发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
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《发酵工程》课程教学大纲
《发酵工程》课程教学大纲
课程名称：发酵工程课程类别：专业选修课
适用专业：食品科学与工程考核方式：考察
总学时、学分： 32 学时、2 学分
一、课程教学目的
发酵工程是整个生物技术的核心，是工业微生物实现试验室与工厂化生产的具体操作，是生物技术在生产实践中应用的原理及方法的一局部，是基因工程及酶工程等生物技术工业化的过程与方法。因此，通过对《发酵工程》的学习，不仅把握发酵工程原理及发酵优化把握过程，而且对系统了解生物技术及其工业化应用都具有深远的意义。另外，通过《发酵工程》试验及发酵工程各论的了解，不仅能够把握发酵工艺操作从小试到放大的具体过程及反响过程把握方法，而且进一步了解了目前发酵行业的具体产品生产工艺，从理论到方法学会发酵工程这一门技术，对发酵生产能够进展指导与分析。
二、课程教学要求
通过本课程的教学，应使学生把握发酵工程学的根本学问和根本技能，了解现代生物工程技术的进展与应用状况，具备确定的微生物生产工程技能。通过本课程的学习，使学生深刻理解发酵工程的微生物学原理，结实把握发酵工业菌种的筛选、驯化、培育与保藏，好氧、厌氧发酵工艺的调控与治理，了解发酵产品提取与精制的原理、流程及常见发酵产品的生产过程。
三、先修课程
食品微生物学、生物化学。
四、课程教学重、难点
重点：发酵工程的概念、特点；工业微生物菌种的退化、复壮与保藏；工业上常用作碳源、氮源的原料；淀粉水解糖的制备方法；微生物对培育基中的碳源代谢；酒精发酵机制；好氧发酵罐构造和功能；温度、 pH 和泡沫对发酵过程的影响；不同时间及染菌程度对发酵的影响；种子、空气、培育基和设备染菌及防治；细胞裂开方法及
生物工艺学第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏
生物工艺学第二章工业微生物 菌种选育、制备与保藏
目
CONTENCT
录
• 引言 • 工业微生物菌种选育 • 工业微生物菌种制备 • 工业微生物菌种保藏 • 案例分析 • 结论与展望
01
引言
主题概述
工业微生物菌种选育、制备与 保藏是生物工艺学中的重要章 节，主要涉及微生物菌种的筛 选、培养、改良和保存等方面 的知识。
100%
选育流程
从自然界中采集样品，分离纯化 菌株，进行培养和筛选，最终确 定优良菌株。
80%
应用范围
适用于传统发酵工业和自然环境 中存在的微生物。
诱变育种
选择标准
选择具有高产、高稳定性、高 耐受性等优良性状的突变菌株 。
选育流程
利用诱变剂处理微生物，诱发 基因突变，通过筛选和培养， 获得具有优良性状的突变菌株 。
微生物菌种是生物工业的重要 资源，具有生长速度快、代谢 能力强、易培养等特点，广泛 应用于食品、医药、农业、环 保等领域。
本章节将介绍微生物菌种选育 的基本原理和方法，以及制备 和保藏过程中的关键技术。
重要性及应用
微生物菌种选育是生物工艺学中的关键环节，对于提高微生物产品的产量 和质量具有重要意义。
某菌种制备案例
总结词
通过深层发酵技术，实现某菌种的规模化制备
详细描述
利用深层发酵技术，某实验室实现了某菌种的规模化制备。通过优化培养基配 方和发酵条件，提高了菌种的生长速率和产物产量，为该菌种在工业生产中的 应用奠定了基础。
目
CONTENCT
录
• 引言 • 工业微生物菌种选育 • 工业微生物菌种制备 • 工业微生物菌种保藏 • 案例分析 • 结论与展望
01
引言
主题概述
工业微生物菌种选育、制备与 保藏是生物工艺学中的重要章 节，主要涉及微生物菌种的筛 选、培养、改良和保存等方面 的知识。
100%
选育流程
从自然界中采集样品，分离纯化 菌株，进行培养和筛选，最终确 定优良菌株。
80%
应用范围
适用于传统发酵工业和自然环境 中存在的微生物。
诱变育种
选择标准
选择具有高产、高稳定性、高 耐受性等优良性状的突变菌株 。
选育流程
利用诱变剂处理微生物，诱发 基因突变，通过筛选和培养， 获得具有优良性状的突变菌株 。
微生物菌种是生物工业的重要 资源，具有生长速度快、代谢 能力强、易培养等特点，广泛 应用于食品、医药、农业、环 保等领域。
本章节将介绍微生物菌种选育 的基本原理和方法，以及制备 和保藏过程中的关键技术。
重要性及应用
微生物菌种选育是生物工艺学中的关键环节，对于提高微生物产品的产量 和质量具有重要意义。
某菌种制备案例
总结词
通过深层发酵技术，实现某菌种的规模化制备
详细描述
利用深层发酵技术，某实验室实现了某菌种的规模化制备。通过优化培养基配 方和发酵条件，提高了菌种的生长速率和产物产量，为该菌种在工业生产中的 应用奠定了基础。
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
化学化工学院
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
新种分离与筛选的步骤
（四）筛 选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过 三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业 生产用菌种。
李 先 磊
化学化工学院
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
三、发酵工业微生物菌种的 分离和选育
（一）微生物菌种的分离 （二）微生物菌种的选育
李 先 磊
化学化工学院
（一）微生物菌种的分离
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
自然界获得的微生物样品通常都是许多种微生物 共存，必须把目标菌种与杂菌分开，才能用于生 产。目前进行微生物分离的方法主要包括两个： 1. 施加选择性压力分离法 2. 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的 方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
