诺如病毒标本处理和室检测技术方案
广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引
附件9广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引诺如病毒的实验室检测方法主要包括核酸检测和抗原检测，核酸检测是目前国际上最常用的检测方法。
这些方法各有优缺点，在操作时可根据技术水平、经济条件和使用目的进行选择，对于检测结果应参照临床症状和流行病学特征进行分析。
一、标本处理（一）粪便将1ml PBS加入至1.5ml EP管或2ml 螺口管中，再加入0.1g 固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清，制成10%的便悬液，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
注意便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中抑制物过多，影响核酸检测结果。
（二）肛拭子旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
（三）呕吐物臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min 离心30min，吸上清，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
（四）环境涂抹标本经旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
二、标本检测（一）核酸检测- 38 -1.核酸提取目前有多种商业试剂可用于粪便等标本的核酸提取，可用病毒RNA提取试剂，也可用RNA&DNA总核酸提取试剂，具体提取方法按照试剂说明书。
采用总核酸提取试剂，在使用逆转录聚合酶链反应扩增核酸时容易受到来自人、细菌等非目标物种基因的影响，产生假阳性，因此以RNA提取试剂为佳。
核酸提取完成后，尽快放入冰箱保存，如果3天内开展核酸检测，10℃以下保存即可，超过这个时间需放入-70℃冰箱保存。
注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、灰尘中含有的RNA酶降解，也不要反复冻融。
2．荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)本方法是诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-PCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。
诺如病毒感染-教师应知应会
诺如病毒消毒隔离措施（必看）根据卫生部《消毒技术规范(2002 年版)》，针对诺如病毒建议采取如下消毒隔离措施：1.物体表面的消毒：对经常接触的地方和物品如门窗、桌椅、水龙头、灯开关、地面等，用1000mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液喷洒或擦拭消毒，作用60min 后，再用清水清洗。
如患者将呕吐物排在教室环境中，应先用卫生纸覆盖在呕吐物上，将呕吐物用漂白粉（1升加50克）混合均匀，放置1小时后处理。
2.空气的消毒：加强室内的通风换气，每天定时通风换气1h~2h。
3.织物的消毒：被诺如病毒污染的患者被服与工作服，应立即更换，采用浓度为1000mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30min 后，清水清洗。
注意含氯消毒剂有漂白作用。
耐热、耐湿的织物也可煮沸消毒30min。
4.清洁用具的消毒：使用过的抹布、拖把采用浓度为2500mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30min 后，清水清洗。
未经消毒处理的抹布、拖把严禁拿到别处使用。
5.餐（饮）具消毒：首选煮沸消毒30 min，或流通蒸汽消毒30 min。
也可用250mg/L～500 mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30min 后，再用清水洗净。
6.勤洗手，注意个人清洁卫生：教育师生饭前便后用肥皂流动水彻底洗净双手。
必要时可用0.5%氯己定醇溶液消毒双手。
尤其食物加工者使用洗手间后和加工食物之前更应彻底洗净双手，防止污染食物或饮料。
7.注意个人防护：接触排泄、呕吐物时应戴外科口罩和手套，处理完毕应及时脱卸手套，避免戴有污染的手套触摸环境物表。
8.班级发现疫情及时向卫生室汇报诺如病毒感染性腹泻诺如病毒（Norovirus）是一组杯状病毒属病毒，其原型株诺瓦克病毒（Norwalk-like viruses）于1968年在美国诺瓦克市被分离发现，由于该组病毒极易变异，此后在其他地区又相继发现并命范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，主要发生在秋冬季，多发生在学校等人群聚集的单位，及时采取控制措施可避免疫情扩散。
诺如病毒实验室技术培训
去除重复、无效和不完 整数据，确保数据准确 性和一致性。
数据格式化
统一数据格式和单位， 便于后续数据处理和分 析。
数据归类
按照实验目的和要求， 对数据进行合理分类和 归档。
数据统计分析和可视化展示技巧分享
描述性统计
计算数据的均值、标准差、最大值和最小值等指标，了解数据分布 情况。
相关性分析
个人防护装备
实验人员应佩戴合适的防 护装备，如实验服、手套 、口罩和护目镜等，确保 个人安全。
安全设施配备
实验室内应配备生物安全 柜、通风橱、洗眼器等设 施，降低安全风险。
实验室安全操作规程
实验前准备
实验人员应了解实验原理、目的 和操作步骤，做好实验前准备工
作，确保实验顺利进行。
实验操作规范
实验人员应按照规定的操作步骤进 行实验，避免误操作导致安全事故 发生。
和腹痛等。
感染者还可能出现发热、头痛、 乏力等全身症状，严重时可能导 致脱水、电解质紊乱等并发症。
诺如病毒感染在幼儿、老年人和 免疫力较低的人群中危害更为严
重，可引起重症甚至死亡。
02
实验室安全规范
实验室安全防护措施
实验室分区管理
明确实验室各区域功能， 设立清洁区、半污染区和 污染区，并标识清晰。
RT-PCR操作步骤
包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、产物检测等 步骤。
3
RT-PCR操作注意事项
确保RNA质量、逆转录效率和PCR扩增的特异性 等。
结果判读标准与报告出具流程
结果判读标准
根据RT-PCR产物检测结果，制定相 应的判读标准，如CT值、扩增曲线 等。
报告出具流程
包括结果整理、报告撰写、审核签发 等环节，确保报告的准确性和规范性 。
诺如病毒实验室检测
诺如病毒实验室检测诺如病毒实验室检测诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。
NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。
诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。
2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。
诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。
诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。
诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。
诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。
诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V （GGV）各有1个基因群。
与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。
一、标本采集注意事项：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。
食品中诺如病毒检测 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品微生物学检验食品中诺如病毒检测1 范围本标准本标准规定了食品中诺如病毒的测定方法。
本标准适用于食品中诺如病毒总数的测定。
2 术语和定义2.1 实时荧光RT-PCR real-time fluorescence在普通RT-PCR的基础上加了一条特殊性的荧光探针。
该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2.2 C值 cycle thresholdt每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1无菌平皿，直径90mm；3.2无菌手术剪；3.3无菌镊子；3.4无菌50ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.5无菌85ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.6无菌胶头滴管；3.7无菌移液管，10ml；3.8移液枪，1-1000ul；3.9匀浆机；3.10超净工作台；3.11天平，精密度为0.01g；3.12高速冷冻离心机，10000g；3.13恒温摇床；3.14荧光定量PCR仪。
4 试剂4.1 含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，配制方法见A.1；4.2 PEG8000，配制方法见A.2；4.3 病毒RNA提取试剂盒；4.4 Nuclisens裂解液；4.5逆转录试剂盒；4.6荧光PCR定量试剂盒；4.7 缓冲液1×TAE，配制方法见A.3；4.8溴化乙锭（EB）溶液10ug/uL，配制方法见A.4；4.9琼脂糖凝胶，配制方法见A.5。
5 检验程序6 操作步骤6.1诺如病毒的富集6.1.1在无菌平皿中进行无菌取样，取食品5g，加入25ml含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，匀浆3min，为避免匀浆过程产生的高温破坏病毒，分两次匀浆，中间停顿1min。
诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测
二、采集要求
粪便、带便肛拭子和呕吐物 粪便可用便盒采集 肛拭子用采样棉签蘸生理盐水或病毒保存液、或PBS液
后，插入肛门4-5cm（幼儿2-3cm）处，轻轻旋转擦取 直肠表面带便粘液，置于含病毒保存液的采样管中。 呕吐物可注入灭菌容器内 采集的最优时间在发病后48-72小时内 采集量3g/3ml左右 采样时，如发现手套被污染应及时更换，采样容器外部 被污染时需独立包装，以避免样品间的交叉污染。 样本采集后，立即冷藏保存。
年龄，发病时间、采集时间等 附件8和附表8-1
二、厨工
食源性暴发溯源可采集厨工的粪便（最好） 或带便肛拭子标本
涉疫单位的厨工人数在30人以下，全部采样； 30人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位 的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等贝壳类海产 品加工，从事沙拉、凉菜、面包/糕点制作， 从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期 出现过胃肠不适症状的厨工，至少采集30人。
诺如病毒感染性腹泻 样品采集与检测
广东省疾病预防控制中心 （2015年11月25日）
主要内容
■不同类型标本的采集要求 ■样品采集、运输和保藏 ■诺如病毒检测方法及结果分析
原则 不同类型标本的采样原则
一、病例
根据初步流行病学调查的结果，尽量采集重点 病例：如首发病例/指示病例、住院病例、发病 厨工、重点岗位的病例等的标本；
呕吐物 置于漩涡震荡器充分混匀，4 ℃,≥5000r/min 离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清 ，立即检测或置-20℃冰箱保存备用。
标本检测——核酸检测
核酸提取（多种商业试剂，如Qiagen、罗氏等） 病毒RNA提取试剂（推荐） 病毒总核酸提取试剂
病毒性疾病标本采集、保存与检测
– 同种组织每一部位至少采集3份标本，1份用于病原学研究 （无菌采集），1份用于病理学研究（固定于福尔马林中）， 1份用于电镜检查（固定于电镜标本保存液中）
– 重要的组织器官应多部位同时采集标本
现场采样
• 媒介和动物标本
– 疑似虫媒传染病或动物源性传染病
现场采样
• 做好样品标记
现场采样
• 标本采集应严格按照相关生物安全规定进行 – 保护医务和疾控人员
• 血标本-血清
现场采样
– 需采集多份血清标本
– 至少
• 急性期（发病7d内或发现时）
• 恢复期（与急性期间隔2-3周）
– 分别采集外周静脉血各5ml～6ml，分离后的血清分装于3个塑料螺口血清管 中 • 一份0.5ml左右，用于即将监开测始病的种检测
在其诊疗和护理的医务人员和家属接触者中出现9 例病例，其中医务人员4例，家属5例。续发病 例具有首发患者呕出血液和其他分泌物暴露史
– 经检测确诊为嗜吞噬细胞无形体病。这是我国首次确认人粒细胞无形体病 – 此后山东、安徽、河南等省也相继有疑似无形体病报告
Zhang Lijuan, et al. JAMA 2008, 300(19): 2263-2270
– 2005年9月，湖北省咸宁市报告6例聚集性不明原因发 热病例，首发病例死亡，5为续发病例为首发病例的亲 属，发病前均有在护理首发病例过程中接触首发病例 呕出血液史。该起疫情也未能明确病原
背景 – 2006年11月，安徽省广德县报告10例聚集性发热伴血小板减少的病例，首 发病例死亡，诊断为“疑似流行性出血热”
– 特点
• 一般在标本采集、送达的当天或次日就可得到结果，这对于需要根据实 验室检测结果进行临床处置和尽早采取防控措施极为重要，但对标本的 要求也较高，病变部位标本的阳性结果比其它部位的阳性结果诊断意义 大得多
诺如病毒检验（食品微生物学检验）
诺如病毒检验（食品微生物学检验）食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验1范围本标准规定了食品中诺如病毒(N o r o v i r u s)的实时荧光R T-P C R检测方法三本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜二瓜二坚果等硬质表面食品,草莓二西红柿二葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测三2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1实时荧光P C R仪三2.2冷冻离心机三2.3无菌刀片或等效均质器三2.4涡旋仪三2.5天平:感量为0.1g三2.6振荡器三2.7水浴锅三2.8离心机三2.9高压灭菌锅三2.10低温冰箱:-80?