第五章体外分析技术

标准曲线
得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线， 这是可逆反应的质量作用定律决定的。函 数式见上图
根据放射免疫分析法的基本原理，建立放 射免疫分析必须具备以下技术条件：
1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式
二、基本方法
2、准确度（accuracy）是指测定值与真 值的接近程度，用回收率来评价，回收 率是反应测定值偏差的质控指标。
3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与 零剂量区分的最小检测量。
累计10次测定结果，计算出零标准 管的结合率为X—2SD时对应的剂量值， 即为灵敏度。
4、特异性（specificity）是指该反应体 系不受干扰物质物质影响的程度。常用 的指标是交叉反应率。
（三）实验室内部质量控制
实验室内部质量控制侧重对检测质量 的控制，它保证从收集样本开始到发 出报告为止的全过程中，能及时发现 检测过程中出现的各种误差，分析产 生的原因，找出纠正的办法，以确保 检测的质量。
常用以下指标对检测结果做可靠性评 价：精密度、准确度、特异性、灵敏 度、稳定性、有效性
1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。
同上
血浆皮质醇 RIA
判断肾上腺皮质\垂体功能.Cushing
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
午夜: 20~ 80μg/l 妊娠、服用避孕药等增高，肾上腺
胰岛激素
皮质功能减退时减低
胰岛素 放免 4~16.8mU/l
升高时有利于糖尿病分型诊断
C肽
放免 0.8~4. 0μg/l 糖尿病分型\治疗\判断预后
2）高特异性
抗体必须与反应系统中抗原以外的 物质尤其是抗原类似物结合得少， 以免影响分析结果
抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越 高
3）高滴度
滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质
的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释
RIA和IRMA低剂量区的不确定因素 示意图
IRMA的标准曲线
IRMA的特点
1、属于非竞争性抗原抗体结合反 应；
2、抗原抗体复合物的与抗原的量 正相关
3、在低剂量区不会有不确定因素 4、IRMA的非特异性结合对低剂量
区的影响大
二、基本方法
1、双抗体夹心法 2、标记第三抗体法 3、生物素-亲和素系统的应用
FT4 放免 8.2-26pmol/l 同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
定义与分类
一、体外放射分析技术：在体外实验条件下，以 特异性结合反应为生物学基础，以结合反应动 力学规律为共同方法学基础，利用核射线对体 内的各种生物活性物质进行体外定量分析的各 种方法。
二、分类： 1、竞争性体外放射分析法（如RIA） 2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA） 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射性标记
3、抗体
在放射免疫分析中，抗体质量的好 坏是影响放射免疫分析的关键因素 之一。
高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度
1）高亲和力
只有高亲和力的抗体才能得到斜率 高的标准曲线，而斜率高的标准曲 线是高灵敏度和高精密度的必备条 件。亲和力测定方法最常用的是 Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大）， 抗体的亲和力越大方法的灵敏度和 精密度越高
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
反应式
具体方法
用一系列浓度已知的标准抗原（浓度递 增的标准品）在严格相同的条件下与一定量 的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平 衡后，分离B与F，测定B的放射性做为纵坐 标，以每一反应管的标准品浓度为横坐标， 绘成标准曲线。根据被测抗原试管中的B的 CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓度
函数式
第二节 免疫放射分析
immunoradiometric assay , IRMA
免疫放射分析技术是1968年由 Miles和Hales创立的，IRMA是 非竞争性体外放射分析技术的代 表。
一、基本原理
用放射性核素标记抗体作示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗 体，抗原与标记抗体进行全量反 应，多余的抗体用一定的手段除 去，测定复合物的放射性，其活 度与待测抗原量正相关。
3）高度纯化，不含有影响分析的杂质；
4）对标准品的定量一定要精确
2、标记抗原
标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是：
1）比活度和放射化学纯度必须足够 高——以保证分析的灵敏度
标记抗原的放化纯必须不小于95%
2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记抗原的应有较高的稳定性
免疫分析技术（酶、化学发光、时间分辨荧光 分析）
第一节 放射免疫分析法 radioimmunoassay， RIA
1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
磷酸酯酶
可作前列腺癌疗效监测.
血β2微球 放免，<2300μg/l 多发性骨髓瘤\肝胃结肠癌\白血病时
糖类抗原 放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗
CA-50
效观察
CA-199 放免<37U/ml 胰腺癌\胆管癌阳性检出率高,结肠癌\胃
癌\肝癌等辅助诊断和疗效随访.