李 先 磊
化学化工学院 植物体采集方法
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀
片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意 不要损伤周围边缘。 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶 上的取样部位。 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。 将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土 样一起保存。
【发酵工程】第二章_发酵工业菌种
复筛
在初筛的基础上进一步鉴定菌株生产能力的筛 选。 一般采用摇瓶培养，发酵液进行精确的分析、 测定。
初筛
样品
目的菌株
复筛
高产野生型菌株
野生型菌株: 从自然界样品中分离得到的具有一定
生产性能的菌株。
菌株分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 生长特征独特 选择性分离 无选择性特征 根据产物的特征 随机分离
3、酵母菌（单细胞真核微生物）
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属 汉逊酵母属
生产酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等
4、霉菌（单、多细胞真核微生物）
曲霉属
米曲霉 黑曲霉 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 紫红曲霉
培养后，在数量上占优势。
分离：利用分离技术得到纯种。 菌种的筛选：通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能
力较高的菌株。
发酵性能测定： 进行生产性能测定。这些特性包括形态、培
养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、 耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适 pH 值、提取工艺等。
A
μ
B
发酵工程 (第2章)
（二）微生物菌种的选育
1、自然选育 不经过人工处理，利用微生物自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育。 自然选育简单易行，可以达到纯化菌种，防 止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。 自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液， 用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测 定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。
把诱变处理后的细胞接种在含有微量（＜ 0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞
就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长
成小菌落。若需获得某一特定营养缺陷型，可再在
基本培养基中加入微量的相应物质。
(3)影印平板法
可以将诱变后的菌液稀释后接种在完全培养基上，使之形 成单株菌落，然后将菌落分别影印到基本培养基和完全培养基 上继续培养，那些在基本培养基上不能生长的菌落就是营养缺 陷型菌株的菌落，到完全培养基的相应位置就可以得到营养缺 陷型菌株。 营养缺陷型不长
原理二(p22)：
生物体中都存在两个以上的DNA修复基因，如
果一个DNA修复基因损伤或变异，通常仍能存活，
但对能引起DNA损伤的化合物十分敏感，易发生
死亡，所以可以利用DNA修复能力突变株筛选抗
肿瘤药物。 实践中常使用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的重 组缺失DNA修复基因突变株和亲株作为测试菌来 筛选抗肿瘤药物。
（2）抗肿瘤药物产生菌的分离。 原理一（p21）： 临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或 抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核 酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以大 部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利 用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。 <1> 生化诱导分析法（BIA） <2> SOS显色法
发酵工程原理与技术课件
•发酵工程原理与技术
•2
微生物的特性及工业微生物的要求
工业化菌种的要求
利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强 遗传性能要相对稳定不易变异和退化，不产生任何有 害的生物活性物质和毒素
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）
•发酵工程原理与技术
•48
C.glutamicum的代谢调节与赖氨酸生产
天冬氨酸AK 天冬氨酸 磷酸
HSDH
天冬氨酸 高丝氨酸 半醛
赖氨酸
苏氨酸
甲硫 氨酸
为反馈抑制
为阻遏
AK：天冬氨酸激酶 HSDH：高丝氨酸脱氢酶