三2.11微量移液器三2.12p H计或精密p H试纸三2.13网状过滤袋:400m L三2.14无菌棉拭子三2.15无菌贝类剥刀三2.16橡胶垫三2.17无菌剪刀三2.18无菌钳子三2.19无菌培养皿三2.20无R N a s e玻璃容器:见E.1.2三2.21无R N a s e离心管二无R N a s e移液器吸嘴二无R N a s e药匙二无R N a s e P C R薄壁管:见E.1.3三3试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无R N a s e超纯水:见E.2.1三3.1 GⅠ二GⅡ基因型诺如病毒的引物二探针:见A.1三3.2过程控制病毒的引物二探针:见A.1三3.3过程控制病毒:制备见附录C三3.4外加扩增控制R N A:制备见附录D三3.5 T r i s/甘氨酸/牛肉膏(T G B E)缓冲液:见E.2.2三3.65?P E G/N a C l溶液(500g/L聚乙二醇P E G8000,1.5m o l/LN a C l):见E.2.3三3.7磷酸盐缓冲液(P B S):见E.2.4三3.8氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5三3.9蛋白酶K溶液:见E.2.6三3.1075%乙醇:见E.2.7三3.11 T r i z o l试剂:见E.2.8三4检验程序诺如病毒检验程序见图1三图1诺如病毒检验程序5操作步骤5.1病毒提取注:样品处理一般应在4?以下的环境中进行运输三实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80?冰箱中,试验前解冻三样品处理和P C R反应应在单独的工作区域或房间进行三每个样品可设置2~3个平行处理三5.1.1软质水果和生食蔬菜5.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5c m?2.5c m?2.5c m的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)三5.1.1.2将样品小块移至带有400m L网状过滤袋的样品袋,加入40m LT G B E溶液(软质水果样品,需加入30U A.n i g e r果胶酶,或1140U A.a c u l e a t u s果胶酶),加入10μL过程控制病毒三5.1.1.3室温,60次/m i n,振荡20m i n三酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10m i n检测p H,如p H 低于9.0时,使用1m o l/LN a O H调p H至9.5,每调整一次p H,延长振荡时间10m i n三5.1.1.4将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管三10000r/m i n,4?,离心30m i n三取上清至干净试管或三角瓶,用1m o l/L H C l调p H至7.0三5.1.1.5加入0.25倍体积5?P E G/N a C l溶液,使终溶液浓度为100g/LP E G,0.3m o l/L N a C l三60s 摇匀,4?,60次/m i n,振荡60m i n三10000r/m i n,4?,离心30m i n,弃上清三10000r/m i n,4?,离心5m i n紧实沉淀,弃上清三5.1.1.6500μLP B S悬浮沉淀三如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中三加入500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5m i n三10000r/m i n,4?,离心15m i n,将液相部分仔细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三5.1.2硬质表面食品5.1.2.1将无菌棉拭子使用P B S湿润后,用力擦拭食品表面(<100c m2)三记录擦拭面积三将10μL 过程控制病毒添加至该棉拭子三5.1.2.2将棉拭子浸入含490μLP B S试管中,紧贴试管一侧挤压出液体三如此重复浸入和挤压3~4次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续R N A提取三硬质食品表面过于粗糙,可能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子三5.1.3贝类5.1.3.1戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类三5.1.3.2使用无菌剪刀二手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培养皿中三收集2.0g三5.1.3.3使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管三加入10μL过程控制病毒三加入2.0m L蛋白酶K溶液,混匀三5.1.3.4使用恒温摇床或等效装置,37?,320次/m i n,振荡60m i n 三5.1.3.5将试管放入水浴或等效装置,60?,15m i n三室温,3000r/mi n,5m i n离心,将上清液转移至干净试管,测定并记录上清液m L数,用于后续R N A提取三5.2病毒R N A提取和纯化注:病毒R N A可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒R N A提取纯化试剂盒三提取完成后,为延长R N A保存时间可选择性加入R N a s e抑制剂三操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换三提取出来的R N A立即进行反应,或保存在4?小于8h三如果长期储存建议-80?保存三5.2.1病毒裂解将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积T r i z o l试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5m i n,加入0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/m i n,离心5m i n,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层三5.2.2病毒R N A提取离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5m i n,12000r/m i n,离心5m i n,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三5.2.3病毒R N A纯化5.2.3.1每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤R N A沉淀2次三5.2.3.2于4?,12000r/m i n,离心10m i n,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀,室温干燥3m i n,不能过于干燥,以免R N A不溶三5.2.3.3加入16μL无R N a s e超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RN A,2000r/m i n,离心5s,冰上保存备用三5.3质量控制5.3.1空白对照以无R N a s e超纯水作为空白对照(A反应孔)三5.3.2阴性对照以不含有诺如病毒的贝类,提取R N A,作为阴性对照(B反应孔)三5.3.3阳性对照以外加扩增控制R N A,作为阳性对照(J反应孔)三5.3.4过程控制病毒5.3.4.1以食品中过程控制病毒R N A的提取效率表示食品中诺如病毒R N A的提取效率,作为病毒提取过程控制三5.3.4.2将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化R N A三可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的R N A量,-80?