CA-242 放免<25U/ml 胰腺癌\肝癌诊断,高特异
CA-125 放免<35U/ml 妇科肿瘤的诊断与鉴别诊断有重要价值
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
5、稳定性（stability）是指测定试剂在 合理保存和正确使用条件下，在规定的 有效期内，保持其全部原有性能不变的 能力。常用指标有：零标准管结合率 （B0%≥20%）、非特异性结合率 （NSB%≤5%）、标准曲线上的质控指 标等。
6、有效性（effectivity）主要指临床诊 断符合率及临床使用评价，检测结果在 正常和异常之间有良好的区分，得出可 信的结论。
胰高血糖素 放免 11~37pmol/l 糖尿病\急性低血糖时升高,胰高血
糖素瘤时显著升高.
胰岛素抗体 放免 阳性:>5% IDDM早期诊断,胰岛素治疗糖尿病
的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素 放免 1.8~8.4μg/l 判断骨代谢\骨质疏松情况,了解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
升高，肿瘤骨髓、肝、脾转移时显著增加
前列腺特 放免，<2.6μg/l 前列腺癌\前列腺肥大\前列腺炎诊
异抗原
断及疗效观察.前列腺癌时显著升高,肥大时轻度升高.
CEA 放免，<20μg/l
结肠\直肠\胃\肺\乳腺恶性肿瘤时动态
升高,对肿瘤诊断\复发\预后判断\疗效观察有意义.
AFP 放免，<25μg/l
促甲状腺素 放免法43±25pg/ml 释放激素
鉴别原发和继发性 甲低
甲状旁腺素 放免 <70.5pmol/l
甲状旁腺病,判断骨代谢.
慢性肾衰\甲旁亢\甲旁腺瘤时增高,
甲旁减\高钙尿症时减低
肿瘤标志物
铁蛋白
放免 ,男25~264μg/l 女25~264μg/l
缺铁性贫血,辅助诊断再障\急 慢性白血病\恶性淋巴瘤\多发 性骨髓瘤。原发性肝癌部分
（二）误差的来源
1、系统误差：这种误差表现为检测结 果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可 以确定的因素导致，如：量器不准、试 剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态 不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟 合模型等等，系统误差是通过努力可以 消除的。
2、随机误差：这种误差多由难以确定 且无法控制的原因引起，误差的出现是 随机的，由各种偶然因素造成，符合正 态分布，如量取液体或分离时的误差。
1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接
（三）数据处理
1、logit-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型 U={（A-D）/[1+（X/C）B]}+D 其中U为各试验管结合率（含NSB） A、B、C、 D分别为0剂量时的结合率， logit-log函数的斜 率，各点实际结合率下降一半时X的量，NSB。
（一）基本试剂
放射免疫分析反应需要三种基本试剂： 1、标准品（非标记标准抗原） 2、标记抗原 3、抗体
1、标准品
标准品是样品定量的基础，它的
质和量的变化直ห้องสมุดไป่ตู้影响待测样品的测
定值。
对标准品的要求如下：
1）标准品和待测样品应属于同一种物质；
2）在与抗体反应时，标准品和待测样品 应有相同的活性和亲和能力；
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
化恶变时显著升高,可鉴别慢性活动性与迁延性肝炎
层粘连蛋白 放免 <120μg/l 同上
III型胶原 放免 <120μg/l 同上
诊断原发性肝癌.急慢性活动性肝炎\
胎儿畸形也可升高.可作肝癌手术和
化疗后预后观察.
NSE 放免，<15μg/l
小细胞未分化肺癌\脑神经母细胞瘤\神
经内分泌肿瘤\脑损伤
降钙素 放免，<29.3pmol/l 甲状腺隋样瘤,早期诊断小细胞肺癌,甲
亢时异常升高,判断肾功能\钙磷代谢.
前列腺酸性 放免，<4μg/l 前列腺癌时明显升高,肥大时轻度升高,
一、基本原理
竞争性抑制 被测量的微量物质Ag（未标记抗原）
和标记有放射性核素的该种物质*Ag(标记抗原)对其抗 体Ab有相同的结合能力，反应时， Ag和 一定量的 *Ag竞争有限量的Ab。生成的*AgAb的量随Ag的增加 而减少，呈负相关关系。
反应达到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B 、F或B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系 求出待测抗原的的浓度。
度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
（二）分离技术
1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术：
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
球蛋白
甲状腺炎/甲亢,尤其监测甲癌
复发
反T3 放免 0.5-1.2nmol/l 诊断甲状腺疾病,对非甲状腺
疾病严重程度的判断\预后\疗效观察均有重要意
义,甲减替代治疗观察
TSH受体 放射受体<9U/l 甲亢\甲亢预后,甲亢ATD停
抗体
药指标.判断甲亢有无复发.
RIA和IRMA的区别
体外分析常用检查项目
项目 方法及正常值
临床意义
T3 放免 1.0-3.2nmol/l 判断甲状腺功能及肾病\肝病\
糖尿病\肿瘤心肌梗死等引起的低T3T4综合征
T4 放免 70-180nmol/l 同上
FT3 放免 3.2-9.2pmol/l 同上，判断甲亢复发及妊娠
时甲状腺功能