•发酵工程原理与技术
•49
营养缺陷型的筛选
淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
•发酵工程原理与技术
前进
•50
淘汰野生型
原因： 营养缺陷型的比率很低，只有百分
之几到千分之几，淘汰为数众多的
野生型菌株，可达到“浓缩” 营养 缺
陷型的目的
方法：抗生素法或菌丝过滤法
•发酵工程原理与技术
返回
•51
抗生素法
原理：抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，在基本培 养基上加抗生素，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不 死，从而来浓缩营养缺陷型
•发酵工程原理与技术
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
放线菌
• 放线菌（actionmycetes）：原核微生物类群。 在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。
主要用于生产多种抗生素。
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
分子育种
（一）自然选育
定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，利 用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过 程，叫做自然选育或自然分离。
自然选育的菌种来源：自然、菌种保藏机构或生产过程。
采
样
增殖培养
纯种分离
纯培养 生产性能测定
方法、地点、时间和周围环境记录
纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落： 1．稀释分离法 2．平板划线分离法
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
第二节 工业发酵生产菌种来源
发酵工业符合要求的菌种可从如下途径获得： （1）从自然界分离筛选。 （2）从菌种保藏机构或科研院所获得。 （3）从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变
放线菌
• 放线菌（actionmycetes）：原核微生物类群。 在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。
主要用于生产多种抗生素。
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
分子育种
（一）自然选育
定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，利 用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过 程，叫做自然选育或自然分离。
自然选育的菌种来源：自然、菌种保藏机构或生产过程。
采
样
增殖培养
纯种分离
纯培养 生产性能测定
方法、地点、时间和周围环境记录
纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落： 1．稀释分离法 2．平板划线分离法
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
第二节 工业发酵生产菌种来源
发酵工业符合要求的菌种可从如下途径获得： （1）从自然界分离筛选。 （2）从菌种保藏机构或科研院所获得。 （3）从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变
发酵工程 第二章 工业微生物的生长和产物合成
（一）菌体营养细胞的分化
1、在某些条件下，微生物细胞形态受培养基组成的控制： 如成晶节杆菌在葡萄糖-盐培养基上生长时，细胞呈球状， 并继续分裂为球状；如果在上述培养基中加入蛋白胨或有 机酸（苹果酸、柠檬酸）或氨基酸（精氨酸、赖氨酸或苯 丙氨酸）时，菌体呈杆状，生长速度加快。 球状和杆状成晶节杆菌细胞壁中肽聚糖的变化：1）杆状 体的肽聚糖有更多的交联；2）球状体细胞壁肽聚糖的肽 键之间的连接物有甘氨酸，杆状体细胞没有；3）球状体 肽聚糖的多糖主干长度为20nm，而杆状体细胞多糖主干 长度为球状体的3倍。 2、质粒控制的细胞分化：放线菌、链霉菌等丝状体菌 质粒游离 移入染色体片段
前体：可被菌体直接并入次级代谢 产物分子中，而自身结构无明显改 变的物质。
有的作为次级代谢产物的前体， 有的经过微生物修饰后作为特 殊前体
三、次级代谢产物合成的基本过程
构建单位：聚酮体、甲羟戊酸、糖类和氨基糖、不常见 的氨基酸（非蛋白质氨基酸）、环多醇和氨基环多醇、 非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱
合成次级代谢产物的前体合成之后，这些前体就 被引进途径特殊的次级代谢产物生物合成途径中，经 过聚合等反应形成次级代谢产物。这些构建单位可缩 合成聚酮体、寡肽、聚乙烯等，这些特殊的产物再经 过多种多样的修饰，最终形成次级代谢产物分子。
土层越深， 细菌数量 越少。 10-20cm处
菌落数与空气清洁度的关系
发酵工程2(菌种选育)
当代并不表现出来, 在筛选时就会被淘汰; 若突变性状是显
性的, 那么, 在当代就表现出来, 但在进一步传代后, 就会
出现分离现象, 造成生产性状衰退, 因此，应尽可能选择孢
子或单倍体的细胞作为诱变对象。
即使如此, 有时也会出现表型延迟现象, 这是因为诱变
剂往往只作用于DNA分子的一条单链，DNA 进一步复制后,