保存,每次检测时取出使用三5.3.4.3将10μL过程控制病毒的R N A进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用与诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒R N A 的C t值三5.3.4.4以未稀释和梯度稀释过程控制病毒R N A的浓度l g值为X轴,以其C t值为Y轴,建立标准曲线;标准曲线r2应?0.98三未稀释过程控制病毒R N A浓度为1,梯度稀释过程控制R N A浓度分别为10-1二10-2二10-3等三5.3.4.5将含过程控制病毒食品样品R N A(C反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值,代入标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度三5.3.4.6计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度?100%,即(C反应孔)C t值对应浓度?100%三5.3.5外加扩增控制5.3.5.1通过外加扩增控制R N A,计算扩增抑制指数,作为扩增控制三5.3.5.2外加扩增控制R N A分别加入含过程控制病毒食品样品R N A(H反应孔)二10-1稀释的含过程控制病毒食品样品R N A(I反应孔)二无R N a s e超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附录C反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值三5.3.5.3计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品R N A+外加扩增控制R N A)C t值-(无R N a s e超纯水+外加扩增控制R N A)C t值,即抑制指数=(H 反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三5.4实时荧光R T-P C R实时荧光R T-P C R反应体系和反应参数详见附录B三反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整三可采用商业化实时荧光R T-P C R试剂盒三也可增加调整反应孔,实现一次反应完成GⅠ和GⅡ型诺如病毒的独立检测三将18.5μL实时荧光R T-P C R反应体系添加至反应孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测GⅠ或GⅡ基因型诺如病毒三A反应孔:空白对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;B反应孔:阴性对照,加入5μL阴性提取对照R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5μL过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针; E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5μL10-1倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5μL10-2倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;G反应孔:病毒提取过程控制5,加入5μL10-3倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;H反应孔:扩增控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;I反应孔:扩增控制2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1μL 外加扩增控制R N A+1.5μL GⅠ或GⅡ型引物探针;K反应孔:样品1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针; L反应孔:样品2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针三6结果与报告6.1检测有效性判定6.1.1需满足以下质量控制要求,检测方有效:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳性对照(J反应孔)阳性三6.1.2过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率?1%;如提取效率<1%,需重新检测;但如提取效率<1%,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.1.3扩增控制(H~J反应孔)需满足:抑制指数<2.00;如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数;如10倍稀释食品样品扩增的抑制指数<2.00,则扩增有效,且需采用10倍稀释食品样品R N A 的C t值作为结果;10倍稀释食品样品扩增的抑制指数也?2.00时,扩增可能无效,需要重新检测;但如抑制指数?2.00,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.2结果判定待测样品的C t值大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;待测样品的C t值小于等于38时,判定为诺如病毒阳性;待测样品的C t值大于38,小于45时,应重新检测;重新检测结果大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;小于等于38时,判定为诺如病毒阳性三6.3报告根据检测结果,报告检出诺如病毒基因或未检出诺如病毒基因三附录A实时荧光R T-P C R引物和探针GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针见表A.1三表A.1GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置诺如病毒GⅠQ N I F4(上游引物):5 -C G CT G G A T GC G N T T CC A T-3 ;N V1L C R(下游引物):5 -C C TT A G A C GC C AT C AT C AT T T A C-3 ;N V G G1p(探针):5 -F AM-T G G A C A G G A G A Y C G C R A T C T-T AM R A-386位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376诺如病毒GⅡQ N I F2(上游引物):5 -A T G T T CA G RT G GA T G A G RT T CT C W G A-3 ;C O G2R(下游引物):5 -T C G A C G C C A T C T T C A T T C A C A-3 ;Q N I F s(探针):5 -F AM-A G C A C G T G G G A G G G C G A T G G-T AM R A-389位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100附录 B实时荧光R T -P C R 的反应体系和参数B .1 实时荧光R T -PC R 反应体系见表B .1三表B .1 实时荧光R T -P C R 