论

LAM P 反应针对一个目标基因的6个区段设计4条引物进行的DNA 扩增,特异性高;其反应温度恒定,不需要PCR 仪,反应可在1h 内完成,快速高效;反应结束后,通过向反应产物中添加核酸染料,根据产物颜色变化可以清晰直观的判定结果。

3中国兽医杂志2009年(第45卷)第10期 Chinese Journal of Veterinary Medicine