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化 合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多， 如一些野果生长区和果园内。 纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的 森林土； 淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等 场所的土壤； 蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附 近污泥等。
这些菌株的特点是它们的酶系统完整, 染色体
或DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是
它们能在大自然中生存的原因), 通过诱变育种,
它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变)的
可能性大。
②经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状, 对生产环境有 较好的适应性, 正突变的可能性也很大。 ③经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤,某些生理功 能或酶系统有缺损, 产量性状已经达到了一定水平， 它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变)的 可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
施加选择性压力分离法 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
⑤ 抗噬菌体和杂菌的能力强； ⑥ 遗传性状稳定，不易变异退化； ⑦ 在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系
数、提高单产量、降低成本有重要意义； ⑧ 对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将
这些前体作为一般碳源使用； ⑨ 不是病原菌，而且在系统发育上与病原菌无关，
不产生任何有害的生物活性物质。 ⑩ 具备以上条件的微生物才能保证发酵产品的质量
和产量。
二、发酵Βιβλιοθήκη Baidu业常用微生物菌种及要求
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
⑤ 抗噬菌体和杂菌的能力强； ⑥ 遗传性状稳定，不易变异退化； ⑦ 在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系
数、提高单产量、降低成本有重要意义； ⑧ 对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将
这些前体作为一般碳源使用； ⑨ 不是病原菌，而且在系统发育上与病原菌无关，
不产生任何有害的生物活性物质。 ⑩ 具备以上条件的微生物才能保证发酵产品的质量
和产量。
二、发酵Βιβλιοθήκη Baidu业常用微生物菌种及要求
发酵工程原理与技术
流加发酵是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。
发酵产品及分离提纯工艺
固液分离技术、细胞破碎技术、浓缩分离技术、精制技术、结 晶技术等
四、发酵工程的发展历史
发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗 菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵） →基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规 模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物
二、发酵工业常用微生物菌种及要求 （一）发酵工业对菌种的要求 1、能在廉价原料制备的培养基上迅速生长并生 成所需的代谢产物，且产量高； 2、培养条件易于控制； 3、生长迅速，发酵周期短； 4、满足代谢控制的要求； 5、抗噬菌体和杂菌能力强；
二、发酵工业常用微生物菌种及要求
（一）发酵工业对菌种的要求
4、霉菌（mould） 霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养基质 上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉 子囊菌纲：红曲霉 半知菌类：曲霉，青霉。
5、担子菌（Basidiomycetes） 担子菌是会产生担子和担孢子的真菌。 担子菌主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。
控制不同的pH条件，可分离出嗜酸和嗜碱微生物
使用高糖或高盐培养基进行培养，可获得耐高渗透 压的微生物
控制培养基的各种营养成分（如使某种碳源、氮源 成为唯一的碳源、氮源），可使能利用此种营养的 微生物富集，从而大量获得
发酵产品及分离提纯工艺
固液分离技术、细胞破碎技术、浓缩分离技术、精制技术、结 晶技术等
四、发酵工程的发展历史
发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗 菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵） →基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规 模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物
二、发酵工业常用微生物菌种及要求 （一）发酵工业对菌种的要求 1、能在廉价原料制备的培养基上迅速生长并生 成所需的代谢产物，且产量高； 2、培养条件易于控制； 3、生长迅速，发酵周期短； 4、满足代谢控制的要求； 5、抗噬菌体和杂菌能力强；
二、发酵工业常用微生物菌种及要求