反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/μL GⅠGⅡ过程控制病毒R T -P C R 缓冲溶液5?1?555M g S O 425mm o l /L 1mm o l /L 111d N T P s 10mm o l /L 0.2mm o l /L0.50.50.5正义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5反义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5逆转录酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5D N A 聚合酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5探针5μm o l /L 0.1μm o l /L0.50.50.5R N A 模板――555水(无R N a s e)――111111总体积――252525B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数见表B .2三表B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数步骤温度和时间循环数R T 55?,1h1预热95?,5m i n 1扩增变性95?,15s退火延伸60?,1m i n 65?,1m i n 45附录C过程控制病毒培养及引物二探针C.1概要本标准使用过程控制病毒进行过程控制,可使用门哥病毒或其他等效,不与诺如病毒交叉反应的病毒三门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒三门哥病毒株M C0是一种重组病毒,与野生型门哥病毒相比缺乏p o l y[C],是与野生型门哥病毒具有相似生长特性的无毒表型三门哥病毒株M C0是一种转基因生物,如果检测实验室不允许使用转基因生物,可以使用其他的过程控制病毒三也可使用商业化试剂或试剂盒中的过程控制病毒三C.2培养试剂和仪器C.2.1H e L a细胞推荐使用E a g l e最低必需培养液(E a g l e sm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m,M E M)培养,并将2m m o l/L L-谷氨酸和E a r l e sB S S调为1.5g/L碳酸氢钠,0.1mm o l/L非必需氨基酸,1.0mm o l/L丙酮酸钠, 1?链霉素/青霉素液,100m L/L(生长)或20m L/L(维持)胎牛血清三C.2.2仪器为确保细胞培养和病毒生长,需细胞培养所需的C O2浓度可调培养箱,细菌培养耗材(例如培养皿)等三C.3培养过程门哥病毒培养在铺满80%~90%单层H e L a(A T C C C C L-2T M)细胞中,置于50m L/LC O2的气氛中(开放培养箱)或不可调的气氛中(封闭培养箱),直至75%出现细胞病理效应三细胞培养器皿经过一个冻融循环,将培养物3000r/m i n离心10m i n三将细胞培养物离心上清留存用于过程控制三C.4引物二探针过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针见表C.1三采用其他等效的过程控制病毒,需对应调整引物探针三表C.1过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置门哥病毒M e n g o110(上游引物):5 -G C G G G TC C T G C CG A A A G T-3M e n g o209(下游引物):5 -G A A G T A A C A T A T A G A C A G A C GC A C A C-3M e n g o147(探针):5 -F AM-A T CA C AT T AC T GG C CG A AG C-MG-B N F Q-3100位于门哥病毒缺失毒株M C0(详见附录D)的110~209;相当于门哥病毒非缺失毒株M(G e n B a n k登录号122089)的序列110~270附录D外加扩增控制R N A制备1)D.1概要通过将目标D N A序列连接至合适的质粒载体上,目标序列位于R N A聚合酶启动子序列的下游序列,从而表达出外部扩增控制R N A三GⅠ型外部扩增R N A序列位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376三GⅡ型外部扩增R N A序列位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100三D.2试剂和设备D.2.1限制性酶:用于连接及相关的缓冲液三D.2.2 D N A纯化试剂三D.2.3体外R N A转录试剂(R N A聚合酶,N T P s,缓冲液等)三D.2.4 R N a s e-f r e eD N a s e三D.2.5 R N A纯化试剂三D.2.6 D N A凝胶电泳试剂和设备三D.2.7培养箱:37?三D.3质粒D N A连接添加100n g~500n g纯化的目标D N A和质粒载体加入含有合适的限制酶和缓冲液的反应体系中,限制酶和缓冲液的使用按照酶厂家推荐,并确保目标序列位于质粒中R N A聚合酶启动子序列的下游三37?培养120m i n三D N A纯化使用D N A纯化试剂纯化三使用凝胶电泳检查连接情况,比较连接前与连接后目标D N A和质粒情况三D.4外加扩增控制R N A的表达添加连接后的质粒至转化体系三该体系按照转化体系提供厂家建议配置三使用R N A纯化试剂纯化R N A后,分装,-80?储存,每次检测前取出备用三1)可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制R N A储备液,或者请生物公司代为制备三。
诺如病毒研究进展及一起邮轮诺如病毒感染疫情的实验室检测PPT教案
测的阳性率只有20%左右。固相免疫电镜的方法是将特异性抗体直接包被载网，同时加入蛋
白A增加抗体与标本中抗原结合的机会，从而提高检测的灵敏度。上述三种方法都要求观察
者具有丰富的经验，同时，精密的检测仪器、较大的劳动强度，都制约了该方法在NVs检
测中的应用。
免疫学检测（EIA）主要通过检测标本中的抗原来确认诺如病毒。该方法操作简
病毒：诺如，轮状，星状，腺病毒
细菌： 蜡样芽孢杆菌 ，产气荚膜梭菌，金黄色葡萄球菌 ，产肠毒素
型大肠杆菌
✓ 侵袭性病原体（Invasive microbes) :脓血便
细菌：大肠杆菌（侵袭性、致病性、出血性），沙门氏菌，空肠弯曲
杆菌，志贺氏菌，艰难梭菌
原虫：贾第鞭毛虫，溶组织内阿米巴
✓ 渗透性病原体（Penetrating microbes): 系统感染
Clusters differ by ≥ 20% amino
GI.7_Winchester
acid pairwise distance
GI.8_Boxer
GIII.1_Jena
Genogroups differ by 44-55%
GIII.2_CH126
GII.1_Hawaii
amino acid pairwise distance
单，实用性较强，便于推广。然而同样由于NVs型别的多样性，对该方法的应用产
察来寻找病毒。由于NVs病毒颗粒并不具备典型的杯状病毒特征，且粪便中病毒滴度通常
较低，给直接电镜观察带来了很大困难，通常要求病毒的滴度达到106/g才能达到检测要求。
免疫电镜的方法是将重悬离心分离得到的病毒颗粒与标准血清共孵育后再经负染后在镜下
观察来检测病毒。尽管这种方法可以较好地浓缩病毒颗粒，但灵敏度仍然较低，对NVs检
核酸标本检测实施方案范文
核酸标本检测实施方案范文本实施方案旨在规范核酸标本检测工作流程，保障检测结果准确性及工作人员及社会公众的安全。
一、标本采集1.1 核酸标本采集人员需经过专业培训，持有资质证书，并且需严格遵守操作规范。
1.2 核酸标本采集应在符合卫生标准的环境下进行，采集器具需经过严格消毒处理。
1.3 采集过程中应做好个人防护，避免交叉感染。
二、标本运输2.1 采集完成的标本需在规定时间内送达实验室，避免标本变质影响检测结果。
2.2 标本运输车辆及运输工作者需符合相关规定，并做好防护措施。
三、实验室处理3.1 实验室需具备相应的检测设备和资质，操作人员需持有相关资质证书。
3.2 实验室内部应严格区分不同标本，并严禁交叉污染。
3.3 实验室人员应做好个人防护，避免接触标本液体。
四、检测流程4.1 检测操作人员需按照标准操作程序进行，避免操作失误引起结果误差。
4.2 检测结果应由专业人员进行审核确认，确保结果准确性。
五、结果反馈5.1 检测结果需及时反馈给采样单位或个人，避免拖延造成不必要的风险。
六、废弃物处理6.1 废弃的标本管及其他医疗废弃物应按规定进行分类、处理和处置，避免对环境及他人造成危害。
七、其他7.1 核酸标本检测工作需遵循相关卫生法规和标准，确保工作的安全性和准确性。
7.2 如有相关疫情防控文件，需按文件要求执行核酸检测工作。
八、监督检查8.1 定期对核酸标本检测工作进行内部审核和外部监督，及时发现问题并采取措施。
8.2 对违反操作规范的人员及时进行处理，确保工作质量和安全。
以上为核酸标本检测实施方案，在工作中需严格按照实施方案执行，确保核酸检测工作的准确性和安全性。
九、应急预案9.1 针对实验室环境、设备、人员等突发情况，制定相应的应急预案，及时组织人员进行应急处置，避免事故发生及扩大。
十、信息保密10.1 严格遵守个人隐私和信息保密原则，确保检测结果及个人信息安全。
十一、员工健康管理11.1 实验室应建立并严格执行员工健康管理制度，对员工进行定期体检、健康监测，确保员工体检健康。
微生物样品处置方案模板
微生物样品处置方案模板一、背景在实验室和医疗机构中，经常进行微生物的检测和分离工作。
针对不同的微生物类型，也需要采取不同的处置方案，在处理微生物样品时需要注意以下事项：•避免交叉污染•遵守相关法律法规•防止微生物泄漏本文档旨在提供一个微生物样品处置方案模板，帮助工作人员在处理微生物样品时做到规范、科学、安全、高效。
二、微生物样品处置方案针对不同的微生物类型，可以确定不同的处置方案。
以下是一个常见的处置方案模板：1. 常规细菌样品处置方案1.1 样品处理1.液体培养基样品：在处理前需对标本进行标注，标注信息应包括标本名称、采集部位、采集日期等基本信息。
2.固体培养基样品：在处理前需按照样品来源、类型、特性、采集日期等信息编制标本清单。
1.2 微生物处理1.现场检测快速处理：对微生物样品进行涂片或直接荧光染色，检查结果直观明了。
2.传统处理——菌落计数方法–确认生长菌种合适的寿命、温度和环境。
–取适量菌液或菌落用适量生理盐水混合制成细胞悬液。
–调制混合物用于稀释组织和液体样品。
2. 病毒样品处置方案2.1 样品处理1.标本采集前应了解病毒信息及传送方式、采集方法、储存条件等方面知识。
2.样本采集应做好标记标识，标注项目应涵盖样品名称、采集日期、采集人员等信息。
2.2 微生物处理1.试验室卫生管理：每日检查实验室洁净度，养护实验室设备，并做好实验室人员口罩、手套的配给、更换和消毒工作。
2.样本制备：对于敏感病毒样品，应优先选择生命科学级别氧環类气体封装系统处理。
3. 真菌样品处置方案3.1 样品处理1.真菌样品采集应选择在接触气氛污染少的空气处理间内完成，避免接触到有害微生物和其他污染源。
2.对于带有真菌的样品，在处理前应当将其分开贮存，并加外包装，避免样品污染，标注样品名称、时间等信息。
3.2 微生物处理1.样品制备：选用光学显微镜观察菌落的生长，确保识别有相关基础的实验员上岗工作；切勿将真菌种类混在一起制作。
样本采集与实验室分析-2014
结果的报告与分析
实验室检测结果是确定病因的重要依据，但实 验室结果要和现场调查情况、患者的临床表现 一起分析，才能确定病因。
五、案例分析
2010年9月8日起，四川某高职学院陆续 有学生发病，症状以腹痛、腹泻为主， 部分学生伴恶心、呕吐，个别有发热等 症状并到本校医院进行治疗,疾病预防控 制中心疫情处理人员于9月15日接到报告 后赶赴现场调查和采样。
四、结果的报告与分析
结果的报告与分析
检验结果的正确性不仅取决于实验室的条件 和技术水平，同时还与检验样品的采集、保 存、送样方法等方面有关。因此在分析检验 结果时，除了应考虑结果是否符合有关实验 室判定标准外，还应综合考虑各种影响检验 结果的因素。
结果的报告与分析
阳性结果不一定能说明病原因子在爆发事件 中的致病作用；反之阴性结果也不一定能完 全否定某种病原因子的病因假设.
共同商定分析方案：现场工作人员或临床医务工作者 要和实验室分析人员多沟通，对现场情况、所收集样本 的情况、现场工作的方向等进行讨论，确定应该检验的 毒物种类以及是否需要定量，据此制定实验室检测工作 方案。
一、标本采集
（1）及时性原则 （2）针对性原则 （3）适量性原则 （4）不污染原则
规范采样是获得可靠检测结果的重要保证
样本采集方案与检测人员沟通，便于实验室分析处理。
共同商定分析方案：现场工作人员或临床医务工作者 要和实验室分析人员多沟通，对现场情况、所收集样本 的情况、现场工作的方向等进行讨论，确定应该检验的 毒物种类以及是否需要定量，据此制定实验室检测工作 方案。
三、实验室检验
检什么
毒素检测 病原分离
细菌 病毒 寄生虫 血清学检查 抗原 抗体 急性期IgM抗体 急性期和恢复期双份静脉血测定特异性IgG抗体。 核酸检测 特征基因、毒力基因、溯源比较 定性/定量
诺如病毒消毒方法.doc
附件2诺如病毒消毒方法一、病人呕吐物、粪便用一次性吸水材料（如纱布、抹布等）沾取5000mg/L～10000mg/L的含氯消毒液完全覆盖污染物，小心清除干净。
清除过程中避免接触污染物，清理的污染物按医疗废物集中处置，或用含有效氯5000mg/L消毒剂溶液浸泡消毒30min后处理。
厕所马桶或容器内的污染物，可小心倒入足量的5000mg/L～10000mg/L 的含氯消毒液，作用30min以上，排入有消毒装置的污水处理系统。
清洁中使用的拖把、抹布等工具，盛放污染物的容器都必须用含有效氯5000mg/L消毒剂溶液浸泡消毒30min后彻底冲洗，才可再次使用。
厕所、卫生间的拖把应专用。
二、地面、墙壁及物体表面用于消毒地面、墙壁及物体表面的消毒液，应含有效氯1000mg/L。
有肉眼可见污染物时应先清除污染物再消毒。
无肉眼可见污染物时，家具和生活设施用消毒液进行浸泡、喷洒或擦拭消毒，作用30分钟后用清水擦拭干净。
墙壁可直接用消毒剂按100mL/ m2～300mL/ m2用量擦拭或喷洒消毒。
地面消毒先由外向内喷洒一次，喷药量为100mL/ m2～300mL/ m2，待室内消毒完毕后，再由内向外重复喷洒一次。
消毒作用时间应不少于15 分钟。
三、衣物、被褥等织物收拾被污染的衣物、被褥等织物时应避免产生气溶胶。
先将固体污秽物移除后浸在有效氯为500mg/L的含氯消毒剂溶液内30分钟，然后清洗。
也可用流通蒸汽或煮沸消毒30分钟。
若不能即时消毒，应把它们放置在密封的袋内，并尽快处理。
四、食品用具餐（饮）具和食品加工工具清除食物残渣后，煮沸消毒30分钟，也可用有效氯为500mg/L含氯消毒液浸泡或擦拭，作用30分钟后，再用清水洗净。
五、皮肤、粘膜皮肤被污染物污染时，应立即清除污染物，然后用一次性吸水材料沾取0.5%碘伏消毒液擦拭消毒3 分钟以上，使用清水清洗干净；粘膜应用大量生理盐水冲洗或0.05%碘伏冲洗消毒。
六、医疗废物患者产生的生活垃圾、一次性诊疗用品采用双层医疗废物袋，按医疗废物集中收集处置。
病毒标本收集与处理
病毒标本收集与处理用于分离或检测病毒及其核酸的标本应尽可能在发病的初期、急性期采集，越早越能提高病毒的阳性检出率。
疾病的后期，由于机体产生免疫力，病毒数量减少或消失，不易检出。
同时病毒感染的晚期常并发细菌性感染，增加了判断的困难。