（一）发酵工业对菌种的要求
4、霉菌（mould） 霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养基质 上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉 子囊菌纲：红曲霉 半知菌类：曲霉，青霉。
5、担子菌（Basidiomycetes） 担子菌是会产生担子和担孢子的真菌。 担子菌主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。
控制不同的pH条件，可分离出嗜酸和嗜碱微生物
使用高糖或高盐培养基进行培养，可获得耐高渗透 压的微生物
控制培养基的各种营养成分（如使某种碳源、氮源 成为唯一的碳源、氮源），可使能利用此种营养的 微生物富集，从而大量获得
生物技术制药 第二章 发酵工程 ppt课件
ppt课件
29
1.藻状菌纲：根霉；犁头霉 2.子囊菌纲：酵母 3.担子菌纲：牛肝菌，灵芝 4.半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶
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二、生产菌种的选育
工业化菌种的要求 1.遗传性能要相对稳定 2.生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体 3.目标产物产量接近理论转化值 4.目标产物分泌到胞外 5.尽可能减少类似物产量 6.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高
如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒 精并放出CO2。
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4
3、工业上的发酵
泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程, 包括：
1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。 2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、
氨基酸、酶制剂等。
产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶 等。
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效地合成产物
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（1）自然选育
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌 株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负 突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利， 这种突变成为正突变。
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（二）放线菌
产抗生素最多的一类微生物 另外生产B12,酶，甾体转化 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的
发酵工程 (2)
1.发酵工程，是采用现代工程技术手段，利用生物细胞的特定功能生产各种特定的有用物质，或直者接把微生物应用于某些工业生产的一种生物技术体系。这里的“生物细胞”包括微生物细胞和动物、植物细胞及其固定化细胞。
2.初级代谢主要是指把营养物质转化为机体结构和生理活性物质以及提供能量的代谢作用。
3.初级代谢产物是通过初级代谢途径产生微生物生长所必需的代谢产物。
4.次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，对微生物本身无明显生理作用或对自身生长非必须，但对产生菌的生长可能有一定价值。
5.基因工程育种是用人工方法取得或合成的供体DNA基因在体外重组于载体（病毒、细菌质粒或其他）DNA 上，将目的基因转移至受体细胞并使其在受体细胞系统内进行复制、转录和翻译，表达出供体基因原有遗传性状的方法。
6.菌种复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能稳定或逐步提高。实质是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。
7.葡萄糖效应：过多的葡萄糖加速菌体的呼吸，使培养基中氧不能满足需要，导致一些中间代谢产物（丙酮酸、乳酸、乙酸等）积累在培养基中而使pH下降，影响酶活性而抑制微生物生长和产物的合成的现象。
8.生长因子：一类微生物维持正常生活不可缺少，但细胞自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的微量有机化合物。
9.分批灭菌：每批培养基全部流入发酵罐后，在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到发酵要求温度工艺过程，又称实罐灭菌（实消，原因：对发酵罐灭菌时,罐里有培养基）。
发酵工程02第二章 发酵菌种选育
菌种筛选主要步骤
• 调查研究及查阅充分的资料 ↓
设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境
采样 ↓确定特定的增殖条件
增殖培养 ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓定性或半定量快速检出法
平板分离 ↓
• 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选
↓ 初筛（1株1瓶）
↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶）
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
• 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
• 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
• 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
三、新种分离与筛选的步骤
的引入。 • (2)希望基因型的选出。 • (3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产
规模)。
选择育种方法时综合考虑的因素
(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批 式或连续发酵试验)； (2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的 明了程度； (3)经济费用。 • 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少， 则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术： • 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的 认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。
发酵工程复习
第一章总论
发酵工程：就是研究利用生物的新陈代谢作用生产一定的产品或达到其他社会目的的工程科学。
发酵过程的特点：①一般操作条件比较温和；②以淀粉、糖蜜等为主，辅以有、无机氮源为原料；③过程反应以生命体的自动调节方式进行；能合成复杂的化合物如酶、光学活性体等；能进行一些特殊反应，如官能团导入；④发酵工业与其他工业相比，相对投资较少，见效较快，具有经济和效能的统一性。
发酵过程的分类：①按获取能量的方式分为好氧发酵、厌氧发酵；②按发酵原料可分为糖质原料发酵、烃类原料发酵；③按产物类型可分为初级代谢产物发酵、次级代谢产物发酵；④按发酵状态分为固态发酵、液态发酵、液体表面发酵、液体深层发酵；⑤按发酵工艺类型分为批式发酵（分批发酵）、半连续发酵。连续发酵等。
发酵工业生产流程：①发酵原料的预处理；②培养基配制；③发酵培养基的配制与灭菌；④无菌空气制备；⑤微生物菌种制备和扩大培养；⑥发酵；⑦发酵产品的分离和纯化。
发酵工业的历史渊源：（1）天然发酵阶段，1857年巴斯德证明发酵是由于微生物的作用，彻底否定了自然发生说，证实发酵由微生物引起，免疫学—预防接种。（2）纯培养技术的建立，科赫，德国细菌学家对病原菌的研究做出了卓越的贡献，成为细菌学奠基人之一。科赫发明了固体培养基和把混合培养物纯化的技术，并用在固体培养基上划线接种的方法获得了单一的纯种。这种技术使细菌学发生革命性的变化，在1892－1900年之间，几乎所有细菌疾病的病原体都被分离出来。（3）通气搅拌发酵技术的建立，1929年，英国科学家弗莱明发现青霉素；1940年，英国科学家弗洛里和前恩分离出青霉素；1942年，青霉素工业化生产；1944年，世界第二个抗生素-链霉素诞生。开拓了以青霉素为先锋的庞大的抗生素发酵工业；建立了深层培养法，把通气搅拌技术引入发酵工业。（4）代谢控制发酵和现代发酵工程技术的发展，使用诱导物；诱变菌株；降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；解除反馈抑制-筛选抗反馈抑制突变。
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平 板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌 落即为嘌呤产生菌
抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选
据工估具计菌，采筛用选抗1生万素个的菌敏株感才菌能得到1株有用的抗生素 产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十
分重要。
抑菌圈法是常用的初筛方法
➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况 下进行。
5、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一）
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。
分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法
生长圈法
抑菌圈法
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
➢ 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。
控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 高如温分下离培真养菌可可将在土嗜豆热培微养生基物中加和入非链嗜霉热素微； 生物分开； ➢性控质需制，注分p从H离意可而细，分菌改所或离变需放嗜选菌线酸择菌型或压可生嗜在力长培碱。的养微结基生中果物加有；入时制会霉改菌素变等培养基的 ➢高重糖复或移高植盐几培次养后基接可种分少离量耐已高富渗集透的压培微养生物物到；固体培 养基上。
抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选