（一）接种标本标本接种前，必须进行适当的处理，其目的是除去标本中的杂质和杂菌，以及将病毒释放出来，以利于检测或保存。
常用的方法是高速离心法，如人乳头瘤病毒的临床标本的处理方法为：用刮板或生理盐水侵润的棉棒从阴道和宫颈外口去分泌物和细胞，将标本放入5ml还有0.05%硫柳汞的PBS中，细胞悬液提取DNA用于检测病毒。
还可加抗生素处理，检测单纯疱疹病毒时标本须注入病毒运送液中用于病毒分离或置-70℃冰箱保存。
如用血清或血浆标本应注意避免溶血，如为血浆标本要合理选择抗凝剂，标本为全血时，须及时分离出血浆。
组织标本须先加入无菌生理盐水或缓冲液，在研磨器中充分研磨，若为结缔组织应加入适量铝氧粉，以便将病毒释放出来，制成悬液，经离心后接种。
（二）取材部位取材部位也是决定分离成功与的关键。
呼吸道感染最重要的取材部位是咽部，用棉花拭子在鼻咽部檫拭或取鼻咽分泌物。
肠道感染通常取粪便标本。
全身形感染一般取全血，疾病早期也是病毒血症期，白细胞内通常可查出病毒。
其他标本也是病毒分离的理想材料。
根据感染的特点，选择相应部位采集标本，可采集血液、脑脊液、粪便、含漱液、尿液和咽、喉拭子等。
由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送中注意冷藏。
处理标本时应考虑病毒的特性，如有包膜病毒冻融易灭活。
一些病毒如麻疹病毒吸附在白细胞上，因此，血液应加抗凝剂。
（三）一般要求采集标本要求做到下面4个字：1.早特别是对病毒分离、抗原或核酸检测。
2.近用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位（如脑炎取闹脊液，腹泻取粪便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液）。
3.多标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本，在病程急性期和恢复期都取标本。
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附件4诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。
Real-time RT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。
用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。
在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。
食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。
一、标本前处理1.粪便、呕吐物1.1设备和材料微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5 ml无菌离心管、10 mM pH 值为7.0－7.4的PBS。
1.2 操作方法（1）离心管每管分装0.5 mlPBS。
用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 g），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪便悬浮液。
当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500 µl的样品。
（2）漩涡振荡每个样品1 min。
在2 400 g下离心5 min，使得固体沉淀。
澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于－70℃。
（3）取澄清的上清液200 µl进行RNA提取。
2.水通过阴离子滤膜过滤水样品。
用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05 M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。
使用Microsep 100TM 或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。
2.1设备和材料DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、Millipore HA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100 K columns（PALL公司）、Centriprep YM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、氯仿、丁醇。
2.2操作方法2.2.1过滤装置准备（1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有3层，型号分别为Millipore HA filter、AP15和AP20，放置顺序为Millipore HA filter →AP15 →AP20。
注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下。
所有的玻璃器皿应干净无菌。
每批水样使用不同的漏斗。
（2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。
（3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。
（4）真空泵连接1 000 ml的锥形瓶。
注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。
（5）向滤器中倒入20 ml无菌水（DEPC水）检查滤膜的密封情况。
（6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。
2.2.2 水样品的过滤（1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。
（2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。
2.2.3 用酸漂洗滤膜将膜用无菌的镊子夹放在有200 ml0.05 mM H2SO4（pH3.0）的无菌500 ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。
2.2.4 洗脱（1）将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml 洗脱液。
盖上铝箔。
注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。
（2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速0.01g（45rpm），室温（23℃± 3℃），15min。
（3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。
2.2.5 中和洗脱液用1 N HCl或1 N NaOH调整洗脱液的pH到7.0－7.4。
检测前，洗脱液在－70℃储藏。
2.2.6 二次浓缩方法一：用Microsep 100 K columns或Centriprep YM-50浓缩病毒（1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。
（2）将水标本滤膜洗脱液（大约5 ml）加入到浓缩柱中，2 400 g离心5 min。
（3）吸取浓缩液（约150 µl），转移至1.5 ml离心管中。