据工估具计菌，采筛用选抗1生万素个的菌敏株感才菌能得到1株有用的抗生素 产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十
分重要。
抑菌圈法是常用的初筛方法
➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况 下进行。
5、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一）
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。
分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法
生长圈法
抑菌圈法
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
➢ 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。
控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 高如温分下离培真养菌可可将在土嗜豆热培微养生基物中加和入非链嗜霉热素微； 生物分开； ➢性控质需制，注分p从H离意可而细，分菌改所或离变需放嗜选菌线酸择菌型或压可生嗜在力长培碱。的养微结基生中果物加有；入时制会霉改菌素变等培养基的 ➢高重糖复或移高植盐几培次养后基接可种分少离量耐已高富渗集透的压培微养生物物到；固体培 养基上。
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芽殖酵母
在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其 作用相当于原核的模式生物大肠杆菌
2001年诺贝尔生理学或医学奖
Leland H. Hartwell
首次将酵母作为模式生物进 行研究，是酵母基因学的奠 基人
在研究细胞周期的关键分子 调节机制领域作出了突出贡 献
用于制作面包和馒头等食品及酿酒
一、工业发酵常见微生物种类(熟悉)
➢ 细菌 ➢ 酵母菌 ➢ 霉菌 ➢ 放线菌
1. 细菌
（1）细菌的形态
球菌 杆菌 螺旋菌
双球菌
四联球菌
链球菌
葡萄球菌
细菌的特殊形态
（2）细菌的结构
（3）细菌的繁殖方式 以二分裂方式为主
细胞伸长 DNA复制 形成隔膜 子细胞分离
（4）工业上常用的细菌
醋酸杆菌（Acetobacter）
第二章 发酵工业微生物菌种
制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
三个决定要素
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种 第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离 第三节 微生物菌种的选育 第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
假单孢菌（Pseudomonas）
乳酸菌 大肠杆菌
模式生物
枯草芽胞杆菌
梭状芽孢杆菌
棒杆菌、短杆菌
大肠杆菌革兰氏染色
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
2. 酵母菌
酵母菌（yeast）：一类单细胞真菌的通俗名称， 无分类学意义。 特点： ➢ 个体一般以单细胞存在 ➢ 能发酵糖类，产能 ➢ 喜在含糖量高、酸度较大
知识拓展：常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙Fra Baidu bibliotek氏菌
生长迅速、蛋白产量高;
表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(二) 真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方 法是必要的。
一、微生物样品的采集
人体农菌人消田落体化上数微系层与生统15空态中cm气中微处清微生微洁生物生度物群物的体的关含数(系个量量/g)
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
生产单细胞蛋白 毕赤酵母表达系统
Pichia 能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
3. 霉菌
霉菌属真核多细胞生物，又称丝状真菌，广泛的 分布于土壤、空气、水和生物体内，喜欢潮湿偏 酸环境。
霉菌（mould，mold）：不是分类学上的名词， 是丝状真菌的一个俗称，意即“会引起物品霉变 的真菌”，通常指那些菌丝体较发达又不产生大 型肉质子实体结构的真菌。
种类：分属于真菌界的藻状菌纲、子囊菌纲、 半知菌类。
✓ 菌落大、质地疏松、干燥、不透明、蛛网状、 绒毛状等，不易挑取。
✓ 菌落正面和反面颜色不一致：鉴定的显著特征。
4. 放线菌
呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖和陆生性较强的 原核生物。
发酵工业中常用的放线菌
发酵工业中常用的放线菌主要用于生产抗生素 链霉菌属 土霉素：龟裂链霉菌 四环素：金霉素链霉菌 链霉素：灰色链霉菌 红霉素：红霉素链霉菌
➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生
物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物 中，发现了三种有潜力的新抗生素。
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
菌种分离与筛选的一般过程
样品采集 → 增殖培养 → 纯种分离→ 生产性能测定
目的：高效地获取高产目的产物的微生物？ 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大？