方法二：PEG沉淀（1）向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3 mol/L（若洗脱液为5ml加0.08775g的NaCl）, 有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5％（w/v）（若洗脱液为5 ml，加0.0625g的PEG-6000。
4 ℃过夜。
（2）4 ℃，9 600 g离心30 min，收集沉淀；（3）Millipore HA filter，倾倒并弃掉上清液。
每个离心管添加150－500 µl pH7.2（±0.2）PBS重悬沉淀物。
将离心管放置在离心管架上，为更好的让缓冲液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。
室温放置30 min。
注意：如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。
吹打过力会产生气泡。
（4）向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇（1:1 vol/vol）混合。
去除病毒悬液中的抑制剂。
（5）4 ℃，9 600 g，离心20 min。
（6）分离出水相（上清液），－80℃储藏。
（7）取200 µl上清液进行核酸提取。
3.环境涂抹样将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面（最大面积100 cm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中，将棉签用力压EP管的侧壁，释放棉签中的液体。
重复浸入和压侧壁的步骤3~4次，确保病毒最大释放量，直接进入核酸提取步骤。
4.食品4.1贝类4.1.1设备和材料:诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、高速离心机（可离心15ml~50 ml体积）、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实时荧光定量PCR检测系统、眼科剪、眼科镊、一次性无菌培养皿、恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器（LX134MO）、一次性研磨杵（上海生工）、15 ml去RNAase离心管、1.5 ml 去RNAaseEppendorf 管、20 µl、200 µl、1 000 µl微量移液器、 PBS溶液 pH7.2 （Gebico）、蛋白酶K（PCR级 Roche）。
4.1.2 贝类样品处理程序采集贝类样品，进行解剖，剪取消化腺和肠道后均质，最后提取RNA。
4.1.3 解剖方法5个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。
如果一件样品的消化腺和肠道的总质量不够2.0 g，应适当增加取样量，使得每件样品检验的总质量达到2.0 g。
（1）牡蛎的解剖方法使用灭菌的刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌的眼科剪和眼科镊，先将牡蛎的内脏部分剪取下来放到一个灭菌的平皿里，沿肠道将牡蛎软体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余的组织去掉，取其消化腺和肠道用于检测。
牡蛎的解刨过程及解剖结构见（2）海虹用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镊子直接夹下，同时尽量将肠道取下。
由于海虹的消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样的海虹个体数，以使得总质量达到2.0 g，用于后续的检测。
（3）扇贝、毛蚶与文蛤扇贝与毛蚶的解剖结构与海虹相似，参照海虹的方法将壳打开后，直接判断消化腺所处的位置，用眼科镊和眼科剪，将其消化腺和肠道取下用于诺如病毒的检测。
文蛤的消化腺包在内脏团里，在解剖时可以直接用镊子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下，同时将肠道取出，用于检测，文蛤的消化腺体积较小，需要适当增加取样量以满足检验的要求。
4.1.4均质将上述解剖下的消化腺和肠道放到50 ml灭菌的小烧杯内，用电磨均质器（LX134MO）将消化腺仔细打碎，成糊状。
4.1.5蛋白酶K消化将上述均质的消化腺，分别称取2.0±0.1g，加入15 ml的离心管，然后每管加入2 ml 的PBS溶液，加入20 mg/ml蛋白酶K（Roche）溶液10 µl进行消化，另外取1件样品加入诺如病毒的阳性质控球，作为外部质控阳性对照。
4.1.6将上述样品于摇床37℃，0.57g（320rpm）振荡1h。
恒温水浴60℃，保持15min；将15ml离心管，3000g离心5min，取200µl用于RNA的提取，剩余部分冷冻保存，用于复检。
4.2三文鱼4.2.1设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食品均值器、天平：感量0.1 g、高速低温离心机（4 ℃，10000 g）、5×PEG8000/NaCl溶液（PEG8000 500±2g，NaCl 87±1g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121℃，15min灭菌）、磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE）( Tris base 12.1±0.2g,甘氨酸 3.8±0.1g，牛肉膏10±1.0g，蒸馏水1000±1ml，121℃，15min灭菌)、氯仿/正丁醇（1:1体积比）溶液。
4.2.2 样品处理程序及方法（1）取三文鱼样品25 g，剪碎后置于带滤网的均质袋中，加人TGBE缓冲液40 ml，均质均匀，于室温60 r/min震荡20 min。
（2）取滤液至50 ml新的离心管中，4 ℃，10000 g离心30 min。
（3）取上清液（小心避开液体表面的油脂层），加入上清液1/4体积的5×PEG/NaCl 溶液，颠倒60 s，4 ℃，60 r/min震荡60 min。
（4）将上述溶液于4 ℃，10000 g离心30 min，弃去上清液。
向沉淀物中加入PBS溶液700 µl，震荡重悬。
（5）加入与上述重悬液等体积的氯仿/正丁醇（1:1）溶液，充分振荡，室温孵育5 min。
于4 ℃，10000 g离心15 min。
（6）取上层水相液体200 µl用于提取病毒RNA。
4.3草莓、蓝莓4.3.1 设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、PEG8000（Polyethylene glycol）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸二氢钾（KH2PO3）、磷酸氢二钠（Na2HPO3）、NaOH溶液（5M）、HCl溶液（1M）、纯水（Milli Q系统净化）、氯仿（Methenyl trichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（Beef Extract）、甘氨酸（Glycine）、蛋白酶K（Proteinase K）、果胶酶（Pectinase from Aspergilus niger，Sigma）、5×PEG/NaCl缓冲液（PEG8000 500±2 g，NaCl 87±1 g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121℃，15min灭菌）、TGBE缓冲液( Tris base 12.1±0.2 g,甘氨酸 3.8±0.1 g，牛肉膏10±1.0 g，蒸馏水1000±1 ml，121 ℃，15 min灭菌)、DHZ-D型冷冻恒温振荡器、FE20K型酸度计、小型高速离心机、CR22E型高速冷冻离心机。